使植物具有除草剂抗性的ACCase突变型蛋白及其应用的制作方法

文档序号：15089393发布日期：2018-08-04 13:03阅读：179来源：国知局

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及使植物具有除草剂抗性的accase突变型蛋白及其应用；具体而言，本发明涉及水稻的乙酰辅酶a羧化酶(accase)突变蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该突变蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术：

农田杂草是导致农作物减产的最主要原因之一。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的防除农田杂草最高效的、简便的和经济的治理方法。

乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-coacarboxylase，简称accase)是植物代谢过程中催化植物脂肪酸合成的关键酶，是1958年发现的除草剂的一个作用靶标。accase属于生物素包含酶(biotincontainingenzyme)的类型i(typei)，存在于大多数的生物体中，主要包含细菌、酵母、真菌、植物、动物和人类中。目前已经确定在植物体内有两种同工型的accase，主要位于质体和细胞溶胶中，它们的功能区域在结构上有很大的差别。大多数植物质体中的accase有4个亚基：一个生物素羧基载体蛋白亚基(biotincarboxylcarrier-protein，bccp)，一个生物素羧化酶亚基(biotincarboxylase，bc)，羧基转移酶(carboxyltransferase，ct)的两个亚基ctα和ctβ，二者之间以共价键相连。大多数植物细胞溶胶中的accase于酵母、大鼠和人的属于同一类型，它的一条多肽链包含着原核型accase所有的4个亚基，排列顺序是bc、bccp、ctβ、ctα，形成了3个功能域(ctβ和ctα算一个功能域)。除草剂对accase的抑制主要是通过抑制ct，造成酰基脂类生物合成受到抑制，影响细胞膜渗透性，造成代谢产物渗漏，致使植物死亡，从而达到防除禾本科杂草的目的。

accase类除草剂包括芳氧苯氧丙酸酯类(aryloxyphenoxypropanoates，app)、肟醚类环己二酮(cyclohexanedioneoximes，chd)和苯基吡唑啉类(phenylpyrazoline,den)三类。由于其选择性高，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草，且在植物体内传导，具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，此类除草剂迅速发展、品种不断增多、使用面积迅速扩大，已成为世界第三类重要除草剂。

accase催化乙酰-coa生成丙二酰-coa，该反应是脂肪酸全合成的第一个关键步骤，也是限速步骤，这步由accase催化的反应实际上是由3个亚基组成的两步反应。第一步，首先由atp提供能量给重碳酸，产生活化的羧基(羧酸、磷酸复合物)，然后在bc作用下将羧基连接到bccp中生物素的脲环n1上，形成羧化的生物素羧基载体蛋白，该过程中由mg2+或者mn2+等的参与，碳酸氢盐为羧基供体。第二步，在ct作用下，将生物素脲环n1上的羧基转移至乙酰-coa的甲基，产生丙二酰-coa，该过程不需要其他的辅助能量。合成的丙二酰-coa参与脂肪酸从头合成等生物过程。

accase有两类主要的抑制剂类型，包括芳氧笨氧丙酸酯类(app)和环己二酮类(chd)，已开发出多个除草剂品种，如禾草灵、盖草能、炔草酯、本草酮、烯草酮等等。早在20世纪60-70年代，app类和chd类除草剂就被广泛用于农田禾本科杂草，但是随着长期和大面积的使用，杂草很快对这两种除草剂产生了抗性，目前，已在26个国家发现了高达35种杂草对这两类抑制剂产生了抗性。

但目前，accase抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测accase蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现accase蛋白新的除草剂抗性位点。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻accase突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了编码水稻accase突变型蛋白的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有上述的水稻accase突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性植物的方法。具体地，用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰accase酶的活性。因此，本文中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过化学诱变或基因定点突变的方式获得，是改变的植株具有本发明的核苷酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9中的任意一种，所述的突变后的植株具有一种或者一种以上的上述突变后的核苷酸序列。

本发明人通过长期、艰苦的研究，对野生型水稻品种镇糯19(从江苏丘陵地区镇江农业科学研究所获得)进行ems诱变处理，对这些的ems突变植株进行长期、不断地筛选，发现了一系列accase突变蛋白，包括前文所述的某些已知accase突变蛋白和新accase突变蛋白，其对accase抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有accase抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种水稻accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或几种突变：其对应于水稻accase的氨基酸序列的第1792位、第2015位、第2038位、第2052位、第2089位发生突变。

作为优选，本发明在水稻accase的氨基酸序列的第1792位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸、第2015位基酸由丙氨酸突变为缬氨酸、第2038位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸、第2052位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬酰胺、第2089位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。

本发明的accase突变型蛋白发生突变的氨基酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内例如：第1792位氨基酸由异亮氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸；第2015位基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸；第2038位氨基酸由色氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸；第2052位氨基酸由异亮氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、第2089位氨基酸由天冬氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸。

本发明的内容还包括一种水稻accase突变型蛋白，包括：

(a)其氨基酸序列如seqidno.2或seqidno.4或seqidno.6或seqidno.8或seqidno.10所示；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰辅酶a羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的内容还包括核酸或基因，其编码所述的蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(a)其编码所述的蛋白；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(c)其核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:3或seqidno:5或seqidno:7或seqidno:9所示。

所述严格条件为：在0.1×ssc、0.1％sds的溶液中，65℃洗膜15分钟的高度严谨的杂交条件。

本发明的accase突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他核苷酸情况也在本发明的保护范围之内例如：a突变为t、c、g；或c突变为t、a、g；或t突变为a、c、g；或g突变为t、c、a等等均在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种或几种突变：在水稻accase基因的第5374位核苷酸、在水稻accase基因的第6044位核苷酸、在水稻accase基因的第6114位核苷酸、在水稻accase基因的第6155位核苷酸、在水稻accase基因的第6266位核苷酸发生突变。

作为优选，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种或几种突变：在水稻accase基因的第5374位核苷酸由a突变为t，在水稻accase基因的第6044位核苷酸由c突变为t，在水稻accase基因的第6114位核苷酸由g突变为t，在水稻accase基因的第6155位核苷酸由t突变为a，在水稻accase基因的第6266位核苷酸由a突变为g。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。

本发明内容还包括所述的水稻accase突变型蛋白、核酸或基因，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

其中，上述除草剂是喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或几种。

本发明内容还包括获得具有除草剂抗性植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述的核酸或基因；或

2)使植物表达所述的水稻accase突变型蛋白。

所述的方法，其包括crispr基因编辑、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明内容还包括鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸或基因的植物、表达所述的蛋白的植物或所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明内容还包括一种除草剂的防护剂，该防护剂由所述的水稻accase突变型蛋白制成。

本发明内容还包括一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或几种。

本发明内容还包括一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或几种。

进一步地，本发明的野生型基因来源于水稻的镇糯19。

进一步地，本发明的镇糯19的突变植株具有喹禾灵除草剂抗性，本发明的镇糯19突变植株的突变型基因的核苷酸序列或者氨基酸序列在植物中表达时能赋予水稻植物增加对乙酰辅酶a羧化酶类除草剂的耐受性。

进一步地，本发明通过对镇糯19进行突变分别获得了具备除草剂抗性的水稻植株accase-5374突变体、accase-6044突变体、accase-6114突变体、accase-6155突变体、accase-6266突变体，该五个植株分别保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。

其中，本发明的镇糯19的突变型基因序列的编号及其对应的核苷酸和氨基酸序列分别是：将在镇糯19的accase基因的第5374位核苷酸由a突变为t的突变体命名为accase-5374突变体，accase-5374突变体的accase基因其核苷酸序列如seqidno:1所示，其氨基酸序列如seqidno:2所示；

其中，将在镇糯19的accase基因的第6044位核苷酸由c突变为t的突变体命名为accase-6044突变体，accase-6044突变体的accase基因其核苷酸序列如seqidno:3所示，其氨基酸序列如seqidno:4所示；

其中，将在镇糯19的水稻accase基因的第6114位核苷酸由g突变为t的突变体命名为accase-6114突变体，accase-6114突变体accase基因其核苷酸序列如seqidno:5所示，其氨基酸序列如seqidno:6所示；

其中，将在镇糯19的水稻accase基因的第6155位核苷酸由t突变为a的突变体命名为accase-6155突变体，accase-6155突变体accase基因其核苷酸序列如seqidno:7所示，其氨基酸序列如seqidno:8所示；

其中，将在镇糯19的水稻accase基因的第6266位核苷酸由a突变为g的突变体命名为，accase-6266突变体，accase-6266突变体的accase基因其核苷酸序列如seqidno:9所示，其氨基酸序列如seqidno:10所示；

其中，镇糯19野生型accase基因核苷酸序列如seqidno:11所示，其氨基酸序列如seqidno:12所示。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)本发明首次通过随机突变的方式获得了具备除草剂抗性的水稻植株accase-5374突变体、accase-6044突变体、accase-6114突变体、accase-6155突变体、accase-6266突变体，该植株分别保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。

2)在田间喷施accase抑制剂类除草剂喹禾灵的实验结果表明，含有本发明的水稻accase突变蛋白的水稻三叶期幼苗在施用2倍推荐使用浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻幼苗在施用1倍推荐使用浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡。

附图说明

图1喹禾灵除草剂筛选获得的抗性水稻突变体；

图2pcr扩增5个水稻抗除草剂突变体的accase基因全长结果图；第1泳道为marker；marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、1kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为野生型镇糯19的dna，第3泳道为抗除草剂突变植株(accase-5374突变体)的dna，第4泳道为抗除草剂突变植株(accase-6044突变体)的dna，第5泳道为抗除草剂突变植株(accase-6114突变体)的dna，第6泳道为抗除草剂突变植株(accase-6155突变体)的dna，第7泳道为抗除草剂突变植株(accase-6266突变体)的dna。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：水稻抗喹禾灵除草剂突变体获取过程

将镇糯19号(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所惠赠)(此为m0，用清水浸泡2小时)120kg分6次用0.4-0.6％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去ems溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为m1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为m2)幼苗长至三叶期时，喷施为3ml喹禾灵/l水(推荐最低使用浓度为1.5ml喹禾灵/1l水)，1个月后还呈正常绿色、且能正常生长的植株即为抗喹禾灵除草剂的水稻突变植株(图1)。共计获得抗除草剂的m2单株28株，这些抗性单株进行常规肥水管理，均可正常结实，种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。我们对上述获得的28株m2进行单株收获，并进行种植m3种子。

实施例2：水稻镇糯19号野生型accase全长基因的获得

选取镇糯19号野生型植株的叶片，提取基因组dna，根据ncbi中日本晴accase基因(ncbi：xm_015783727)设计引物进行扩增，采用koddnapolymerase聚合酶(购自toyobo公司)扩增accase基因，其反应体系如下：

10×buffer5.0μl

10μm正向引物(gtcagatttcacacatctggggat)1.0μl

10μm反向引物(acttgcactttcatctggcagaac)1.0μl

20-30ng/μl水稻镇糯19号基因组dna1.0μl

2mmdntp2.0μl

25mmmgso42.0μl

koddnapolymerase聚合酶(1u/μl)1.0μl

补加无菌水至总体积50μl

pcr扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：94℃3min；35个循环：变性94℃10sec；延伸68℃10min；保温：72℃10min。

取2μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的pcr产物经pcr清洁试剂盒(购自axygen公司)清洁回收后，克隆至pmd19-t载体(购自takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行pcr检测，取pcr结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得突变accase基因序列，该基因片段长度为13127bp，通过去除内含子后获得基因全长6984bp，镇糯19野生型accase序列全长基因片段的测序结果如下：

atgacatccacacatgtggcgacattgggagttggtgcccaggcacctcctcgtcaccagaaaaagtcagctggcactgcatttgtatcatctgggtcatcaagaccctcataccgaaagaatggtcagcgtactcggtcacttagggaagaaagcaatggaggagtgtctgattccaaaaagcttaaccactctattcgccaaggtcttgctggcatcattgacctcccaaatgacgcagcttcagaagttgatatttcacatggttccgaagatcccagggggcctacggtcccaggttcctaccaaatgaatgggattatcaatgaaacacataatgggaggcatgcttcagtctccaaggttgttgagttttgtacggcacttggtggcaaaacaccaattcacagtgtattagtggccaacaatggaatggcagcagctaagttcatgcggagtgtccgaacatgggctaatgatacttttggatcagagaaggcaattcagctgatagctatggcaactccggaggatctgaggataaatgcagagcacatcagaattgccgatcaatttgtagaggtacctggtggaacaaacaacaacaactatgcaaatgtccaactcatagtggagatagcagagagaacaggtgtttctgctgtttggcctggttggggtcatgcatctgagaatcctgaacttccagatgcgctgactgcaaaaggaattgtttttcttgggccaccagcatcatcaatgcatgcattaggagacaaggttggctcagctctcattgctcaagcagctggagttccaacacttgcttggagtggatcacatgtggaagttcctctggagtgttgcttggactcaatacctgatgagatgtatagaaaagcttgtgttactaccacagaggaagcagttgcaagttgtcaggtggttggttatcctgccatgattaaggcatcttggggtggtggtggtaaaggaataaggaaggttcataatgatgatgaggttaggacattatttaagcaagttcaaggcgaagtacctggttccccaatatttatcatgaggctagctgctcagagtcgacatcttgaagttcagttgctttgtgatcaatatggcaacgtagcagcacttcacagtcgagattgcagtgtacaacggcgacaccaaaagataatcgaggaaggaccagttactgttgctcctcgtgagactgtgaaagagcttgagcaggcagcacggaggcttgctaaagctgtgggttatgttggtgctgctactgttgaatacctttacagcatggaaactggtgaatattattttctggaacttaatccacggctacaggttgagcatcctgtcactgagtggatagctgaagtaaatttgcctgcggctcaagttgctgttggaatgggtatacccctttggcagattccagagatcaggcgcttctacggaatgaaccatggaggaggctatgacctttggaggaaaacagcagctctagcgactccatttaactttgatgaagtagattctaaatggccaaaaggccactgcgtagctgttagaataactagcgaggatccagatgatgggtttaagcctactggtggaaaagtaaaggagataagtttcaagagtaaaccaaatgtttgggcctatttctcagtaaagtctggtggaggcatccatgaattcgctgattctcagttcggacatgtttttgcgtatggaactactagatcggcagcaataactaccatggctcttgcactaaaagaggttcaaattcgtggagaaattcattcaaacgtagactacacagttgacctattaaatgcctcagattttagagaaaataagattcatactggttggctggataccaggatagccatgcgtgttcaagctgagaggcctccatggtatatttcagtcgttggaggggctttatataaaacagtaactgccaacacggccactgtttctgattatgttggttatcttaccaagggccagattccaccaaagcatatatcccttgtctatacgactgttgctttgaatatagatgggaaaaaatatacaatcgatactgtgaggagtggacatggtagctacagattgcgaatgaatggatcaacggttgacgcaaatgtacaaatattatgtgatggtgggcttttaatgcagctggatggaaacagccatgtaatttatgctgaagaagaggccagtggtacacgacttcttattgatggaaagacatgcatgttacagaatgaccatgacccatcaaagttattagctgagacaccatgcaaacttcttcgtttcttggttgctgatggtgctcatgttgatgctgatgtaccatatgcggaagttgaggttatgaagatgtgcatgcccctcttatcacccgcttctggtgtcatacatgttgtaatgtctgagggccaagcaatgcaggctggtgatcttatagctaggctggatcttgatgacccttctgctgttaagagagctgagccgttcgaagatacttttccacaaatgggtctccctattgctgcttctggccaagttcacaaattatgtgctgcaagtctgaatgcttgtcgaatgatccttgcggggtatgagcatgatattgacaaggttgtgccagagttggtatactgcctagacactccggagcttcctttcctgcagtgggaggagcttatgtctgttttagcaactagacttccaagaaatcttaaaagtgagttggagggcaaatatgaggaatacaaagtaaaatttgactctgggataatcaatgatttccctgccaatatgctacgagtgataattgaggaaaatcttgcatgtggttctgagaaggagaaggctacaaatgagaggcttgttgagcctcttatgagcctactgaagtcatatgagggtgggagagaaagtcatgctcactttgttgtcaagtccctttttgaggagtatctctatgttgaagaattgttcagtgatggaattcagtctgatgtgattgagcgtctgcgccttcaacatagtaaagacctacagaaggtcgtagacattgtgttgtcccaccagagtgttagaaataaaactaagctgatactaaaactcatggagagtctggtctatccaaatcctgctgcctacagggatcaattgattcgcttttcttcccttaatcacaaagcgtattacaagttggcacttaaagctagtgaacttcttgaacaaacaaaacttagtgagctccgtgcaagaatagcaaggagcctttcagagctggagatgtttactgaggaaagcaagggtctctccatgcataagcgagaaattgccattaaggagagcatggaagatttagtcactgctccactgccagttgaagatgcgctcatttctttatttgattgtagtgatacaactgttcaacagagagtgattgagacttatatagctcgattataccagcctcatcttgtaaaggacagtatcaaaatgaaatggatagaatcgggtgttattgctttatgggaatttcctgaagggcattttgatgcaagaaatggaggagcggttcttggtgacaaaagatggggtgccatggtcattgtcaagtctcttgaatcactttcaatggccattagatttgcactaaaggagacatcacactacactagctctgagggcaatatgatgcatattgctttgttgggtgctgataataagatgcatataattcaagaaagtggtgatgatgctgacagaatagccaaacttcccttgatactaaaggataatgtaaccgatctgcatgcctctggtgtgaaaacaataagtttcattgttcaaagagatgaagcacggatgacaatgcgtcgtaccttcctttggtctgatgaaaagctttcttatgaggaagagccaattctccggcatgtggaacctcctctttctgcacttcttgagttggacaagttgaaagtgaaaggatacaatgaaatgaagtataccccatcacgggatcgtcaatggcatatctacacacttagaaatactgaaaaccccaaaatgttgcaccgggtatttttccgaacccttgtcaggcaacccagtgtatccaacaagttttcttcgggccagattggtgacatggaagttgggagtgctgaagaacctctgtcatttacatcaaccagcatattaagatctttgatgactgctatagaggaattggagcttcacgcaattagaactggccattcacacatgtatttgcatgtattgaaagaacaaaagcttcttgatcttgttccagtttcagggaatacagttttggatgttggtcaagatgaagctactgcatattcacttttaaaagaaatggctatgaagatacatgaacttgttggtgcaagaatgcaccatctttctgtatgccaatgggaagtgaaacttaagttggactgcgatggtcctgccagtggtacctggaggattgtaacaaccaatgttactagtcacacttgcactgtggatatctaccgtgagatggaagataaagaatcacggaagttagtataccatcccgccactccggcggctggtcctctgcatggtgtggcactgaataatccatatcagcctttgagtgtcattgatctcaaacgctgttctgctaggaataatagaactacatactgctatgattttccactggcatttgaaactgcagtgaggaagtcatggtcctctagtacctctggtgcttctaaaggtgttgaaaatgcccaatgttatgttaaagctacagagttggtatttgcggacaaacatgggtcatggggcactcctttagttcaaatggaccggcctgctgggctcaatgacattggtatggtagcttggaccttgaagatgtccactcctgaatttcctagtggtagggagattattgttgttgcaaatgatattacgttcagagctggatcatttggcccaagggaagatgcattttttgaagctgttaccaacctagcctgtgagaagaaacttcctcttatttatttggcagcaaattctggtgctcgaattggcatagcagatgaagtgaaatcttgcttccgtgttgggtggtctgatgatggcagccctgaacgtgggtttcagtacatttatctaagcgaagaagactatgctcgtattggcacttctgtcatagcacataagatgcagctagacagtggtgaaattaggtgggttattgattctgttgtgggcaaggaagatggacttggtgtggagaatatacatggaagtgctgctattgccagtgcttattctagggcatataaggagacatttacacttacatttgtgactggaagaactgttggaataggagcttatcttgctcgacttggcatccggtgcatacagcgtcttgaccagcctattattcttacaggctattctgcactgaacaagcttcttgggcgggaagtgtacagctcccacatgcagttgggtggtcccaaaatcatggcaactaatggtgttgtccatcttactgtttcagatgaccttgaaggcgtttctaatatattgaggtggctcagttatgttcctgcctacattggtggaccacttccagtaacaacaccgttggacccaccggacagacctgttgcatacattcctgagaactcgtgtgatcctcgagcggctatccgtggtgttgatgacagccaagggaaatggttaggtggtatgtttgataaagacagctttgtggaaacatttgaaggttgggctaagacagtggttactggcagagcaaagcttggtggaattccagtgggtgtgatagctgtggagactcagaccatgatgcaaactatccctgctgaccctggtcagcttgattcccgtgagcaatctgttcctcgtgctggacaagtgtggtttccagattctgcaaccaagactgcgcaggcattgctggacttcaaccgtgaaggattacctctgttcatcctcgctaactggagaggcttctctggtggacaaagagatctttttgaaggaattcttcaggctggctcgactattgttgagaaccttaggacatacaatcagcctgcctttgtctacattcccatggctgcagagctacgaggaggggcttgggttgtggttgatagcaagataaacccagaccgcattgagtgctatgctgagaggactgcaaaaggcaatgttctggaaccgcaagggttaattgagatcaagttcaggtcagaggaactccaggattgcatgagtcggcttgacccaacattaattgatctgaaagcaaaactcgaagtagcaaataaaaatggaagtgctgacacaaaatcgcttcaagaaaatatagaagctcgaacaaaacagttgatgcctctatatactcagattgcgatacggtttgctgaattgcatgatacatccctcagaatggctgcgaaaggtgtgattaagaaagttgtggactgggaagaatcacgatctttcttctataagagattacggaggaggatctctgaggatgttcttgcaaaagaaattagagctgtagcaggtgagcagttttcccaccaaccagcaatcgagctgatcaagaaatggtattcagcttcacatgcagctgaatgggatgatgacgatgcttttgttgcttggatggataaccctgaaaactacaaggattatattcaatatcttaaggctcaaagagtatcccaatccctctcaagtctttcagattccagctcagatttgcaagccctgccacagggtctttccatgttactagataagatggatccctctagaagagctcaacttgttgaagaaatcaggaaggtccttggttga

实施例3：抗喹禾灵除草剂水稻突变体分子水平鉴定

上述实施例1获得的所有抗除草剂水稻突变植株中，选取多个突变植株的叶片和镇糯19号野生型植株的叶片，分别提取基因组dna，并用accase-f(gtcagatttcacacatctggggat)和accase-r(acttgcactttcatctggcagaac)分别进行pcr扩增。pcr扩增条件与扩增体系同实施例2，测序结果发现：与实施例2的野生型植株相比，我们总共获得了五个水稻突变体，上述抗除草剂的水稻突变体在accase基因序列上都发生突变。具体的突变内容如下：

accase-5374突变体的accase基因序列，其核苷酸序列的第5374位核苷酸由a突变为t，导致其编码的氨基酸序列的第1792位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其核苷酸序列如seqidno:1所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:2所示；

accase-6044突变体的accase基因序列，其核苷酸序列的第6044位核苷酸由c突变为t，导致其编码的氨基酸序列的第2015位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，其核苷酸序列如seqidno:3所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:4所示；

accase-6114突变体的accase基因序列，其核苷酸序列的第6114位核苷酸由g突变为t，导致其编码的氨基酸序列的第2038位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸，其核苷酸序列如seqidno:5所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:6所示；

accase-6155突变体的accase基因序列，其核苷酸序列第6155位由t突变为a，导致其编码的氨基酸序列的第2052位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬酰胺，其核苷酸序列如seqidno:7所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:8所示；

accase-6266突变体的accase基因序列，其核苷酸序列第6266位由a突变为g，导致其编码的氨基酸序列第2089位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:9所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:10所示。

本发明的accase-5374突变体其分类命名为水稻种子zhen19-21(oryzasativajaponicagroupzhen19-21)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201803。

本发明的accase-6044突变体其分类命名为水稻种子zhen19-60(oryzasativajaponicagroupzhen19-60)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201804。

本发明的accase-6114突变体其分类命名为水稻种子zhen19-26(oryzasativajaponicagroupzhen19-26)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201805。

本发明的accase-6155突变体其分类命名为水稻种子zhen19-38(oryzasativajaponicagroupzhen19-38)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201806。

本发明的accase-6266突变体其分类命名为水稻种子zhen19-7(oryzasativajaponicagroupzhen19-7)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201807。

实施例4抗喹禾灵除草剂水稻突变体后代乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的抗性

将实施例3中鉴定为纯合突变体的五种突变体水稻株系收种，并播种，待水稻长至三叶期时，分别喷施乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用1.5ml喹禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟氯禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为施用1.5ml烯草酮/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟禾草灵/l水(1倍推荐使用浓度))，喷施一个月后调查枯死情况，发现野生型对照在喷施和以上同样浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵后，几乎停止生长，新长出来的叶片完全枯黄，并逐渐枯死。而我们筛选到的不同位点的抗除草剂突变体阳性苗则全部对乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂表现出抗的表型，其正常的生长发育几乎没有受到影响，最终正常拔节抽穗。表1中显示本发明五种突变体水稻对accase抑制性除草剂的抗性比野生型要高，伤害百分比要低60％以上。这表明我们筛选到的抗除草剂突变体确实能够稳定遗传的获得抗乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。

表1乙酰辅酶a羧化酶类除草剂对水稻野生型和突变体的伤害比率

同时，我们将鉴定为纯合突变体的五种突变体水稻株系收种，并播种，待水稻长至三叶期时，喷施乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用3ml喹禾灵/l水(2倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为3ml吡氟氯禾灵/l水(2倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为3ml烯草酮/l水(2倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度3m吡氟禾草灵/l水(2倍推荐使用浓度))，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻幼苗在施用乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用1.5ml喹禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为1.5ml吡氟氯禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为1.5ml烯草酮/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度1.5ml吡氟禾草灵/l水(1倍推荐使用浓度))，后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡。

实施例5抗性材料的两两杂交

为了检测是否具有双重突变位点的抗性植株会比具有单位点抗性植株的除草剂耐受能力更强，我们将实施例3中获得的具有不同突变位点的抗性植株进行两两杂交。选择accase-5374突变体株系m021(序列对应seqidno:1)、accase-6044突变体株系m098(序列对应seqidno:3)和accase-6144突变体株系m138(序列对应seqidno:5)，将这三个株系在温室中种植，开花期将m021与m098、m021与m138、m098与m138分别进行杂交。具体方法是：将母本人工去雄并套袋，父本植株开花的时候，将父本花药中的花粉抖出，授粉到母本柱头上，重复两次，带种子成熟后收种，为f1带杂交种。收获的f1代杂交种繁殖一代，收获f2代群体，m021与m098杂交f2代群体中鉴定带有纯合的accase-5374和accase-6044突变的植株；m021和m138杂交的f2群体中鉴定带有纯合accase-5374和accase-6144突变的植株；m098和m138杂交的f2群体中鉴定带有纯合accase6044和accase-6144突变的植株。待以上杂交水稻植株长至三叶期时，喷施乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用1.5ml喹禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟氯禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为施用1.5ml烯草酮/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟禾草灵/l水(1倍推荐使用浓度))，结果表明，同时突变两个位点的植株相对于只有一个突变位点的植株，对除草剂的抗性得到了明显的提高(表2)。

表2乙酰辅酶a羧化酶类除草剂对水稻野生型和突变体的伤害比率

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>使植物具有除草剂抗性的accase突变型蛋白及其应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6984

<212>dna

<213>水稻种子zhen19-21(oryzasativajaponicagroupzhen19-21)

<400>1

atgacatccacacatgtggcgacattgggagttggtgcccaggcacctcctcgtcaccag60

aaaaagtcagctggcactgcatttgtatcatctgggtcatcaagaccctcataccgaaag120

aatggtcagcgtactcggtcacttagggaagaaagcaatggaggagtgtctgattccaaa180

aagcttaaccactctattcgccaaggtcttgctggcatcattgacctcccaaatgacgca240

gcttcagaagttgatatttcacatggttccgaagatcccagggggcctacggtcccaggt300

tcctaccaaatgaatgggattatcaatgaaacacataatgggaggcatgcttcagtctcc360

aaggttgttgagttttgtacggcacttggtggcaaaacaccaattcacagtgtattagtg420

gccaacaatggaatggcagcagctaagttcatgcggagtgtccgaacatgggctaatgat480

acttttggatcagagaaggcaattcagctgatagctatggcaactccggaggatctgagg540

ataaatgcagagcacatcagaattgccgatcaatttgtagaggtacctggtggaacaaac600

aacaacaactatgcaaatgtccaactcatagtggagatagcagagagaacaggtgtttct660

gctgtttggcctggttggggtcatgcatctgagaatcctgaacttccagatgcgctgact720

gcaaaaggaattgtttttcttgggccaccagcatcatcaatgcatgcattaggagacaag780

gttggctcagctctcattgctcaagcagctggagttccaacacttgcttggagtggatca840

catgtggaagttcctctggagtgttgcttggactcaatacctgatgagatgtatagaaaa900

gcttgtgttactaccacagaggaagcagttgcaagttgtcaggtggttggttatcctgcc960

atgattaaggcatcttggggtggtggtggtaaaggaataaggaaggttcataatgatgat1020

gaggttaggacattatttaagcaagttcaaggcgaagtacctggttccccaatatttatc1080

atgaggctagctgctcagagtcgacatcttgaagttcagttgctttgtgatcaatatggc1140

aacgtagcagcacttcacagtcgagattgcagtgtacaacggcgacaccaaaagataatc1200

gaggaaggaccagttactgttgctcctcgtgagactgtgaaagagcttgagcaggcagca1260

cggaggcttgctaaagctgtgggttatgttggtgctgctactgttgaatacctttacagc1320

atggaaactggtgaatattattttctggaacttaatccacggctacaggttgagcatcct1380

gtcactgagtggatagctgaagtaaatttgcctgcggctcaagttgctgttggaatgggt1440

atacccctttggcagattccagagatcaggcgcttctacggaatgaaccatggaggaggc1500

tatgacctttggaggaaaacagcagctctagcgactccatttaactttgatgaagtagat1560

tctaaatggccaaaaggccactgcgtagctgttagaataactagcgaggatccagatgat1620

gggtttaagcctactggtggaaaagtaaaggagataagtttcaagagtaaaccaaatgtt1680

tgggcctatttctcagtaaagtctggtggaggcatccatgaattcgctgattctcagttc1740

ggacatgtttttgcgtatggaactactagatcggcagcaataactaccatggctcttgca1800

ctaaaagaggttcaaattcgtggagaaattcattcaaacgtagactacacagttgaccta1860

ttaaatgcctcagattttagagaaaataagattcatactggttggctggataccaggata1920

gccatgcgtgttcaagctgagaggcctccatggtatatttcagtcgttggaggggcttta1980

tataaaacagtaactgccaacacggccactgtttctgattatgttggttatcttaccaag2040

ggccagattccaccaaagcatatatcccttgtctatacgactgttgctttgaatatagat2100

gggaaaaaatatacaatcgatactgtgaggagtggacatggtagctacagattgcgaatg2160

aatggatcaacggttgacgcaaatgtacaaatattatgtgatggtgggcttttaatgcag2220

ctggatggaaacagccatgtaatttatgctgaagaagaggccagtggtacacgacttctt2280

attgatggaaagacatgcatgttacagaatgaccatgacccatcaaagttattagctgag2340

acaccatgcaaacttcttcgtttcttggttgctgatggtgctcatgttgatgctgatgta2400

ccatatgcggaagttgaggttatgaagatgtgcatgcccctcttatcacccgcttctggt2460

gtcatacatgttgtaatgtctgagggccaagcaatgcaggctggtgatcttatagctagg2520

ctggatcttgatgacccttctgctgttaagagagctgagccgttcgaagatacttttcca2580

caaatgggtctccctattgctgcttctggccaagttcacaaattatgtgctgcaagtctg2640

aatgcttgtcgaatgatccttgcggggtatgagcatgatattgacaaggttgtgccagag2700

ttggtatactgcctagacactccggagcttcctttcctgcagtgggaggagcttatgtct2760

gttttagcaactagacttccaagaaatcttaaaagtgagttggagggcaaatatgaggaa2820

tacaaagtaaaatttgactctgggataatcaatgatttccctgccaatatgctacgagtg2880

ataattgaggaaaatcttgcatgtggttctgagaaggagaaggctacaaatgagaggctt2940

gttgagcctcttatgagcctactgaagtcatatgagggtgggagagaaagtcatgctcac3000

tttgttgtcaagtccctttttgaggagtatctctatgttgaagaattgttcagtgatgga3060

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tcccttaatcacaaagcgtattacaagttggcacttaaagctagtgaacttcttgaacaa3300

acaaaacttagtgagctccgtgcaagaatagcaaggagcctttcagagctggagatgttt3360

actgaggaaagcaagggtctctccatgcataagcgagaaattgccattaaggagagcatg3420

gaagatttagtcactgctccactgccagttgaagatgcgctcatttctttatttgattgt3480

agtgatacaactgttcaacagagagtgattgagacttatatagctcgattataccagcct3540

catcttgtaaaggacagtatcaaaatgaaatggatagaatcgggtgttattgctttatgg3600

gaatttcctgaagggcattttgatgcaagaaatggaggagcggttcttggtgacaaaaga3660

tggggtgccatggtcattgtcaagtctcttgaatcactttcaatggccattagatttgca3720

ctaaaggagacatcacactacactagctctgagggcaatatgatgcatattgctttgttg3780

ggtgctgataataagatgcatataattcaagaaagtggtgatgatgctgacagaatagcc3840

aaacttcccttgatactaaaggataatgtaaccgatctgcatgcctctggtgtgaaaaca3900

ataagtttcattgttcaaagagatgaagcacggatgacaatgcgtcgtaccttcctttgg3960

tctgatgaaaagctttcttatgaggaagagccaattctccggcatgtggaacctcctctt4020

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