本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种agtr1基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
高血压是遗传因素与环境因素相互作用所致的疾病。研究表明，肾素－血管紧张素系统（ras）在调节血压和维持体内水、电解质平衡方面具有重要作用，参与了原发性高血压的发生发展。这一系统的主要生物学活性物质血管紧张素ⅱ（angiotensinⅱ，atⅱ）在心肌肥厚的发生发展中起着重要作用，它主要通过其i型受体（angiotensinⅱtype1receptor，agtr1）的介导从而发挥其作用。
agtr1基因位于人染色体3q21-25，其编码产物主要介导atⅱ的心血管作用。全基因组扫描研究agtr1基因是eh发病的最重要的候选易感基因，agtr1基因多态性与eh的发生发展相关。近年来越来越多的研究表明，血管紧张素ⅱ-1型受体(agtr1)基因多态性对高血压、肾脏疾病、血管疾病、冠心病、心肌肥厚、心力衰竭和糖尿病的发生发展有着重要影响。agtr1基因变异不仅可为这些疾病易患人群的筛查、预防和疾病的诊断提供参考信息，更有望能为agtr1拮抗剂的临床应用提供理论和病例选择依据，并可为心肌梗死等危重症的有关基因治疗提供理论和实验基础。通过对患者的agtr1基因进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果作为中间结果的信息的方法，不属于疾病的诊断方法；以基因型的检测结果来确定药物的选择，就可以实现个体化用药，避免对免疫抑制剂不良反应。
目前常用的agtr1基因突变检测方法主要采用基因芯片法。但基因芯片法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。
因此，需要一种新的检测agtr1基因基因突变的试剂盒及检测方法，使得对agtr1基因突变的灵敏度高，假阳性率高，且检测周期短。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种agtr1基因检测试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中agtr1基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。
一种agtr1基因检测试剂盒，包括用于对含rs5186位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8。
优选的，所述基因检测试剂盒还包括接头，所述接头包括接头a、接头b、接头c、接头d中的至少一种；所述接头a由seqidno:9和seqidno:10组成；所述接头b由seqidno:11和seqidno:12组成；所述接头c由seqidno:13和seqidno:14组成；所述接头d由seqidno:15和seqidno:16组成。
优选的，所述基因检测试剂盒还包括测序引物seqidno:17，所述测序引物用于对含rs5186位点的文库分子进行测序。
优选的，所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
一种基因检测方法，包括以下步骤：
a、利用扩增引物组，对含rs5186位点的样本进行扩增，得扩增产物；其特征在于，所述引物组包括上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
b、在所述扩增产物上连接接头，得到文库分子；
c、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定rs5186位点的基因型。
优选的，所述步骤a包括以下步骤：
a1、采用第一引物组扩增agtr1基因片段，得第一扩增产物；所述第一引物组包括第一上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一下游引物seqidno:5或seqidno:6；；
a2、以第一扩增产物为模板，采用第二引物组扩增含rs5186位点的核酸片段，得第二扩增产物；所述第二引物组包括第二上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二下游引物seqidno:7或seqidno:8。
优选的，所述步骤b中还包括向第二扩增产物中加入user酶进行切割的步骤，所述第二扩增产物经user酶切割形成第一粘性末端。
优选的，所述接头包括接头a、接头b、接头c、接头d中的至少一种；所述接头a由seqidno:9和seqidno:10组成；所述接头b由seqidno:11和seqidno:12组成；所述接头c由seqidno:13和seqidno:14组成；所述接头d由seqidno:15和seqidno:16组成。
优选的，步骤c中用于对含rs5186位点的文库分子进行测序的测序引物为seqidno:17。
优选的，所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
本发明提供的agtr1基因检测试剂盒，采用特异性pcr扩增引物组对含rs5186位点的片段进行扩增，降低了扩增多个靶位点的可能性，提高了对rs5186位点扩增的特异性和灵敏度，降低了假阳性率；同时，采用第二代高通量基因测序技术，使得对rs5186位点的检测周期短，通量高。
附图说明
图1为第三实施例中文库分子的page胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一实施例，一种agtr1基因检测试剂盒，包括用于对含rs5186位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8。
本方案提供的agtr1基因检测试剂盒，包括特异性扩增引物组，该特异性扩增引物组能够特异性扩增含rs5186位点的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对rs5186位点检测的灵敏度高，假阳性率低。
优选的，所述试剂盒还包括接头，所述接头包括接头a、接头b、接头c、接头d中的至少一种；所述接头a由seqidno:9和seqidno:10组成；所述接头b由seqidno:11和seqidno:12组成；所述接头c由seqidno:13和seqidno:14组成；所述接头d由seqidno:15和seqidno:16组成。其中，所述接头a上含有标签序列aatt；所述接头b上含有标签序列ttaa；所述接头c上含有标签序列ccgg；所述接头d上含有标签序列ggcc。
需要说明的是，当采用本发明的试剂盒对在同一体系中同时对不同样本的rs5186位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。本方案设计的接头序列由于5’末端不含磷酸基团，不会发生自连，从而提高了接头与扩增产物之间的连接效率；且接头序列中组合的四种标签序列在后续检测过程中碱基识别简单，易于区分，且不会产生二级结构；标签序列长度为4bp，降低了设计和检测难度。
优选的，所述seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15的5’末端上含有生物素标记，且生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记，可以在连接反应结束后，很方便的将含rs5186位点和接头的核酸片段分离出来。
优选的，所述试剂盒还包括测序引物，所述测序引物包括用于检测rs5186位点的测序引物seqidno:17。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接在rs5186位点附近区域，使得在测序过程中，仅需较少次数的测序即可确定rs5186位点的基因型。
优选的，所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物适用于采用连接测序法对rs5186位点进行检测，本方案使得测序探针可连接在测序引物的5’末端。
本发明提出第二实施例，一种基因检测方法，包括以下步骤：
a、利用扩增引物组，对含rs5186位点的样本进行扩增，得扩增产物；其特征在于，所述引物组包括上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
b、在所述扩增产物上连接接头，得到文库分子；
c、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定rs5186位点的基因型。
本发明提供的基因检测方法，采用特异性扩增引物组扩增含rs5186位点的核酸片段，提高了对rs5186位点检测的灵敏度，降低检测的假阳性率。
优选的，所述步骤a包括以下步骤：
a1、采用第一引物组扩增agtr1基因10号等位基因区域，得第一扩增产物；所述第一引物组包括第一上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一下游引物seqidno:5或seqidno:6；；
a2、以第一3扩增产物为模板，采用第二引物组扩增含rs5186位点的核酸片段，得第二扩增产物；所述第二引物组包括第二上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二下游引物seqidno:7或seqidno:8。
本方案通过设计两对pcr扩增引物组，对含rs5186位点的核酸片段进行两轮特异性扩增，能够有效确保第二扩增产物中没有因引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染，降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了扩增的特异性和灵敏度。
优选的，所述步骤b中还包括向第二扩增产物中加入user酶进行切割的步骤，所述扩增产物经user酶切割产生第一粘性末端。由于seqidno:3、seqidno:4中均含有cggu片段，通过pcr扩增得到第二扩增产物后，user酶切割第二扩增产物g和u之间的磷酸二酯键，形成5’末端含有磷酸基团的第一粘性末端，该第一粘性末端有利于在后续反应过程中连接接头。
优选的，所述接头含有第二粘性末端，所述第二粘性末端与扩增产物的第二粘性末端完全互补配对。接头通过第二粘性末端与扩增产物的第一粘性末端互补配对连接，提高了连接效率。
优选的，所述接头与第二粘性末端相对的末端上含有生物素标记，且被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记，可以在步骤b结束后，很方便的将含rs5186位点和接头的文库分子分离出来。
需要说明的是，当对多个不同样本的rs5186位点进行扩增时，扩增步骤是在不同反应体系中分开进行的，但对多个不同样本的含rs5186位点的文库分子可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的基因检测方法对在同一体系中同时对不同样本的rs5186位点进行测序时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列的测序区分不同的样本，无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
所述接头上含有标签序列，当在同一体系中对多个待测序位点进行测序时，采用含有不同标签序列的接头与含不同待测序位点的扩增产物连接，在测序过程中通过检测标签序列，能够在测序过程中区分样品。
优选的，所述接头包括接头a、接头b、接头c、接头d中的至少一种；所述接头a由seqidno:9和seqidno:10组成；所述接头b由seqidno:11和seqidno:12组成；所述接头c由seqidno:13和seqidno:14组成；所述接头d由seqidno:15和seqidno:16组成。其中，所述接头a上含有标签序列aatt；所述接头b上含有标签序列ttaa；所述接头c上含有标签序列ccgg；所述接头d上含有标签序列ggcc。当在同一体系中对多个不同样本进行测序时，采用含有不同标签序列的接头与不同样本的扩增产物连接，在测序过程中通过检测标签序列，能够在测序过程中区分样本；本方案设计的接头序列由于5’末端不含磷酸基团，不会发生自连，从而提高了接头与扩增产物之间的连接效率；且接头序列中组合的四种标签序列在后续检测过程中碱基识别简单，易于区分；标签序列长度为4bp，降低了设计和检测难度。
优选的，所述第二代高通量基因测序技术包括但不仅限于连接测序法或合成测序法。
优选的，步骤c中对含rs5186位点的文库分子进行测序的测序引物为seqidno:17。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接在rs5186位点附近区域，使得在测序过程中，仅需较少次数的测序即可确定rs5186位点的基因型。
优选的，所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物尤其适用于采用连接测序法，在测序过程中，测序探针连接在该测序引物5’末端。
本发明提供了第三实施例，一种agtr1基因检测方法，以人类全血基因组样本一和人类全血基因组样本二为模板，分别按以下步骤建立反应体系：
a1、针对上述两个样本，各配制一个扩增agtr1基因片段的反应体系，；按以下配比配制各反应体系：50ng/μl的人类全血dna分子1.0μl；2×longtaqmix（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；10μm的第一上游引物0.4μl；10μm的第一下游引物0.4μl；8.2μl去离子水；混匀并离心。然后将离心管置于pcr仪中，设置反应程序：94℃条件下持续5分钟；94℃条件下持续20秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续25秒，一共30个循环；72℃条件下持续5分钟；pcr反应完成后，得到第一扩增产物。其中，第一上游引物组为seqidno:1，第一下游引物为seqidno:5；
a2、以上述两个样本的第一扩增产物为模板，各配制一个扩增包含rs5186位点的核酸片段的反应体系；按以下配比配制各反应体系：稀释100倍的第一扩增产物1.0μl；2×longtaqmix10μl；10μm的第二上游引物0.4μl；10μm的第二下游引物0.4μl；8.2μl去离子水；混匀并离心。将离心管置于pcr仪中，设置反应程序：94℃条件下持续5分钟；94℃条件下持续20秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续25秒，一共35个循环；72℃条件下持续5分钟；pcr反应完成后，得第二扩增产物。其中，第二上游引物为seqidno:3，第二下游引物为seqidno:7。
b、针对两个不同样本的第二扩增产物，分别配制切割-连接反应体系如下：第二扩增产物20μl，t4连接酶缓冲液8μl，t4dna连接酶1μl，user酶2μl，0.2μmol/ml的预先固定在磁珠上的f接头1μl。上述反应体系在25℃条件下反应10分钟，反应完成后，将离心管置于磁力架上，分离去除上清，加入50μl的te缓冲液反复清洗2次，得到吸附在磁珠上的含有接头以及rs5186的核酸片段的文库分子。其中，本实施例中与样本一的第二扩增产物连接的接头为seqidno:9和seqidno:10组成的接头a，与样本二的第二扩增产物连接的接头为由seqidno:11和seqidno:12组成的接头b。
如图1所示，对样本一得到的文库分子和样本二得到的文库分子进行page胶电泳图检测，图中泳道0为分子大小标记物，泳道1为样本一得到的文库分子，泳道2为样本二得到的文库分子。均在43bp附近出现目标条带，与理论预期文库分子大小完全相符，说明本发明的扩增引物组可以很好的扩增含rs5186位点的核酸片段。
c、将步骤b得到的样本一的文库分子和样本二的文库分子，点样至异硫氰基修饰的载样片上，于37℃固定1h。采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪pstarⅱa，以连接测序法进行测序，确定样本一的rs5186位点为a，为野生型；样本二的rs5186位点为c，为突变型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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