本发明涉及基因工程
技术领域：
：，具体涉及一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法。
背景技术：
：：在植物转基因研究中，通常是将目标基因(GeneofInterest,GOI)与位于同一载体的选择标记基因(SelectableMarkerGene,SMG)，一起转入植物细胞，通过对SMG的筛选获得含有GOI的转化细胞。该转化细胞再生形成植物，通过进一步对GOI的确认，从而获得需要的转基因植株。这种转基因植物就带有SMG，通常是耐抗生素或除草剂抗性基因，如卡那霉素抗性基因(nptII基因)、潮霉素抗性基因(hpt基因)或除草剂抗性基因(bar基因)。SMG不仅对农作物生长没有任何必要，往往也可能会对细胞的发育和分化产生负面的影响；而且当一个转基因植物中已含有一个SMG，在导入第二个GOI时，要选用不同的SMG，而实际中往往需要转入多个基因来改良农作物性状，但能够被运用的SMG数量是有限的，因此，存在于转基因植株基因组中的SMG对多个GOI导入造成困难。况且，SMG在收获的农产品中的残留，也有可能对人畜等食物链下游生物产生不良影响，特别是对人体健康可能存在着潜在危害，是普通大众担忧转基因食品安全的重要因素；此外，带有SMG的转基因作物在田间的大量种植，这些基因转移到其它生物中的可能性也是存在的，从而会对整个生态环境产生极其严重的后果。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因(hygromycinphosphotransferase,hpt)的方法。将转基因植物中潮霉素抗性基因敲除，在转基因领域为转入多个目标基因提供条件，并且也使得转基因植物在农业上应用更加安全。本发明通过下述技术方案实现：一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，包括：1)基于CRISPR/Cas9技术原理，依据潮霉素抗性基因DNA序列SEQNo.1确定sgRNA目标序列，潮霉素抗性基因DNA序列编码的蛋白质氨基酸序列SEQNo.2所示；依据上述步骤确定的目标序列设计出相应的PCR引物，并采用重叠延伸PCR方法构建sgRNA表达盒，转录sgRNA的启动子的选择及编辑载体的选择依植物确定；2)将上述步骤1)得到的sgRNA表达盒连接到基因编辑载体，编辑载体的选择依植物确定；3)将上述步骤2)获得的载体质粒转入农杆菌中；4)采用农杆菌介导的方法转化植株，通过植株的杂交或/和自交后筛选获得潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的外源DNA的植株。其中一种途径：用上述步骤4)中采用农杆菌介导的方法转化野生型植株，通过植株的杂交和自交后筛选出植株的方法为：采用农杆菌转化植株的方法，将编辑潮霉素抗性基因的DNA片段转入野生型植株，筛选出纯合、并有效表达Cas基因及sgRNA的转基因植株；将得到的编辑Cas基因及sgRNA的植株与含有潮霉素抗性基因的植株进行杂交，CRISPR/Cas9系统在杂交植株中对潮霉素抗性基因的DNA进行编辑剪切，通过分子手段检测这些杂交植物的后代，找到潮霉素抗性基因缺失的杂交种F1；F1代自交获得F2代植株，通过分子手段检测F2代植株，筛选得到潮霉素抗性基因缺失、并不含有转入的CRISPR/Cas9系统的植株。该植株即为敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的植株。本发明基于CRISPR/Cas9技术原理，本发明的方法适用于所有植物中外来潮霉素抗性基因的敲除，尤其适用于水稻。本发明能有效敲除转基因植物中的潮霉素抗性基因，避免转基因植物带有选择标记基因，导致下个目标基因导入的困难，并有效消除转基因植物对人体健康可能存在着的潜在危害以及对生态环境造成不良后果的潜在风险，为转基因植物在农业上应用扫清障碍。进一步，所述sgRNA表达盒的构建方法包括：首先，依据潮霉素基因DNA序列设计一个或多个sgRNA目标序列；然后，根据sgRNA目标序列设计出sgRNA表达盒的重叠延伸PCR引物；最后，采用重叠延伸PCR扩增得到sgRNA的DNA片段。优选地，所述sgRNA目标序列为：sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’，sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’；将依上述两种sgRNA目标序列构建的两个sgRNA表达盒与编辑载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-B连接，即得到编辑载体质粒PMF117。进一步，所述编辑潮霉素抗性基因的载体转入农杆菌的过程为：首先，制备农杆菌感受态细胞；其次，将载体质粒加入到农杆菌感受态细胞中混匀，混匀后通过两次以及两次以上的冷冻—解冻后，加入到培养基中培养后，获得带有载体质粒的农杆菌。进一步，所述表达载体质粒的农杆菌转化植株的过程为：首先，诱导培养植株的愈伤组织；将转入表达载体的农杆菌在浸染培养基中进行培育，菌液浓度控制在OD550＝0.06-0.08；其次，将转入载体质粒的农杆菌浸染愈伤组织，浸染后将愈伤组织取出，在共培养基上培育；最后，通过共培养基上培育的愈伤组织转入到筛选培养基中进行筛选，获得旺盛抗性愈伤组织，将旺盛抗性愈伤组织在再生培养基中分化形成再生植株，再生植株中经分子检测筛选出能编辑潮霉素抗性基因的转基因植株。进一步，编辑潮霉素抗性基因的转基因植株与含有潮霉素抗性基因的植株进行杂交，得到F1植株。进一步，采用F1代植株筛选出发生潮霉素抗性基因敲除植株的过程为：F1代植株萌发后分单株取幼叶提取总DNA，以该DNA为模板，用潮霉素抗性基因特异引物F-HPTII-542和启动子引物R-35S-P进行PCR扩增，PCR片段测序即能筛选出发生潮霉素抗性基因敲除的植株。进一步，采用F2代植株筛选出发生潮霉素抗性基因敲除植株的过程为：F1代植株自交后得到F2代植株，提取F2代植株的DNA，以该DNA为模板，用潮霉素抗性基因特异引物F-HPTII-542和启动子引物R-35S-P进行PCR扩增，PCR片段克隆到载体ZT4-blunt，选取阳性克隆进行DNA测序，发生DNA缺失、不能翻译出潮霉素抗性蛋白的植株，即为发生潮霉素抗性基因敲除的候选植株；候选植株再采用Cas基因特异引物F-Lcas9-RT、R-Lcas9-RT，和Bar基因特异引物F-Barr、R-Barr，分别对其DNA进行PCR扩增，检测为阴性时即是发生潮霉素抗性基因敲除的植株。另一途径，用上述步骤4)中采用农杆菌介导的方法转化含有潮霉素抗性基因的植株，通过植株的自交后筛选出植株的方法为：载体质粒农杆菌直接转化含有潮霉素抗性基因的植株，在转化的阳性植株自交得到第二代植株，提取二代植株DNA，以该DNA为模板，用潮霉素抗性基因特异引物F-HPTII-542和启动子引物R-35S-P进行PCR扩增，PCR片段克隆到载体ZT4-blunt，选取阳性克隆进行DNA测序，发生DNA缺失、不能翻译出潮霉素抗性蛋白的植株，即为发生潮霉素抗性基因敲除的候选植株；候选植株再采用Cas基因特异引物F-Lcas9-RT、R-Lcas9-RT，和Bar基因特异引物F-Barr、R-Barr，分别对其DNA进行PCR扩增，检测为阴性时即是发生潮霉素抗性基因敲除的植株。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本发明采用CRISPR/Cas9技术原理，能有效敲除植株中的潮霉素抗性基因。2、本发明的方法为普遍适应方法，适用于所有植物中外来潮霉素抗性基因的敲除。3、本发明操作相对现有技术而言更加简便有效，操作成本更低，非常适合推广应用。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明实施方案的技术路线示意图；图2为实施例转化水稻的编辑潮霉素抗性基因的载体质粒示意图；图3为实施例编辑潮霉素抗性基因载体转入水稻的Bar标记基因PCR检测图；其中，M：DNA分子量的参照；P：正对照；N：非转基因负对照；1、2、3、4和5分别是5株转基因植株；图4为实施例编辑潮霉素抗性基因载体转入水稻的Cas基因PCR检测图；其中，M：DNA分子量的参照；P：正对照；N：非转基因负对照；1、2、3、4、5和6分别是6株转基因植株；图5编辑潮霉素抗性基因载体转入水稻的Cas基因表达的PCR检测图；其中，1、2、3、4、5、6和7分别是7株Cas9基因的表达，N是非转基因对照。上面一行是Cas9基因的表达，下面一行是相应水稻18SrRNA基因作为参考基因的表达；图6为实施例敲除了潮霉素抗性基因DNA在sgRNA-1目标序列位点的变异情形；其中，第一行是原潮霉素抗性基因的DNA序列，之下是来自不同植株编辑突变的潮霉素抗性基因的DNA序列；图7为实施例敲除了潮霉素抗性基因DNA在sgRNA-2目标序列位点的变异情形；其中，第一行是原潮霉素抗性基因的DNA序列，之下是来自不同植株编辑突变的潮霉素抗性基因的DNA序列。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，包括：1)、sgRNA表达盒的构建第一步，据拟敲出的潮霉素抗性基因DNA序列，确定sgRNA目标序列，潮霉素抗性基因DNA序列如SEQNo.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQNo.2所示。sgRNA可以是一个，也可以是多个，本实施例设计了两个sgRNA的目标序列，具体sgRNA的目标序列设置如下：sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’；sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’。第二步，PCR引物设计：根据第一步选定的两个sgRNA目标序列，按下述表1合成重叠延伸PCR(OverlapPCR)的引物，按下述表2合成构建sgRNA表达盒的引物。表1.含靶位点DNA序列的重叠延伸PCR的引物表2.构建sgRNA表达盒的通用引物注：ggtctc为BsaI识别位点；ACTAGT为SpeI酶切位点；ACGCGT为MluI酶切位点。第三步，重叠延伸PCR扩增构建上述两个sgRNA表达盒。本发明中与sgRNA-1的目标序列对应的sgRNA表达盒构建方法如下：①OsU6a+gRNA-1表达盒，其sgRNA目标序列为：CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG。第一轮PCR扩增：以U-F+OsU6aHy-1，gRHy-1+gR-R分别为引物，以pYLgRNA-OsU6a(华南农业大学刘耀光教授惠赠，GenBank登录号：KR029105)质粒为模板，分别扩增获得片段1和2。第二轮PCR扩增：以第一轮扩增回收的1和2产物混合作为模板，以Pps-GGL和Pps-GG2-1为引物，PCR获得带BsaI+SpeI酶切位点的DNA片段，该片段经BsaI酶切后得第一个表达盒OsU6a+gRNA-1，如下：本发明中与sgRNA-2的目标序列对应的sgRNA表达盒构建方法如下：②OsU3+gRNA-2表达盒，其sgRNA-2目标序列为：ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG。第一轮PCR扩增，以U-F+OsU3Hy-2，gRHy-2+gR-R分别为引物，以pYLgRNA-OsU3(华南农业大学刘耀光教授惠赠，GenBank登录号：KR029103)质粒为模板，分别扩增获得片段3和4。第二轮PCR扩增：以第一轮扩增回收的3和4产物混合作为模板，以Pps-GG2-2和Pgs-GGR为引物，扩增获得带BsaI酶切位点的DNA片段。该片段经BsaI酶切后得到第二个表达盒OsU3+gRNA-2如下：2)、sgRNA表达盒克隆到编辑载体质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B(华南农业大学刘耀光教授惠赠，GenBank登录号：KR029110)经BsaI酶切回收载体大片段，与上一步构建的两个表达盒OsU6a+gRNA-1、OsU3+gRNA-2连接，最终获得编辑HptII的表达载体质粒，命名为PMF117，如图2所示。3)、表达载体的农杆菌转化3.1)农杆菌感受态细胞的制备取-80℃保存农杆菌LBA4404划线于含有50mg/L利福平LB平板，28℃培养2-3天。平板上挑出单菌落接种于50mL含50mg/L利福平液体LB培养，温度28℃，转速150rpm摇床振动培养至OD600＝0.5；农杆菌菌液然后转入无菌50mL离心管离心(4000rpm，4min，4℃)，收集的菌体中加入5mL在冰水上预冷0.15MNaCl，轻微震荡悬浮细菌细胞，然后再离心沉淀细菌(4000rpm，4min，4℃),菌体中再次加入0.15MNaCl悬浮细胞，再离心收集菌体(4000rpm，4min，4℃)；最后，加入2mL在冰水上预冷20mmol/LCaCl2溶液悬浮细菌细胞，放置于冰上，加入终浓度为7％(V/V)DMSO,混匀后分装，每管100μL；加入液氮冷冻后立即冻存于-80℃低温冰箱备用。3.2)转化农杆菌从-80℃低温冰箱取出农杆菌感受态细胞，加入1μg左右的编辑HptII的表达载体质粒DNA，混匀后置于冰水30min；然后液氮冷冻1min，取出后在37℃水浴至解冻，解冻后再次放入液氮冷冻1min，取出后37℃水浴至解冻，置于冰水2min后加入1mLLB培养基，在28℃下振动培养2-3h(摇床转速140rpm)；离心分离菌体，加入100μlLB液体培养基重悬，涂在含100mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素的LB平板上，28℃培养2至3天长出菌落；接种单个菌落于含有100mg/L卡那霉素的液体LB，在28℃下140rpm摇床振动培养16h，取2μL菌液进行PCR验证，阳性克隆在-80℃保存备用。4)、转入表达载体质粒的农杆菌转化水稻：4.1)，水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养：水稻成熟种子去壳，在70％乙醇浸泡30秒，然后在0.1％升汞中浸泡10min，无菌水冲洗7-8次，种子取出放在培养皿的无菌滤纸上吸干水分，接种到愈伤组织的诱导培养基上，29℃光照培养15天。切取成熟胚盾片长出的愈伤组织，并切成2-4毫米的小块，再转接种到诱导培养基上预培养三天。其中诱导培养基包括：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/LL-脯氨酸+30g/L蔗糖+2mg/L2,4-D+4g/L植物凝胶，pH5.8。4.2)，农杆菌的培养和准备：将含有编辑潮霉素抗性基因载体的农杆菌LBA4404，划线于LB+50mg/L链霉素+100mg/L卡那霉素平板上，19℃黑暗培养三天。用接种环挑取少量农杆菌悬浮于15mL加入100μmol/L乙酰丁香酮的浸染培养基，菌液浓度控制在OD550＝0.06-0.08。此菌液将用于下一步浸染水稻愈伤组织。浸染培养基包括：N6+0.7g/LL-脯氨酸+68.4g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+1.5mg/L2,4-D，pH5.2。4.3)，农杆菌浸染与共培养：将上述预培养的水稻愈伤组织转入50mL的离心管中，然后加入15mL浸染培养基+100μmol/L乙酰丁香酮，震荡清洗后去除液体，然后将上述准备好的15mL农杆菌悬浮液倒入，轻轻摇3min，倒掉菌液。将愈伤组织取出，放入培养皿的无菌滤纸上吸去多余菌液，随将愈伤组织转入共培养基，19℃黑暗培养三天。共培养基包括：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/LL-脯氨酸+30g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+2mg/L2,4-D+100μmol/L乙酰丁香酮+4g/L植物凝胶，pH5.8。4.4)洗菌与抗性愈伤组织的筛选：共培养三天后取出愈伤组织，先用无菌水洗7-8次，再用加有250mg/L羧苄青霉素和10mg/L万古霉素的浸染培养基洗一次，然后愈伤组织转放到培养皿的无菌滤纸上吸去多余的液体，转入加2mg/LBialaphos和250mg/L羧苄基青霉素的筛选培养基。29℃光照培养，14天后继代培养，再筛选1次。筛选培养基包括：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/LL-脯氨酸+30g/L蔗糖+2mg/L2,4-D+4g/L植物凝胶，pH5.8。4.5)抗性愈伤组织的分化：将经两轮筛选后长出的旺盛抗性愈伤组织，转入含有2mg/LBialaphos、100mg/L头孢菌素和150mg/L羧苄青霉素的再生培养基上，在29℃光照下，经14-20天左右的培养，分化出绿色斑点，30天左右进一步分化成小苗。再生培养基包括：MS+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+30g/L山梨醇+2.0mg/L激动素+0.02mg/L奈乙酸+4g/L植物凝胶，pH5.8。4.6)转化植株的壮苗、移栽：当分化的芽长至约2-4cm时，将其转移至生根培养基，29℃光照培养2-3周。试管苗长到约8厘米左右，打开试管炼苗3-4天，取出小苗用清水洗去植株根系上的培养基，移栽至土壤，温室培养，获得编辑潮霉素抗性基因的植株。生根培养基包括：1/2MS+20g/L蔗糖+0.5mg/L奈乙酸+4g/L植物凝胶，pH5.8。5)、获得转基因水稻植株，该转基因水稻植株即为要敲除潮霉素抗性基因的植株，然后将编辑潮霉素抗性基因的植株与要敲除潮霉素抗性基因的植株进行杂交，杂交F1代种子萌发获得F1代植株，筛选出发生潮霉素抗性基因敲除的植株。5.1)、转基因水稻植株的筛选鉴定5.11)水稻植株总DNA提取：采用CTAB法。CTAB裂解液组成如下：1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，1％(V/V)β-巯基乙醇。具体步骤如下：取水稻植株嫩叶片100mg于1.5mL离心管，在液氮中将其研磨成粉，加入600μL预热(65℃)的CTAB裂解液，涡旋震荡混匀，放入65℃水浴处理1h，取出加入600μL氯仿：异戊醇(24：1)，反复颠倒混匀，然后离心(10000rpm，15min)，取上清于1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰水上放置30min，离心(12000rpm，10min)沉淀DNA，去除上清液再加入1mL75％乙醇洗涤DNA沉淀，移去酒精风干后加入100μLTE溶解DNA，-20℃储存备用。5.12)Bar标记基因PCR检测：用筛选标记基因(除草剂抗性基因，Bar)特异引物F-Barr：5'-GCACCATCGTCAACCACTACAT-3'和R-Barr：5'-CTGCCAGAAACCCACGTCAT-3'进行PCR检测，用提取的DNA为模板扩增，转基因植物可以得到片段大小为400多bp左右除草剂抗性标记基因的DNA片段，非转基因水稻为无法扩增出这个DNA片段，该DNA片段的PCR检测图如图3所示。PCR反应总体积50μL，按厂商说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。5.13)Cas转基因的PCR检测：使用转入基因Cas9的特异引物F-Lcas9-RT和R-Lcas9-RT进行PCR检测，以转化水稻植株的DNA为模板扩增，转基因阳性植物可以得到片段大小约为600bp左右的DNA片段，阴性植物和非转基因水稻为无法扩增出这个DNA片段，该DNA片段的PCR检测图如图4所示。其中，F-Lcas9-RT：5'-GAAGCGGAAGGTTGGTATT-3'R-Lcas9-RT：5'-TTGTCCACGTCGGAGTTAT-3'；PCR反应总体积50μL，按厂商说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。5.14)水稻幼苗的提取RNA：取水稻种子发芽15天的叶片0.1g，采用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。参考厂商使用说明进行操作：①新鲜叶片样品置1.5ml离心管中，立即加入液氮冷冻放于-80℃冰箱保存；②提取时取出离心管，并在冰冻下，将管内叶片样品研磨成细粉，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min；③加入0.2ml氯仿，振荡15sec，静置2min；④4℃离心，12000g，15min，取上清于新的1.5mL离心管中；⑤加入等体积的异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；⑥4℃离心，12000g，10min，弃上清；⑦加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀2-3次；⑧4℃离心，7500g，5min，弃上清；⑨晾干，加入适量的DEPCH2O溶解。5.15)RNA反转录获得cDNA：采用反转录试剂盒(Takara)，cDNA的第一条链的合成采用AMV反转录酶，合成的cDNA的第一条链在-20℃保存。5.16)Cas转基因表达的PCR检测：用Cas基因特异性引物F-Lcas9-RT和R-Lcas9-RT进行PCR检测，阳性转基因植株可以扩增出约600bp的DNA片段，而阴性植株和非转基因水稻是得不到这样的DNA片段的，具体检测结果如图5所示。其中，F-Lcas9-RT：5'-GAAGCGGAAGGTTGGTATT-3'R-Lcas9-RT：5'-TTGTCCACGTCGGAGTTAT-3'；PCR反应总体积50μL，按厂商说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。5.2)敲除潮霉素抗性标记基因5.21)上述获得的编辑潮霉素抗性基因的水稻与要敲除的潮霉素抗性基因的水稻进行杂交，杂交F1代种子萌发，分单株取幼叶提取总DNA，以该DNA为模板，用潮霉素抗性基因特异引物F-HPTII-542和启动子引物R-35S-P进行PCR扩增，PCR测序即可发现，有发生潮霉素抗性基因敲除的植株，如图6和图7所示。其中，潮霉素抗性基因特异引物F-HPTII-542：5’-GTCGTCCATCACAGTTTGCC-3’，启动子引物：R-35S-P：5’-GCACAATCCCACTATCCTTCG-3’。5.22)上述F1代植株自交得到F2代植株，提取这些F2代植株的DNA，以这些DNA为模板，通过PCR方法将潮霉素抗性基因DNA进行扩增，扩增引物包括F-HPTII-542和R-35S-P，扩增的PCR片段克隆到载体ZT4-blunt(庄盟生物)上，选取阳性克隆进行DNA测序，发生DNA缺失、不能翻译出潮霉素抗性蛋白的植株，即为潮霉素抗性基因敲除的候选植株。5.23)上述候选植株再采用Cas基因特异引物F-Lcas9-RT、R-Lcas9-RT和Bar基因特异引物F-Barr、R-Barr，分别对其DNA进行PCR扩增，检测为阴性，表明该植株即是要得到的、敲除了潮霉素抗性基因的植株，且该植株也不含有用于进行编辑潮霉素抗性基因所转入水稻植株的外源DNA。其中，Cas基因特异引物F-Lcas9-RT：5'-GAAGCGGAAGGTTGGTATT-3'Cas基因特异引物R-Lcas9-RT：5'-TTGTCCACGTCGGAGTTAT-3'；Bar基因特异引物F-Barr:5'-GCACCATCGTCAACCACTACAT-3'Bar基因特异引物R-Barr:5'-CTGCCAGAAACCCACGTCAT-3'。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>四川省农业科学院生物技术核技术研究所成都亿农农业科技有限公司<120>一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1026<212>DNA<213>人工序列(1)<400>1atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgac60agcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgat120gtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagat180cgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacatt240ggggagtttagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttg300caagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctacaaccggtcgcggaggctatggat360gcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaagga420atcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtat480cactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgag540ctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggc600tccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcg660atgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggct720tgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgcca780cgactccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgac840ggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccgga900gccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggc960tgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaag1020aaatag1026<210>2<211>341<212>PRT<213>人工序列(1)<400>2MetLysLysProGluLeuThrAlaThrSerValGluLysPheLeuIle151015GluLysPheAspSerValSerAspLeuMetGlnLeuSerGluGlyGlu202530GluSerArgAlaPheSerPheAspValGlyGlyArgGlyTyrValLeu354045ArgValAsnSerCysAlaAspGlyPheTyrLysAspArgTyrValTyr505560ArgHisPheAlaSerAlaAlaLeuProIleProGluValLeuAspIle65707580GlyGluPheSerGluSerLeuThrTyrCysIleSerArgArgAlaGln859095GlyValThrLeuGlnAspLeuProGluThrGluLeuProAlaValLeu100105110GlnProValAlaGluAlaMetAspAlaIleAlaAlaAlaAspLeuSer115120125GlnThrSerGlyPheGlyProPheGlyProGlnGlyIleGlyGlnTyr130135140ThrThrTrpArgAspPheIleCysAlaIleAlaAspProHisValTyr145150155160HisTrpGlnThrValMetAspAspThrValSerAlaSerValAlaGln165170175AlaLeuAspGluLeuMetLeuTrpAlaGluAspCysProGluValArg180185190HisLeuValHisAlaAspPheGlySerAsnAsnValLeuThrAspAsn195200205GlyArgIleThrAlaValIleAspTrpSerGluAlaMetPheGlyAsp210215220SerGlnTyrGluValAlaAsnIlePhePheTrpArgProTrpLeuAla225230235240CysMetGluGlnGlnThrArgTyrPheGluArgArgHisProGluLeu245250255AlaGlySerProArgLeuArgAlaTyrMetLeuArgIleGlyLeuAsp260265270GlnLeuTyrGlnSerLeuValAspGlyAsnPheAspAspAlaAlaTrp275280285AlaGlnGlyArgCysAspAlaIleValArgSerGlyAlaGlyThrVal290295300GlyArgThrGlnIleAlaArgArgSerAlaAlaValTrpThrAspGly305310315320CysValGluValLeuAlaAspSerGlyAsnArgArgProSerThrArg325330335ProArgAlaLysLys340当前第1页1 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