一种与红白锦鲤肤色调控相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

文档序号：14411685阅读：237来源：国知局

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种与红白锦鲤肤色调控相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

锦鲤(cyprinuscarpiovar.koi)隶属鲤科，是一种被广泛养殖的观赏鱼，体色变化丰富多彩，组合形式多样，是一种全球范围内重要的观赏鱼类，享有“水中活宝石”，“会游泳的艺术品”等多项美誉，且价值不菲，在国内外的观赏鱼市场上占有相当重要的份额，是研究鱼类乃至脊椎动物体色变化的重要模式动物，锦鲤体色的遗传机理目前尚不清楚。

红白锦鲤是锦鲤中最具代表性以及最受欢迎的品种之一，其体色由白色底色和红色斑块组成，红白相映，色泽艳丽，是研究锦鲤皮肤体色的遗传机制的优秀模型生物。

目前，关于锦鲤体色控制关键基因的研究很少，本实验旨在以转录组分析为基础方法，通过对不同红白锦鲤组织转录组测序数据的分析探讨锦鲤体色控制的关键基因，为揭示色素控制基因与体色的关系、深入研究其体色表达机理奠定基础，同时为研究锦鲤更多体色变异的作用机理提供基础资料。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与红白锦鲤肤色相关的snp分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种与红白锦鲤肤色相关的snp分子标记及其应用。

所述snp分子标记位于鲤鱼基因组36号染色体(nc_031732.1)上的从5’端起的第9648629位，对应于序列表中seqidno.1所示核苷酸序列的第488位，该位点处发生a/c突变导致红白锦鲤肤色遗传的稳定性出现多态性。

本发明进一步提供了用于检测红白锦鲤基因组中所述snp分子标记单核苷酸多态性的物质。该物质包括但不限于特异性扩增引物。

本发明进一步提供了利用上述snp分子标记的单核苷酸多态性或用于检测红白锦鲤基因组中所述snp分子标记单核苷酸多态性的物质在辅助改良红白锦鲤肤色性状遗传中的应用。

本发明提供了一种核酸序列，所述核酸序列为包括所述snp分子标记的核酸序列，所述核酸序列选自dna序列、cdna序列和rna序列中的至少一种。所述核酸序列不论其长度是多少bp，只要包含所述的snp分子标记，那么其均为本发明所要求保护的核酸序列。另外，所述snp分子标记一般位于所选定的上述核酸序列的中心位置或比较靠近中心的位置，特别是较短的核酸片段snp分子标记位于核心区更有利于更加准确的检测上述的snp分子标记。但是，在所选目的核酸序列较长和/或检测技术特别灵敏和/或特异性非常强的情况下，上述snp分子标记也可以靠近所选定的核酸序列的两端中的一端，甚至是位于第一位或者末位。一般来说，所述核酸序列为dna序列时，该核酸序列是从鲤鱼基因组36号染色体中截取的一段dna序列。

第二方面，本发明提供了一种改良红白锦鲤肤色性状遗传的方法，所述方法包括：确定种鱼核心群中种鱼所述的snp分子标记，并根据所述snp分子标记做出相应的选择：

在所述种鱼核心群中选择所述种鱼在上述snp分子标记处为aa基因型的个体，淘汰在该位点为ac和cc基因型的种鱼个体，以逐代提高该位点的等位基因a的频率，从而调节红白锦鲤种鱼肤色遗传的稳定性，筛选能稳定遗传的肤色性状。

现在snp的常用检测方法主要有：taqman法、质谱法、芯片法、测序法。taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵，主要包括针对snp位点变异设计特异性的探针、采用荧光淬灭及双末端标记技术、采用酶外切活性；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点(能检测25个位点)，包括需要用到高效液相色谱仪与质谱仪的dhplc技术和质谱分析；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析，如dna芯片、全基因组snp芯片；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择，包括全基因组测序、外显子组测序、snp测序等。此外，高温连接酶检测反应(ligasedetectionreaction，ldr)是近几年逐渐引起人们注意的一种新型基因多态性检测方法，该技术操作简单、稳定，结果可靠，俗称小测序；限制性酶切方法(rflp)准确性较好，费用也较低，但只能对一部分含有现成酶切位点的多态位点进行分型；snapshot法基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，通常用于10-30个snp位点分析。

在本发明的一个具体实施方式中，利用分析种鱼的核酸序列来确定种鱼在上述snp分子标记处的核苷酸种类，其中所述核酸序列可以选自dna序列、cdna序列和rna序列中的至少一种。分析所述种鱼的核酸序列的具体方法至少包括pcr-测序、pcr-rflp、针对snp位点变异设计特异性的探针等方法。

本发明提供了一种确定红白锦鲤肤色好坏的方法，所述方法包括：确定种鱼的上述snp分子标记，并根据上述snp分子标记判定鲤鱼的肤色好坏：

当所述红白锦鲤在上述染色体第9648629位点的基因型为aa时，所述鲤鱼的肤色稳定性明显优于在该位点为ac基因型或cc基因型的鱼。

第三方面，本发明还提供了一种与含有所述snp分子标记的核酸序列能够严谨杂交的核酸序列，该提供的序列选自dna序列、cdna序列和rna序列中的至少一种。举例说明如下：如上所述的包括上述snp分子标记的核酸序列，即所述核酸序列可以选自dna序列，其位于鲤鱼基因组36号染色体上，且包括上述snp分子标记的核酸序列，如序列表的seqidno.1或seqidno.2。本发明提供的核酸序列能够用于锦鲤在肤色性状遗传改良中的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸序列具有与seqidno.1所示序列90％以上的相似性，且其编码的蛋白质与如seqidno.3所示的蛋白质具有相同的功能。例如，所述核酸序列可以是根据序列表序列3所示的氨基酸序列进行人工改造的核酸序列，此人工改造的核酸序列可以用于后续的基因工程或遗传工程中，所述人工改造包括密码子的优化，一个或多个位点的定点突变、插入突变或缺失突变，或者类似所列举的这些常规手段的组合。

本发明提供了一种如seqidno.3所示的氨基酸序列在鱼肤色性状中的应用。例如利用鉴定序列表序列3的第360个氨基酸是为苯丙氨酸(phe)还是为半胱氨酸(cys)来判定种鱼的snp分子标记：

当seqidno.3的第360个氨基酸为苯丙氨酸(phe)时，所述snp分子标记为a；

当seqidno.3的第360个氨基酸为半胱氨酸(cys)时，所述snp分子标记为c；

当seqidno.3的第360个氨基酸为苯丙氨酸(phe)时，所述鱼的肤色遗传性状明显优于seqidno.3的第360个氨基酸为半胱氨酸(cys)的鱼。

本发明的有益效果在于：

本发明首次开发得到了一种与红白锦鲤肤色遗传稳定性相关的snp分子标记及其应用。凭借对该snp分子标记的研究和应用，可有效提高红白锦鲤肤色遗传的稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述snp分子标记的筛选。

1、实验动物

本发明所使用的实验鱼群体共1个：试验群体为从北京市鑫淼水产总司购买的红白锦鲤。

试验群体来自北京市鑫淼水产总公司。于温室暂养池暂养7d，以减少环境对基因转录表达的影响。暂养环境：水温(25±1)℃，采用曝气自来水，每日光照8-10h，每日定时投喂颗粒饲料1次，投喂总量为鱼体重的2-3％。取样前，采用ms-222(sigma，usa)将实验鱼麻醉安乐死，并根据中国科学技术应用的法律法规人性化对待实验动物。

2、样品采集

首先用80％乙醇擦拭移液器、操作台、手术刀、手术剪、室温晾干，准备冰盒、液氮。选取生长状态良好的健康的红白锦鲤成鱼红颜色部位皮肤(三个样品)、白颜色部位皮肤(三个样品)、肌肉、心脏、脑、肝脏等10个不同组织样品(各三个生物学重复)。活体取材后迅速用rnasefree水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，取不同组织时，每取一个组织需更换手术刀和手术剪，防止交叉污染，液氮冻存后分别提取核酸。整个操作过程需佩戴口罩、手套。

表1样品取样部位及编号

3、核酸提取及检测

取适量组织材料，使用核酸提取试剂盒，分别提取各组织样品的dna和总rna。rna提取后进行rna样品检测，对rna样品的检测主要包括4种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染；(2)nanodrop检测rna的纯度(od260/280比值)；(3)qubit对rna浓度进行精确定量；(4)qsep100精确检测rna的完整性。rna样品要求：总量≥2μg，浓度≥50ng/μl；od260/280≥2.0；完整性rin≧6.8；28s/18s≧1。dna样品要求：总量≥1μg；浓度≥50ng/μl；od260/280在1.8-2.0之间；dna完整纯净，无降解，无细胞凋亡，无rna、蛋白质、多糖、试剂成分等残留或污染。核酸样品检测合格后进行文库构建、上机测序。

4、基因组测序和转录组测序

基因组重测序策略：双端测序pe150bp；测序数据量：100g数据量(包1条lane测序)，约覆盖基因组50x。

转录组测序策略：双端测序pe150bp；测序数据量：至少8g/样品。

5、数据分析

基因组测序数据分析：

a、数据过滤：数据下机后首先对数据进行过滤获取质量值较高的cleanreads；

b、与鲤鱼基因组比对：将cleanreads与鲤鱼参考基因组序列进行比对，查找snp\indel\sv，并对变异位点进行功能注释，查找与体色相关变异信息。

c、红白锦鲤特异基因拼接：能够与鲤鱼基因组比对上的，则为与鲤鱼基因组共有的序列，比对不上的reads用soapdenovo进行从头拼接，获得红白锦鲤特异的基因序列，并对特异基因序列进行功能注释，并筛选与色素合成相关基因。

d、红白锦鲤基因组序列：与鲤鱼共有基因序列及特异基因序列相加，即获得红白锦鲤的初步基因组序列。

转录组测序数据分析：

a、数据过滤：数据下机，首先对下机数据进行过滤获取质量值较高的cleanreads。

b、转录本组装：对不同组织样品下机后的数据进行过滤后，采用合并组装的方式，将cleanreads组装成unigenes，获得红白锦鲤的功能基因组序列信息。

c、基因表达分析：将各样品的reads与unigenes库进行比对，分析unigene在各个样本的表达情况，并筛选皮肤样品特异表达的基因，并对这些基因进行功能注释，筛选与色素合成的相关基因，即为候选基因。

d、差异表达分析：对红色皮肤样本及白色皮肤样本进行基因差异表达分析，筛选差异表达基因并进行功能富集分析，从中筛选富集程度比较明显的差异表达基因，即为候选基因。

结合c和d中的分析结果，最终获取调控红白锦鲤皮肤颜色的关键基因。

6、多态性snp分子标记的筛选

对各样品筛选出的snp位点数目、转换类型比例、颠换类型比例以及杂合型snp位点比例进行统计，分类后进行功能注释，通过十组样品间比较分析，富集红色皮肤样本及白色皮肤样本的特异表达位点，筛选与色素合成的相关变异位点。

表2snp位点统计信息表

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京市水产科学研究所

<120>一种与红白锦鲤肤色调控相关的snp分子标记及其应用

<141>2017-12-26

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2676

<212>dna

<213>锦鲤(cyprinuscarpiovar.koi)

<400>1

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<210>2

<211>1750

<212>dna

<213>锦鲤(cyprinuscarpiovar.koi)

<400>2