本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法。
背景技术：
分子生物学研究发现很多基因是以基因家族的形式存在。基因家族是指由一个共同的祖先基因经过重复(duplication)和突变(mutation)产生的、外显子中具有相似的序列的一组相关基因。同一家族中的成员有时紧密的排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同染色体上，具有各自不同的表达调控模式。随着研究的深入，科研人员发现作物中很多与产量、品质、抗性等重要性状相关的基因是以基因家族的形式存在，在作物体内存在多个成员且可能各自负责不同的功能。因此，明确同一家族不同成员的功能也是分子生物学研究中一直以来的热点。获得突变体材料进行研究则是基因家族各成员功能研究的一种重要途径。
突变体(mutant)是指发生基因突变或发生染色体变异的个体，是遗传学研究所必需的基础材料，突变体还在作物的遗传育种和品质改良上有重要作用。后基因组时代是功能基因组学的时代。功能基因组学是在研究生物有机体内各种基因生物学功能的基础上，进一步解析所有基因协调发挥作用的机制，以及完成一系列生长发育的过程。要准确揭示每个基因的功能及它们之间的相互联系，就要进行单个基因和多个基因的突变表型及其时空表达特征的分析。传统的诱导突变体的方法有自发突变、体细胞无性系变异突变以及理化诱导突变体，都只能得到单基因突变的个体，且工作量大，耗费人力材力，突变效率低，时间久长。现在流行的生物技术诱导突变体，尤其是CRISPR/Cas9系统的出现，提高了突变体诱导的效率。但目前利用CRISPR/Cas9系统敲除多基因的方式大都是选择几个不同的靶位点逐一进行敲除。
芥蓝是一种原产于中国的十字花科的蔬菜，广泛分布于我国的南部和东南亚。它属于CC型染色体组，二倍体，有18条染色体，以其花薹和嫩叶为主要实用部分。因其富含维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和总酚等成分，有很高的营养价值和保健功效，备受人们的喜欢。
在芥蓝上，诱导单基因突变体时，为保证转基因植株的获得，至少要做3000-4000个外植体，大约需4个月左右的时间方能获得抗性芽，且转化频率通常仅在0.5-1％甚至更低。而当遇到基因家族时，成员有2个及2个以上，为获得各种类型的单突和多突突变体材料，这时至少要增加2倍(依基因家族的成员不同而不同)以上的工作量和工作时间以及多基因突变体诱导的周期。因此研究一种同时针对基因家族多个成员的芥蓝突变体的高效创制方法对于基因功能的研究以及芥蓝蔬菜的遗传育种和品质的提高是非常必要的。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，可有效解决以往基因家族突变为获得不同的单突和多突材料，需分别设计多个载体，各载体需进行单独转化，其诱导时间长和难度大等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，包括以下步骤：
(1)基因靶序列的选择
根据芥蓝基因家族各成员的CDS全长，分析各成员的靶位点，筛选共同靶序列；
其中，筛选标准为：选择高度保守、一致的序列作为同一基因家族多个成员的共同靶序列，共同靶序列不超过5个碱基的错配，GC含量在50％-70％，同时共同靶序列内不存在连续的4个T且能够响应U6启动子；
(2)CRISPR/Cas9表达载体的构建
根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo序列，与pSG载体连接，转化，得重组质粒，然后分别对重组质粒和pCC质粒进行双酶切，回收目的条带，然后进行连接，构建CRISPR/Cas9表达载体，最后转化农杆菌感受态用于浸染；
(3)农杆菌介导的遗传转化
制备农杆菌浸染液，浸染外植体，然后对外植体进行组织培养，获得转基因突变植株。
进一步地，步骤(1)中选择没有碱基错配的序列作为共同靶序列。
进一步地，步骤(2)中所用农杆菌为GV3101农杆菌或EHA105农杆菌。
进一步地，步骤(3)中具体过程为：将芥蓝种子接种于M1培养基上，制备无菌苗；切取无菌苗的带柄子叶，接种于M2培养基上预培养4-5天；将转化农杆菌感受态的CRISPR/Cas9表达载体制备成浸染液，然后浸染预培养后的带柄子叶，最后在M3培养基上进行共培养；共培养结束后转入M4培养基培养6-7天，再转入M5培养基进行抗性筛选并继代，最后转入M6培养基中进行生根培养，最终获得转基因突变植株。
进一步地，M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，且pH值为5.8；
M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，且pH值为5.8；
M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，且pH值为5.8；
M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，且pH值为5.8；
M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B 10-15mg/L，且pH值为5.8；
M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B 10-15mg/L，且pH值为5.8。
本发明提供的同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，具有以下有益效果：
(1)有关芥蓝植物体内的基因敲除，现有技术中是选择几个不同的靶位点对其进行逐一敲除，其费时费力，效率低，成本较高，而本发明则是通过筛选芥蓝植物体内同一基因家族中多个成员高度保守的共同靶序列，然后根据筛选出的共同靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体，最后采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因突变植株。本方法通过一次转化便可同时敲除芥蓝植物体内多个基因，不必筛选几个不同的靶位点进行逐一敲除，其从原理上体现了本发明同时、高效的优势，从而提高了其突变效率，节省了成本，降低了实验难度和强度，同时还可以得到大量的突变体材料。
(2)在本发明方法中重点在于对同时、高效的体现，具体为：在传统操作中，基于芥蓝植物构建一个CRISPR/Cas9表达载体需花费大约1500-2000元；在芥蓝植物上利用CRISPR/Cas9表达载体创制一个单基因突变体大约需要7-8个月至一年的时间，若基因家族存在2个及2个以上的成员，就需要构建3个及3个以上的载体，然后逐一进行敲除，需要至少2倍以上的周期；在制备多突突变体时会在一个单突突变体的基础上再通过杂交或进一步敲除创制多突突变体，或构建多个载体分别进行突变，需要很大的工作量，不便于管理。而采用本发明方法，只需通过筛选同一基因家族中不同成员的共同靶序列，然后通过该共同靶序列构建一个载体，便可对多个基因进行同时敲除，当应用到同一基因家族多个成员上时，至少节约2倍以上的成本，同时可得到单突和双突乃至多突的突变体材料，大大缩短了突变体创制的周期，也减少了载体构建和遗传转化方面的工作量，还便于管理。
附图说明
图1为同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体高效的制备方法的流程图。
图2为BaPDSs基因片段，标有sgRNA目标位点和序列，▌代表外显子，代表内含子。
图3为pSG-BaPDS和pCC重组质粒的凝胶电泳图，其中，M表示DL15000的marker。
图4为用于芥蓝遗传转化的CRISPR/Cas9双元载体结构图。
图5为芥蓝植株PDS基因沉默的潮霉素抗性基因检测图，其中，M：DL2000marker；V1、V2：空载；N：水；W(野生型WT)：阴性对照；P(重组质粒)：阳性对照；1-75：抗性株系编号。
图6为芥蓝PDSs基因沉默的表型图，其中，A为野生型植株；B为转空载植株；C为PDS1和PDS2双突植株；D为PDS1单突植株；E为PDS2单突植株。
图7为转基因芥蓝植株测序分析图，其中，A、B为PDS1基因突变；C、D为PDS2基因突变；斜体表示靶序列，下划线表示PAM序列，灰色字体表示碱基的突变，短线代表缺失的碱基，省略号表示省略碱基之间的间距；i代表碱基插入，d代表碱基缺失，r代表碱基替换，后面的数字代表插入、缺失或替换的碱基数目；括号内的数字代表具有相同突变的株系的数量。
具体实施方式
一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，包括：芥蓝同一基因家族不同成员的共同靶序列的选择，根据选定的靶序列来合成一对互补的Oligo序列，接着再进行连接、转化反应，得重组质粒，该重组质粒再与pCC质粒进行双酶切，回收目的条带，然后将这两个目的条带进行连接，构建CRISPR/Cas9表达载体，最后采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因突变植株。，其流程图见图1。
对于芥蓝中所有基因家族多个成员的突变体的制备都可以采用本发明方法进行制备，下面我们以芥蓝PDS基因家族为例来进行描述，其具体过程如下：
实施例1芥蓝PDSs基因靶序列的选择
因在现有技术中利用CRISPR/Cas9系统敲除芥蓝植物体内多基因的方式大都是选择几个不同的靶位点逐一进行敲除，这种操作费时又费力，成本很高。而本发明通过筛选同一基因家族中不同成员的共同靶序列，为后续一次转化便可同时敲除植物体内多个基因提供前提条件，因此，对同一基因家族中不同成员的共同靶序列的筛选非常重要。
芥蓝PDS基因家族具有BaPDS1和BaPDS2两个成员，通过克隆，获得了BaPDS1和BaPDS2两个基因的CDS全长，利用CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)在线软件分析这两个基因的靶位点，筛选共同靶序列。
筛选过程必须遵循一定的标准才能获得有效的共同靶序列，具体为：在筛选时，应选择高度保守、一致的序列作为同一基因家族多个成员的共同靶序列，共同靶序列不超过5个碱基的错配，优选没有碱基错配的序列作为共同靶序列。筛选的靶序列要求突变得分较高、脱靶得分较低、GC含量在50％-70％、靶点序列内不存在连续4个T、能够响应U6启动子的在该基因的外显子上的20bp靶序列，再加上3’端高度特异NGG(即PAM)作为CRISPR靶序列。
根据上述要求，分别在BaPDS1和BaPDS2两个基因的第4个外显子上筛选出两个基因的共同靶位点，即为GATGGAGATTGGTATGAAACCGG，含PAM序列(图2)，通过筛选结果可知，筛选的靶序列没有任何碱基发生错配，两个基因的共同靶序列完全匹配。
实施例2芥蓝CRISPR/Cas9表达载体的构建
芥蓝CRISPR/Cas9表达载体的构建过程，具体包括以下步骤：
1、靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA序列，并在其5’端分别添加酶切位点CACC和AAAC，然后退火复性，得到具有粘性末端的DNA双链序列。其中，退火复性的反应程序为：95℃变性5min，1℃30s，降温至25℃，4℃保存。
2、pSG载体的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体，酶切过程为37℃反应过夜，接着65℃反应20min，然后对酶切产物进行回收。
3、连接和转化：将回收后的酶切产物与退火复性后的DNA双链序列进行连接，连接过程为16℃反应30min后，置于4℃反应过夜，接着转化大肠杆菌感受态细胞，再进行涂板，最后挑取单菌落进行震荡培养，并对菌液进行PCR鉴定，以确保该基因重组质粒的sgRNA片段完全正确。经PCR扩增后，可知扩增出与预期大小相近的条带，由此可知，成功构建了pSG-BaPDS重组质粒。
4、重组质粒和pCC质粒的双酶切：使用EcoRI-HF和XbaI内切酶，将构建好的pSG-BaPDS重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，双酶切过程为：37℃酶切3h后，置于65℃反应20min。然后回收酶切产物(430bp和14060bp)(图3)。
5、连接、转化和鉴定：将步骤4获得的酶切产物进行连接，即将sgRNA插入pCC载体的多克隆位点处，与pCC融合形成pCC-Target-sgRNA载体(图4)，最后转化农杆菌感受态GV3101，再进行涂板，挑取单菌落进行PCR鉴定。最后将构建成功的芥蓝BaPDS-CRISPR/Cas9表达载体保存于甘油中，-80℃贮藏，备用。
上述所用转基因的质粒为pCAMBIA1302；pCC质粒是将源于pX330载体的Cas9序列通过重组技术替换pCAMBIA1302中mgfp序列后得到的重组质粒；pSG质粒是在pUC载体的多克隆位点区插入源于pX330载体的sgRNA序列，得到重组质粒。
实施例3农杆菌介导的遗传转化
农杆菌介导的遗传转化过程依次包括以下过程：
1、无菌苗的培养：将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上，生长7天；M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，且pH值为5.8。
2、预培养：切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上，生长4天；M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，且pH值为5.8。
3、农杆菌菌液的制备：取-80℃保存的芥蓝BaPDS-CRISPR/Cas9表达载体，划线于含抗生素的LB或YEB固体培养基上，再挑取单克隆于含抗生素的YEB或LB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养24h，PCR检测阳性克隆，后以1:100的比例放大培养，取获得的菌液离心收菌，用等体积的MS液体培养基悬浮后用于浸染。
4、共培养：用活化好的农杆菌菌液浸染预培养后的带柄子叶，再将其转入M3培养基上，暗培养3天；M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，且pH值为5.8。
5、延迟筛选：将共培养后的叶片转入M4培养基上，培养一周；M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，且pH值为5.8。
6、抗性筛选：将步骤5所得物转入M5培养基进行培养，待不定芽长至3-4cm高进行下一个步骤；M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B 10-15mg/L，且pH值为5.8。
7、继代培养：生长在抗性培养基上的外植体及长出的抗性芽，每隔20天继代一次(继代培养所用培养基为M5培养基)，待不定芽长到3-4cm高转入下个步骤；
8、生根培养：将步骤7所得物转入M6培养基中进行生根培养，待根系长达3-5cm时即可进行炼苗移栽。M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B 10-15mg/L，且pH值为5.8。
对上述所得转基因突变植株进行表型鉴定和分子检测，表型鉴定是根据突变基因的功能，直接观察转基因突变植株的表型变化或测定其相应指标；分子检测是提取其染色体组DNA，根据载体上所含的抗性基因的序列设计特异性引物，使用特异性引物进行PCR扩增，并进行电泳检测，筛选转基因阳性植株，再以每一个转基因阳性植株的DNA为模板，根据靶序列设计特异性引物进行PCR扩增，并测序，统计其突变率，具体过程如下：
实施例4转基因突变植株的表型鉴定和分子检测
1、表型鉴定：
八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase，PDS)是类胡萝卜素合成途径中的重要限速酶，位于叶绿体的类囊体膜上，对叶绿体起到一种特殊的保护作用。当编码该蛋白的基因被沉默，导致叶绿素降解，会使富含叶绿素的叶片等组织斑驳、褪色、黄化甚至变成白色。观察BaPDS转基因沉默植株是否存在白化表型，并统计白化结果。
2、分子检测：
先提取抗生素培养基上筛选出的抗性植株的染色体组DNA，根据载体上所含的潮霉素抗性基因设计特异性引物，使用特异性引物Hyg-F和Hyg-R(表1)进行PCR扩增，并进行电泳检测，筛选转基因阳性植株，统计转化率。再以筛选到的每一个转基因阳性植株的DNA为模板，根据靶序列设计特异性引物，分别使用针对BaPDS1基因的特异性引物BaPDS1-CRISPR test-F，BaPDS1-CRISPRtest-R和针对BaPDS2基因的特异性引物BaPDS2-CRISPR test-F，BaPDS2-CRISPR test-R(表1)进行PCR扩增，并测序PCR扩增产物，与野生型序列比对，统计其突变率。
表1分子检测中所用的引物
统计结果：
1、CRISPR/Cas9系统介导的芥蓝转化频率和转化率的统计
通过上述制备方法，我们从大约5000个外植体上成功获得了75株转基因突变植株，转化频率约1.5％。分别提取已获得的这75株转化植株的总DNA，使用特异引物Hyg-F和Hyg-R(表1)进行PCR扩增，发现质粒(阳性对照)及68株转化植株均扩增出558bp的目的条带，而水、野生型植株(阴性对照)和剩余7株转化植株(株系2、5、15、18、28、32、49)未扩增出任何条带，表明这7个株系为假阳性，目标片段已转到其余68株芥蓝植株中，计算CRISPR/Cas9表达载体对芥蓝的转化率为90.67％(图5)。
2、CRISPR/Cas9系统介导的BaPDS基因突变率的统计
对上述获得的68个转基因阳性植株测序，统计其突变率。研究结果表明：PDS1和PDS2双突的有14株，PDS1、PDS2单突的分别有10株、28株，其突变率分别为20.59％、14.70％、41.18％(见表2)，其中出现双突的比例大约为1/5，出现单突的比例超过一半，表明CRISPR/Cas9系统诱导的基因编辑在芥蓝上有较高的突变效率。
表2CRISPR/Cas9介导的在芥蓝植株上突变率的统计
3、CRISPR/Cas9介导BaPDS基因沉默后的表型及突变情况分析
通过农杆菌介导的遗传转化法，已成功获得BaPDSs基因沉默的芥蓝植株。与野生型和转化空载植株相比较，所有的突变植株均表现出了明显的白化表型。同时，PDS1和PDS2靶位点双突变植株的叶片完全白化，而单独的PDS1或PDS2靶位点突变植株只有部分叶片发生了白化，说明BaPDS基因的功能已全部或部分被扰乱，CRISPR/Cas9系统在芥蓝植物上具有同时沉默同一基因家族多个成员的能力(图6)。
4、BaPDS1基因突变情况的分析
通过检测CRISPR/Cas9系统介导的在芥蓝体内沉默BaPDS1基因的能力，结果发现，在上述测序的68个转基因阳性植株中，有24株表现为BaPDS1基因的突变。在这24个BaPDS1基因突变的转基因株系中，发现其中有18株其突变发生在靶位点上，以1-7个碱基的替换为主，其中的17株在靶位点的第12个碱基处由G替换为A，使得Trp变成了终止子，剩余的1株在靶位点第15个碱基处由T替换为G，使Tyr变成了终止子，提前终止了翻译的进行。另外，在剩余的6个BaPDS1突变植株中，发现在BaPDS1基因的第三个内含子上发生了10bp(ATTAATATAT)的插入(图7A、B)。
5、BaPDS2基因突变情况的分析
通过检测CRISPR/Cas9系统介导的在芥蓝体内BaPDS2基因沉默的能力，结果发现在已测序的68个转基因株系中，有42株表现为BaPDS2基因的突变，其中有11株突变发生在目标位点上，以1-6个碱基的替换为主，同时也有个别碱基的缺失发生，如株系16在靶位点后第一个碱基处发生了1碱基的缺失，造成了移码突变，使得BaPDS2基因的第4第5外显子上的核苷酸发生变化，最终在第5外显子上出现了终止子，终止了翻译的进行，其余的株系在不同的位点均发生了碱基的替换，引起对应的氨基酸发生了变化。然而，剩余的33个PDS2转基因株系其突变是在BaPDS2基因的第3个和第4个内含子上分别发生了2bp(TA和AG)的缺失，同时也有个别碱基的替换发生，其中绝大部分是前后同时缺失(31/33)(图7C、D)。
综上所述，通过本发明方法，获得了68个转基因阳性植株，得到了高达76.47％的突变率(见表2)和90.76％的转化效率(见图5)。由Sanger测序发现CRISPR/Cas9系统在芥蓝植物上可同时敲除BaPDS1和BaPDS2两个基因家族成员，导致BaPDS基因的功能完全丧失，使突变植株均产生明显的白化表型(图6)。同时，通过该方法，可获得大量的单突突变体和双突变体材料，为该基因的功能研究提供了依据。