一种环状RNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医学检验领域，涉及一种用于诊断cteph的环状rna标志物及其特异性引物，还涉及所述标志物在诊断cteph中的应用以及相关的试剂盒。
背景技术：
：慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolicpulmonaryhypertension，cteph)是以呼吸困难、乏力和活动耐力减低为主要表现的一种疾病，主要由于肺动脉血栓栓塞反复发作、不能溶解，进而导致肺血管重构，肺血管阻力进行性升高、肺动脉高压及右心功能不全。cteph是一种严重威胁人类生命的疾病，但经过规范化治疗的患者其预后可得到明显改善，因此为了取得更好的治疗效果，应该做到疾病的早诊断、早治疗。目前迫切需要寻找到一个敏感性好、特异性强、易于测量、稳定不受其他可变生物因素影响的用于cteph的诊断生物标志物。全血、血清或血浆是最广泛使用的临床途径样品源，寻找到提供早期诊断信息的临床生物标记物，可极大地帮助诊断和处理疾病，为该病的临床早期诊断、疾病分型、严重程度判断等提供有效依据，进而为精准治疗以及新药研发提供依据。环状rna(circularrna，circrna)呈闭合环状，是一类不具有5'末端帽子和3'末端尾巴的特殊内源性非编码rna，主要由外显子转录产物组成，少数来源于内含子或内含子片段，是目前rna研究领域的新热点。circrna存在于多种真核生物中,在同种生物的不同组织中也广泛存在；多数circrna具有高度保守序列，仅有少数在进化上不保守；大多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核内。而且，部分circrna具有mirnasponge功能，与mirna相互作用，调控靶基因的表达；大多数circrna能在转录或转录后水平发挥调控作用，少数能在转录水平发挥作用。前人的一些研究发现,circrna在动脉粥硬化、神经系统紊乱、阮病毒疾病、糖尿病、肿瘤和癌症等疾病发生过程中发挥着重要的作用。因此，对circrna进行研究具有重要的临床意义。circrna的组织特异性和稳定性有可能使circrna成为良好的生物标记物。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性强、易于测量、稳定不受其他可变生物因素影响的用于cteph诊断的生物标志物。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的诊断cteph的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：在对cteph疾病进行研究的过程中，发现了一种用于cteph诊断的环状rna标志物，所述标志物为hsa-circ-0046159；其在基因组上的定位为chr:chr17；start(hg19):79523912；end(hg19):79575848；genomiclength:51936,splicedseqlength:3764；其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明还提供了上述环状rna标志物在制备用于诊断cteph疾病的产品中的用途。在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了一组寡核苷酸，其是由序列表seqidno.2至序列表seqidno.4所述碱基序列的寡核苷酸组成；其中seqidno.2和seqidno.3分别为hsa-circ-0046159的正向引物和反向引物，seqidno.4为hsa-circ-0046159的探针。在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了上述寡核苷酸在制备用于诊断cteph疾病的产品中的用途。在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了一种诊断cteph疾病的试剂盒，包括用于测定hsa-circ-0046159标志物的试剂；其中，所述试剂包括检测hsa-circ-0046159的特异性引物及探针，其中，hsa-circ-0046159正向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示；hsa-circ-0046159探针的核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明相对于现有技术具有如下优点：(1)血液中circrnas是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创且定量精确，有组织特异性和良好的稳定性，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子rna生物标志物的成功开发有助于慢性血栓栓塞性肺动脉高压的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)通过检测血液来源的circrnas的表达来诊断人类慢性血栓栓塞性肺动脉高压是否发生的试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的辅助诊断，有助于反映慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的治疗方案提供支持；(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用circrna芯片对circrna进行分析，且应用qpcr的方法扩大样本进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血液中circrnas生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。附图说明图1为qpcr验证外周血hsa-circ-0046159的表达情况；图2为cerna预测结果网络图；具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。实施例1引物和探针设计根据hsa-circ-0046159的序列，设计引物和探针序列。具体序列如下：hsa-circ-0046159的正向引物：ctcctgcttcggctctgthsa-circ-0046159的反向引物：ggatgtaggcgtggaagghsa-circ-0046159的探针：aagcgcctgaagcaaccattcgatgaggac上述引物由“金唯智生物科技有限公司”合成；探针由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。实施例2totalrna提取1.每0.25ml全血样品加入0.75ml裂解液rls，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5～10×106个细胞至少加入0.75ml裂解液rls。裂解液rls和液体样品的终体积比总是3：1。2.将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。3.可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的rnasefree的离心管中。4.每1ml裂解液rls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。5.于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。6.加入1倍体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇！)，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。7.10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。8.加500μl去蛋白液re，12000rpm离心45秒，弃掉废液。9.加入700μl漂洗液rw(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心60秒，弃掉废液。10.加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心60秒，弃掉废液。11.将吸附柱ra放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。12.取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μlrnasefreewater(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μlrnasefreewater，离心1分钟，合并两次洗脱液。。实施例3样品rna荧光标记1.反转录合成firststrandcdna以totalrna起始，含有t7启动子序列的t7randomprimer为引物，使用firststrandenzymemix合成firststrandcdna。反应过程具体如下：1.1取totalrna200-500ng，加入到0.2ml无核酸酶的离心管中。1.2根据下表加入相应体积的agilentspike-in。表1spike-in体积对应表1.3将配制好的反转录mastermix(见表2，单个反应体系用量)轻轻混匀，短暂离心放在冰浴上。取5μlmastermix分别转移至含有totalrna样品的0.2ml离心管中。表2反转录mastermix组分组分名称体积firststrandbuffermix4μlfirststrandenzymemix1μl1.4轻轻混匀溶液，瞬时离心后42℃反应2小时。反应结束后短暂离心并冰浴。立即进行后续操作步骤。其中，t7randomprimer是由生工生物工程股份有限公司合成的。t7randomprimer的序列：aaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactataggcgcttttttttttttttttvn(v可以是g,a,c)firststrandenzymemix来自于ambion厂家生产的ambionwtexpressionkit,30rxn试剂盒。2.合成secondstranddna：用secondstrandenzymemix将dna-rna杂合体中的rna链转化为secondstrandcdna，合成双链dna。反应过程具体如下：2.1配制secondstrandmastermix(见表3，单个反应体系用量)，将其轻轻混匀，短暂离心后冰浴。在上述步骤1.4所得的每个样品管中加入20μl的secondstrandmastermix。表3secondstrandmastermix组分表其中，secondstrandenzymemix来自于ambion厂家生产的ambionwtexpressionkit,30rxn试剂盒。2.2轻柔混匀，16℃反应1小时,65℃10min。2.3反应结束后将反应管置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。3.体外转录合成crna以secondstrandcdna为模板，利用t7enzymemix合成crna。反应的具体过程如下：首先，配制体外转录mastermix(见表4，单个反应体系用量)，轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底，向上述步骤2.3所得的每个样品管中加入30μlmastermix。表4体外转录mastermix组分表组分名称体积nuclease-freewater4μlt7buffermix20μlt7enzymemix6μl轻柔混匀，40℃反应8-14小时。反应完成后，过柱纯化crna。其中，t7enzymemix来自于ambion厂家生产的ambionwtexpressionkit,30rxn试剂盒。4.crna纯化使用rna纯化柱纯化crna，除去反应中的盐、酶等试剂，并对crna进行定量。5.反转录crna：以crna为模板，randomprimer为引物，cbcscriptⅱ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cdna并定量。具体反应过程如下：5.1取crna纯化产物5μg，调整体积至7.5μl，加入到0.2ml无核酸酶离心管中，并加入4μlrandomprimer，混匀，65℃5分钟，冰浴5分钟。5.2配制crna反转录mastermix(见表5，单个反应体系用量)，轻柔混匀，短暂离心将溶液收集于管底。向上述5.1步骤所得的每个样品管中加入8.5μlmastermix。表5crna反转录mastermix组分表组分名称体积4×cbcscriptⅱbuffer5μl0.1mdtt2μlcbcscriptⅱ1.5μl其中，randomprimer、cbcscriptⅱ酶均来自于ambion厂家生产的ambionwtexpressionkit,30rxn试剂盒。5.3轻柔混匀，短暂离心后25℃反应10分钟，37℃反应1.5小时。5.4反应结束后加入terminatesolution5μl，混匀。5.565℃反应10分钟，室温静置5分钟。5.6加入neutralizesolution1μl，混匀，准备纯化。6.标记以反转录的cdna产物为模板，randomprimer为引物，用klenowfragment酶合成cdna互补链并掺入带有荧光基团的dntp(cy3-dctp)，纯化并定量标记产物。带有荧光基团dna即可用于芯片杂交。实施例4qpcr验证差异表达circrna1)agilentcircrna芯片数据包括：疾病组:160039e&h-1,160039e-2,160039e&h-3,160039g-1和160039e&h-4；对照组:160039f-1,160039f-2,160039f-3,160039f-4和160039g-2。2)芯片的预处理及差异分析：对得到的circrna表达谱芯片杂交扫描后的tiff格式图片数据采用featureextraction软件进行预处理，然后采用genespringgx软件对芯片数据进行归一化处理。之后，基于表达谱矩阵文件，将样本分成两组：实验组vs对照组。然后使用t检验方法，计算差异表达circrna。差异基因的筛选阈值为：|log2fc|>1.0且pvalue<0.05。3)差异表达circrna的功能富集分析：使用david在线工具(version6.8,https://david-d.ncifcrf.gov/)，运用默认参数(设置classificationstringency＝medium)对差异基因进行了及kegg通路富集分析，选取超几何检验显著性p.value<0.05作为显著富集的阈值。4)差异circrna的mirna预测分析：circrna能够靶向与mirna结合，间接调节mrna的翻译。利用miranda软件，对挑选差异表达的环状rna的靶mirna进行预测，选择score>140作为阈值，得到mirna的列表。5)差异circrna与差异mirna的共表达分析:我们对差异circrna的表达谱矩阵与差异mirna的表达谱矩阵进行共表达分析，使用皮尔森相关系数法。皮尔森相关系数r的范围是[-1,1]，因为mirna与circrna之间的调控关系是负相关，选择r<-0.5作为mirna与circrna的共表达关系对。6)cerna分析:竞争性内源rna(cerna)假说，已知microrna可以通过结合mrna导致基因沉默，而cerna可以通过竞争性地结合microrna来调节基因表达。cerna可以通过应答元件(micrornaresponseelements，mres)与microrna结合从而影响microrna导致的基因沉默。cerna可以是circrna或者lncrna。一般认为，circrna与mrna之间存在共同的mirna调控个数大于等于5个，那么这个circrna有可能就是这个mrna的cerna。7)网络图构建:使用cytoscape软件对获得的网络关系对进行网络图构建，所得网络图如图2所示。获得hsa-circ-0046159作为cerna。实施例5rt-pcr验证将rna检测后合格的样本为10个样本，分为两组，每组5个样本。其中，对照组样本编号：n1、n4/n4-1、n5、j-10；实验组样本编号：n6、160750b-1、160039h-2、c-8、b-1；首先，进行circrna的逆转录反应，反应体系及参数如下：表6circrna逆转录反应体系反应条件:37℃60min85℃5s制备用于标准曲线梯度稀释dna模板。针对需要测量的基因hsa-circ-0046159和管家基因β-actin，选择cdna模板进行pcr反应，反应体系和反应参数如下：表7pcr扩增反应体系试剂体积2×mastermix5μl正义引物,10μm0.5μl反义引物,10μm0.5μlcdna2μl加水至总体积10μl轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置pcr反应：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。pcr产物与100bpdnaladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。将pcr产物进行10倍梯度稀释：设定pcr产物浓度为1，分别稀释为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7这几个梯度浓度的dna。荧光定量pcr扩增，扩增反应体系及参数如下：表8pcr扩增反应体系试剂体积sybrpremixextaq(2x)10μl正向引物10μm1μl反向引物10μm1μlcdna(加水稀释成一致水平)8μl反应条件meltcurve60℃to95℃:increment0.5℃for10splateread统计分析所有结果以均值±sem值的形式呈现，并制成表格。数据统计分析使用的软件为spss22.0，作图软件为graphpadprism5(graphpadsoftware,sandiego,ca)，p<0.05和p<0.01为显著性差异和极显著性差异的筛选标准。结果见图1所示，经rt-pcr验证证明，与对照组相比，实验组hsa-circ-0046159的表达量显著上调。实施例6hsa-circ-0046159标记物特异性实验本实施例收集首都医科大学附属北京朝阳医院慢性血栓栓塞性肺动脉高压疾病患者外周血样品30例，正常人样品30例，检测hsa-circ-0046159的表达水平及特异性。结果发现，患者样品中hsa-circ-0046159的表达水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(p<0.01)，hsa-circ-0046159作为慢性血栓栓塞性肺动脉高压的特异性为85％。以上结果说明血液中hsa-circ-0046159的表达水平可用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的辅助诊断，有助于反映慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的疾病状态。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12