一种利用人微血管内表皮细胞检测凉茶抗炎活性的方法与流程

本发明属于免疫分析
技术领域：
，具体涉及一种利用人微血管内表皮细胞(hmec-1细胞)icam-1基因表达量检测凉茶抗炎活性的方法。本发明涉及到一种基于hmec-1细胞icam-1的基因表达量检测凉茶抗炎活性的方法，更具体地说是在细胞水平上，先将凉茶与hmec-1细胞共同孵育，然后利用脂多糖(lps)诱导hmec-1细胞产生炎症反应，由于icam-1基因的表达水平与hmec-1细胞炎症程度相关，因而利用不同凉茶检测液预处理后hmec-1细胞的icam-1基因表达水平会受到不同程度的抑制，可以通过icam-1基因表达水平的抑制率高低定量分析凉茶抗炎效果。
背景技术：
：炎症是机体应对病原感染、细胞应激以及组织损伤而产生的一种本能而又必要的反应。最初招募的先天免疫细胞又会产生一系列的趋化因子和粘附因子，这些炎症因子将在机体招募其它免疫细胞、杀死病原菌、清理死细胞以及刺激机体修复的过程中发挥重要作用(j.f.foley,2003；gabrielandannalisam.vanhook,2013；j.f.foley,2015)。在发炎的组织中，脉管通透性往往在一定范围内增加，一方面内皮细胞开始表达多种类型的粘附因子(adhesionmolecular)：选择素、整合素以及免疫球蛋白，这些蛋白在调控机体招募白细胞到发炎部位过程中发挥着重要作用(koningetal.,2002；metselaarandstorm,2005；dingetal.,2006)；另一方面，机体产生趋化因子，通过浓度依赖，定向诱导白细胞的迁移。白细胞响应趋化因子和粘附因子构成了外来病原入侵后的第一道防线(murphypm,1994；gangurmandoppenheimjj.,2000；chenxinetal.,2002)。特别是在lps诱导的急性炎症模型中，中性粒细胞需要粘附并迁移穿过血管内皮细胞从而到达炎症部位。一开始，借助于选择素家族基因(selectingenefamily)的表达，在白细胞表面表达l-selectin，在内皮细胞表面表达e-selectin以及p-selectin，两者相互作用产生初步粘附(stoolmanlm,1989；springerta,1990；butcherec,1991)。然而在流动的血液环境中初始的粘附是不够的，更牢固的结合需要中性粒细胞表面的fla-1整合蛋白与血管内皮细胞表面的细胞间粘附因子(icam-1)相结合(springerta,1990；butcherec,1991)。本专利要求的方法在体外模拟了该炎症反应过程。炎症带来的问题不在于它的顺利启动，而在于当威胁消除时往往不能及时有效的平息炎症(carlnathanandaihaoding,2010)。研究发现过度的天然免疫反应，伴随着过早地招募炎性白细胞，就是造成1918年流感大面积发病的关键原因(kobasaetal.,2007)。后来研究表明，如果炎症反应没有被终止，或者如果组织遭受继续的炎症，这实际上导致组织损伤而不是促进愈合。慢性炎症可以导致多种疾病，哮喘和类风湿性关节炎到动脉粥样硬化，炎性肠病，甚至是癌症(j.f.foley,2003；raschandalgul,2014；j.f.foley,2015)。人微血管内表皮细胞(hmec-1)在天然免疫中十分重要，其分泌的粘附因子是调控机体炎症反应的主要因素。针对细胞粘附模型国内外开发了一系列抗炎药物，美国康奈尔大学moonsoojin等将其开发作为定点给药的细胞研究对象(sungkwonkangetal.,2011)。因而我们选用hmec-1作为我们的筛选体系。我们选择icam-1细胞分子作为判断细胞炎症的评价标准。其依据在于，前人大量研究表明icam-1分子与各类炎症反应紧密相关。比如，急性胰腺炎早期中性粒细胞的icam-1表达急剧上升(dabrowskietal.,2014)。哮喘病人嗜酸粒细胞依靠icam-1进行黏附，体内体外试验表明其内皮细胞表达水平亦升高(wegneetal.,1990)。空气污染可致炎症反应，如柴油机尾气挥发物颗粒引起人肺支气管表皮细胞中icam-1转录和蛋白水平增加(takizawaetal.,2000)。实验模型中t细胞透过血脑屏障是自身免疫疾病脑脊髓炎(encephalomyelitis)和多发性硬化症(multiplesclerosis)病程中至关重要，研究表明t细胞表面icam-1数量与其穿透血脑屏障能力直接对应(abadieretal.，2015)。炎症反应过程复杂，其伴随的细胞因子风暴往往是病原菌感染期间机体发病和致死的先兆。所以通过调节机体免疫反应，特别是抑制钝化细胞因子表达，不仅可以保护机体，也可以减轻药物对病原菌的选择压力，具有十分可观的应用前景(johnr.teijaroetal.,2015)，而抗炎凉茶具有调控机体免疫力功能，是目前最具开发价值的产品之一。凉茶是我国岭南地区居民以中医理论为指导，以金银花、布渣叶、菊花、鸡蛋花等多种天然植物为原料熬制而成，有清热泻火、清源固本，解郁行气的功效(谭剑斌等，2013)。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用人微血管内表皮细胞(hmec-1细胞)检测凉茶抗炎活性的方法，该方法是通过人微血管内表皮细胞(hmec-1)中icam-1的基因表达量检测凉茶检测剂的抗炎活性的方法，其原理在于预先用具有抗炎活性的凉茶检测液孵育的hmec-1细胞，当hmec-1细胞再受到脂多糖(lps)侵染时，其粘附因子基因icam-1的表达会受到不同程度的抑制。本发明的总体技术思路是：将生长状态良好的人微血管内表皮细胞(hmec-1)接种在24孔细胞培养板中，待hmec-1细胞长至单层，用待测凉茶检测液与所述的hmec-1细胞孵育3h，然后再用1μg/ml脂多糖(lps)处理hmec-1细胞，人工激发细胞炎症反应，最后通过荧光定量pcr的分析方法，分别检测所述的hmec-1细胞中的细胞粘附因子icam-1基因的表达量，凉茶检测液预孵育后抑制hmec-1细胞icam-1的表达量可以作为衡量凉茶检测液的抗炎效果。具体地，本发明的技术方案如下所述：一种利用人微血管内表皮细胞(hmec-1细胞)检测凉茶抗炎活性的方法，包括下列步骤：(1)凉茶检测液的配制：以mg/l计：(1)按干燥植物原料计，称取鸡蛋花9g，金银花6.5g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min后，插上电煎药壶在高火下(100℃，将电煎药壶调至功率450w)1h，温火下(85-95℃，将电煎药壶调至功率300w)1h，共计煎煮2h，重复前述方法煎煮一次，分别用定性滤纸过滤，合并两次滤液，减压抽滤后，收集滤液，市售凉茶需要定性滤纸过滤，减压抽滤后，收集滤液；(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1mpa，65℃条件下旋转蒸发浓缩成浸膏，取出浸膏，于-20℃冻结，再用真空冷冻干燥机处理冻结后的浸膏，得到凉茶粉末，于-20℃下保存备用；(3)称取步骤(2)所得的凉茶粉末100mg/样本，用10ml的mcdb131原始培养基(购自sigma公司)溶解，配成10mg/ml的凉茶母液，用0.22μm无菌滤膜(购自salus公司)过滤后分装，于-20℃保存备用，保存时间不超过14d；(4)配制1mg/ml的脂多糖(lipopolysaccharides，简称lps)溶液作为hmec-1细胞的诱导剂，配制1mm的雷公藤红素溶液，作为阳性对照药物，于-20℃下保存备用；(5)将生长状态良好的hmec-1细胞，用细胞计数板计数后，接入24孔细胞培养板(购自corning公司)的孔中，所述的细胞培养板的孔中包含有10％的胎牛血清，1μg/ml的氢化可的松和10ng/ml的重组人表皮生长因子的mcdb131完全培养基(mcdb131原始培养基购自sigma公司)，在37℃，5％co2条件下培养hmec-1细胞；(6)待hmec-1细胞长至单层，更换如步骤(5)所述的mcdb131完全培养基的新鲜培养基，然后将步骤(3)中配好的凉茶母液稀释至0.1mg/ml～0.4mg/ml检测浓度；将步骤(4)中配好的雷公藤红素溶液稀释至1μm，于37℃孵育细胞3h；然后向所述的细胞培养板的每孔中再加入终浓度为1μg/ml的lps，继续孵育细胞3h；孵育结束后，弃掉所述的培养基，每孔加入细胞裂解液trizol(购自invitrogen公司)200μl，在室温下静置10min，收集细胞裂解液trizol到无rna酶的离心管中；每管加入40μl氯仿上下颠倒使之充分混匀，室温下静置10min，4℃下于12000g离心15min；离心结束后，收集上清水相液(收集量约80μl)到新的离心管中，并加入200μl的异丙醇沉淀rna，然后一并转入rna吸附柱中，在室温下静置10min，于8000g离心1min，然后用500ul75％乙醇洗两次，每管加入30μldepc水，于65℃孵育5min，在4℃1200rpm离心30s收集得到总rna；(7)将步骤(6)收集的总rna通过微型分光光度计检测(nano200，购自thermo公司)，其吸光度a260/a280在2.0左右，并且通过琼脂糖凝胶电泳得到清晰的两条带，说明rna完整无降解；(8)取500ng步骤(6)所得的总rna置于pcr仪上，在37℃5min去除残留的基因组dna；用反转录试剂盒合成得到cdna第一条链；从qprimerdepot引物库中搜索得到检索号为nm_010493细胞间粘附因子icam-1基因的引物和检索号为nm_002046的内参基因gapdh的引物，所述引物序列如下：扩增icam-1基因的引物对：f-icam-1上游引物：5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’，r-icam-1下游引物：5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’；扩增gapdh内参基因的引物对：f-gapdh上游引物：5’-tgacaacagcctcaagat-3’r-gapdh下游引物：5’-gagtccttccacgatacc-3’(9)进行荧光定量pcr；(10)以gapdh基因为内参基因，计算icam-1基因的相对表达量。上述步骤(10)的具体计算方法：(1)根据qpcr测得的ct值，利用2-△△ct(livak)方法计算基因相对表达量；(2)对所有样本，包括检测样本和校准样本，用内参基因的ct值归一靶标基因的ct值：检测组△ct＝ct(靶标基因，检测组)-ct(内参基因，检测组)；对照组△ct＝ct(靶标基因，对照组)–ct(内参基因，对照组)；(3)用对照组样本的△ct(对照组)值归一检测组样本的△ct(检测组)：△△ct＝△ct(检测组)-△ct(对照组)；(4)计算表达水平比率：2-△△ct＝相对表达量。本发明的优点在于：1、实验模型科学严谨，实验结果真实有效。2、操作简便，节省时间。3、成本低廉。更详细的技术方案和试试效果请参见《具体实施方式》。附图说明图1：是部分总rna琼脂糖凝胶电泳图。附图标记说明：图1中左边第1泳道为ds2000的分子标记，第2到第9泳道为部分凉茶检测液孵育后hmec-1细胞的总rna样品。在图1中：第一条分子量为2000bp的条带为28srrna；第二条分子量在1000bp左右的条带为18srrna；并且28srrna条带亮度约为18srrna条带亮度的两倍，说明rna完整性好。图2：是本发明配制的单组份凉茶检测液孵育后细胞icam-1基因相对表达量柱形图。(显著性分析相比较于lps组，*p<0.05；**p<0.01)附图标记说明：图2中将lps处理组设为100％，而提前用凉茶检测液孵育后再经过lps处理的样品组换算为lps组的百分含量，即若百分含量越低，则说明凉茶检测液抗炎活性越高。如图2中所示甘草，菊花，金银花，鸡蛋花，布渣叶，夏枯草在高浓度如0.4mg/ml时都可以显著抑制细胞icam-1基因的表达；在中等浓度如0.2mg/ml可以显著抑制细胞icam-1基因表达的有甘草，菊花，布渣叶和夏枯草；而金银花和鸡蛋花在0.2mg/ml时则和lps组无显著差异；低浓度下(例如0.1mg/ml)时，各组都与lps组无显著性差异。图3：是本发明配制的混合组分配方凉茶检测液和市售凉茶检测液孵育后细胞icam-1基因相对表达量柱形图。其中本发明配制的凉茶配方1包含有甘草、菊花、布渣叶、金银花、鸡蛋花和夏枯草共六种药材，每种药材的浓度都为0.1mg/ml；配制的制凉茶配方2包含有甘草、菊花、布渣叶、鸡蛋花和夏枯草共计五种药材，其中菊花为0.2mg/ml，甘草、布渣叶、鸡蛋花和夏枯草分别为0.1mg/ml；凉茶配方3包含甘草、菊花、鸡蛋花和夏枯草共计四种药材，其中菊花为0.3mg/ml，甘草、鸡蛋花和夏枯草都为0.1mg/ml；市售商品凉茶1(例如王老吉罐装凉茶)和市售商品商品凉茶2(例如加多宝罐装凉茶)选取市场中主流凉茶产品，总浓度也为0.6mg/ml；若凉茶检测液相对于lps组能显著抑制icam-1基因的表达量则说明该凉茶检测液具有一定抗炎活性，检测液在相同浓度下可以比较icam-1抑制率，同样具有相同抑制率的凉茶检测液，若其浓度越低则说明抗炎活性越高。具体实施方式实施例1lps诱导不同浓度凉茶孵育后hmec-1细胞icam-1基因的表达量凉茶检测液的配制：以重量/体积(mg/l)计：(1)称取中药材鸡蛋花9g，金银花6.5g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min后，插上电煎药壶煎煮时间共2h(高火，例如电煎药壶设置功率为450w，即100℃，煎煮1h；温火例如电煎药壶设置功率为300w，即85～95℃下煎煮1h)，重复煎煮一次，分别用定性滤纸过滤，合并两次滤液，减压抽滤后，收集滤液；市售凉茶需要用定性滤纸过滤，减压抽滤后收集滤液(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1mpa，65℃条件下旋转蒸发浓缩成凉茶检测液浸膏，取出浸膏，于-20℃冻结；(3)将步骤(2)得到的凉茶检测液的浸膏冻结块，用真空冷冻干燥机(丹麦，labogenescanvaccoolsafe110-4，按照产品说明书操作)冷冻干燥成粉末，确保水分完全蒸发，收集凉茶检测液的粉末，于-20℃保存备用；冷冻干燥机操作方法如下，首先清理机身中残留的水分避免堵塞抽气口，然后打开电源使机身预冷降温至-110℃，将冻结成块的凉茶检测液快速放入样品室，盖好样品室盖子并关闭换气阀，打开真空泵抽取样品室空气至真空状态，检测装置气密性，大约48h后凉茶检测液形成蜂窝状突起，达到完全干燥状态；(4)称取步骤(3)得到的凉茶检测液的粉末100mg/样，用10ml的mcdb131培养基(原始培养基购自sigma公司)溶解，配成10mg/ml凉茶检测液母液，用0.22μm无菌滤膜(购自salus公司)过滤后分装，在-20℃保存备用，保存时间不超过14d；(5)配制1mg/ml的脂多糖(lipopolysaccharides，lps,026b6,购自sigma公司)作为hmec-1细胞诱导剂和1mm的雷公藤红素(celastrol)，作为阳性对照，于-20℃下保存备用；(6)将生长状态良好的hmec-1细胞，用细胞计数板计数后，接入24孔细胞培养板(购自corning公司)，使用mcdb131完全培养基(mcdb131原始培养基购自sigma公司)于37℃、5％co2条件下培养hmec-1细胞，该培养基中包含有10％胎牛血清fbs(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)、1μg/ml的氢化可的松(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)、10ng/ml的重组人表皮生长因子egf(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)；(7)待hmec-1细胞长至单层，更换新的如步骤(5)所述的mcdb131培养基，然后将步骤(4)中配好的凉茶母液稀释至0.1mg/ml～0.4mg/ml检测浓度；将步骤(5)中配好的雷公藤红素溶液稀释至1μm，于37℃孵育hmec-1细胞3h；然后向24孔细胞培养板的每孔再加入终浓度为1μg/ml的脂多糖(lps)，继续孵育hmec-1细胞3h；孵育结束后，弃掉培养基，每孔加入细胞裂解液trizol(货号15596，购自invitrogen公司)200ul，室温下静置10min，收集细胞裂解液trizol到无rna酶的离心管中；每管加入40μl氯仿(购自国药集团化学试剂有限公司)上下颠倒使之充分混匀(35次以上)，室温静置10min，4℃条件下12000g离心15min；离心结束后，收集上清水相液(大约80μl)到新的离心管，并加入200μl的异丙醇(购自国药集团化学试剂有限公司)沉淀rna，然后一并转入rna吸附柱(rnase-freespincolumnscr3，购自北京天根生化科技有限公司)中，室温下静置10min，8000g离心1min，用500μl，75％的乙醇洗两次，最后每管加入30μldepc水(depc水加入时应滴在吸附膜中部)，65℃孵育5min，迅速转移至4℃1200rpm离心30s收集得到总rna；(8)步骤(7)收集的rna其在吸光度值a260/a280在2.0左右，检测仪器为nanodrop2000分光光度计(购自thermo公司)，并且通过凝胶电泳得到清晰的两条带(见图1)，说明rna完整无降解(电泳仪购自北京六一仪器厂，型号为dyy2c)；(9)取500ng从步骤(7)得到的总rna，在pcr仪(品牌为朗基)中，用反转录试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)合成cdna第一条链(见表1、2)，37℃5min去除残留的基因组dna；继续加入如表1所示的成分，然后在42℃20min和85℃5s得到第一链cdna；表1去除rna中基因组的试剂和条件成分components所需体积volumetotalrna500ng(≤8μl)10×gdnaeraserbuffer1μlgdnaeraser1μlrnasefreewater总体积至10μl表2cdna第一条链合成的试剂和条件成分components所需体积volumeoligo(dt)181μl5×rtreactionmix4μltruescripthˉrtase/rimix1μlrnasefreewater总体积至20μl(10)细胞间粘附因子icam-1基因以及内参基因gapdh的引物可以在美国国立卫生研究院(qprimerdepot)引物库中搜索得到，基因检索号：nm_010493(icam-1)、nm_002046(gapdh)；设计扩增上述引物的序列如下：扩增icam-1基因的引物对f-icam-1(上游引物)：5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’，r-icam-1(下游引物)：5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’。扩增gapdh内参基因的引物对：f-gapdh：5’-tgacaacagcctcaagat-3’，r-gapdh：5’-gagtccttccacgatacc-3’，(11)进行荧光定量pcr，反应体系如表3；表3荧光定量pcr反应体系成分components所需体积volume2×sybrqpcrmix10μlcdna模板2μl前引物forwardprimer(10μm)0.5μl后引物reverseprimer(10μm)0.5μlddh2o终体积为20μl反应程序退火温度：55-90℃荧光定量pcr仪(购自德国耶拿公司，型号qtower2.0)；(11)以gapdh为内参基因，计算icam-1基因的相对表达量。具体方法：(1)根据qpcr测得的ct值，利用2-△△ct(livak)方法计算基因相对表达量；(2)对所有样本(检测样本和校准样本)，用内参基因的ct值归一靶标基因的ct值：△ct(检测)＝ct(靶标基因，检测组)-ct(内参基因，检测组)，△ct(对照)＝ct(靶标基因，对照组)–ct(内参基因，对照组)；(3)用对照组样本的△ct(对照)值归一检测组样本的△ct(检测)：△△ct＝△ct(检测)-△ct(对照)；(4)计算表达水平比率：2-△△ct＝相对表达量以lps组相对于阴性对照的比值为100％，计算凉茶检测液孵育组相对于lps组icam-1基因相对表达量所占的比值r，计算所得r<100％，则说明凉茶检测液预处理抑制了icam-1基因的表达，即可根据r值来评价凉茶检测液在hmec-1细胞上的抗炎效果。当前第1页12