本发明涉及生物医药领域，具体涉及以cd20为靶点的特异性抗体，以cd20为靶点的car-nk细胞及其制备和应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，缩写car)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。car基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用，其主要以t-细胞为载体。car-t，全称是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与cd3-ζ链或4-1bb等胞内元件在体外偶联为一个嵌合基因，通过基因转导的方法转染患者的t细胞，使其表达嵌合抗原受体(car)。患者的t细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的car-t细胞。cd20抗原是一种b细胞分化抗原，仅位于前b细胞和成熟b细胞，它在95％以上的b细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。以cd20为靶点开发的抗体药物rituximab在复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤的治疗上取得了良好的疗效。目前大量的研究证明cd20可作为治疗b细胞淋巴瘤的的靶点用于car的构建。但制备car-t的t细胞只能来自患者自身，不能异体回输，导致其生产成本较高，不利于其大规模应用。自然杀伤(naturalkiller，缩写nk)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。nk细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或hla配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用nk细胞来治疗癌症是最新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种以cd20为靶点的抗cd20抗体或其抗原结合片段，以及能够表达该结构域的car-nk细胞及其制备和应用，该细胞性状稳定，可大批量生产和制备，且可进行异体回溯。本发明一方面提供一种以cd20为靶点的抗cd20抗体或其抗原结合片段，其包括vh1链和/或vl1链和/或vh2链和/或vl2链，所述vh1链和/或vl1链和/或vh2链和/或vl2链之间直接连接或通过连接肽连接。在本发明的一个具体实施方式中，所述vh1链和/或vl1链和/或vh2链和/或vl2链，所述vh1链和/或vl1链和/或vh2链和/或vl2链之间通过连接肽连接。示例性地，所述连接肽的序列为ggggsggggsggggs。示例性地，所述vh1链的氨基酸序列如seqidno：1所示的序列或其同源序列，和/或所述vl1链的氨基酸序列如seqidno：2所示的序列或其同源序列，和/或所述vh2链的氨基酸序列如seqidno：3所示的序列或其同源序列，和/或所述vl2链的氨基酸序列如seqidno：4所示的序列或其同源序列。示例性地，所述同源序列与原序列的同源性为60％以上，例如，约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上等。本发明另一方面提供一核苷酸序列，其能够表达上述抗cd20抗体或其抗原结合片段。示例性地，所述vh1链的核苷酸序列如seqidno：5所示的序列或其简并序列，和/或所述vl1链的核苷酸序列如seqidno：6所示的序列或其简并序列，和/或所述vh2链的核苷酸序列如seqidno：7所示的序列或其简并序列，和/或所述vl2链的核苷酸序列如seqidno：8所示的序列或其简并序列。示例性地，所述同源序列与原序列的同源性为60％以上，例如，约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上等。示例性地，所述的抗cd20抗体或其抗原结合片段，其结构包括：vh1-vl1-vh2-vl2，和/或vh1-vh2-vl2-vl1，和/或vh1-vl2-vl1-vh2，和/或vl1-vh1-vh2-vl2，和/或vl1-vh2-vh1-vl2，和/或vl1-vl2-vh1-vh2，和/或vh2-vh1-vl1-vl2，和/或vh2-vl1-vh1-vl2，和/或vh2-vl2-vh1-vl1，和/或vl2-vh1-vl1-vh2，和/或vl2-vl1-vh1-vh2，和/或vl2-vh2-vh1-vl1。在本发明提供的一个具体实施方式中，以cd20为靶点的抗cd20抗体或其抗原结合片段包括vh1链、vl1链、vh2链和vl2链。在本发明的一个具体实施方式中，所述抗cd20抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如seqidno：9所示的序列或其同源序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述抗cd20抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列如seqidno：10所示的序列或其简并序列。本发明另一方面提供一种anticd20car-nk细胞，该细胞能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括上述抗cd20抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个具体实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和/或共刺激信号传导区。示例性地，所述的跨膜结构域选自：cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为cd8跨膜结构域；和/或，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、cd2、cd4、cd5、cd28、cd134、cd137、icos、cd154、4-1bb和ox40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1bb和cd3ζ胞内结构域。优选地，所述的抗cd20抗体或其抗原结合片段能够特异性结合肿瘤特异性抗原cd20，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该nk细胞。示例性地，所述嵌合抗原受体是结构为scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ的融合蛋白，该融合蛋白能够特异性识别cd20分子。在本发明的一个具体实施方式中，所述scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如seqidno：11所示或其同源序列等。示例性地，所述scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的核苷酸的序列如seqidno：12所示或其简并序列等。在本发明的一个具体实施方式中，所述anticd20car-nk细胞能够有效地杀伤和/或杀死raji细胞等。本发明另一方面提供上述anticd20car-nk细胞的制备方法，其包括如下步骤：(1)合成和扩增scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白基因，将所述scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293t细胞，包装和制备慢病毒；(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染nk-92细胞，得到cd20car-nk细胞。本发明还提供上述抗cd20抗体或其抗原结合片段，和/或上述核苷酸序列表达的抗cd33抗体或其抗原结合片段，和/或上述anticd20car-nk细胞在制备治疗和/或预防高表达cd20分子的肿瘤及相关疾病的药物中的应用。示例性地，anticd20car-nk细胞在制备治疗高表达cd20分子的淋巴瘤的药物中的应用。本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述抗cd20抗体或其抗原结合片段，和/或上述核苷酸序列表达的抗cd20抗体或其抗原结合片段，和/或上述anticd20car-nk细胞，以及任选地，药学上可接受的辅料。本发明至少具有如下优势之一：本发明提供以cd20为靶点的抗cd20抗体或其抗原结合片段，其性状稳定；并以此所构建的anticd20car-nk细胞为单克隆细胞株培养并扩增所得，性状也稳定，可用于大规模生产制备。anticd20car-nk细胞以cd20分子为靶抗原，能够特异性地杀死或杀伤淋巴瘤细胞，可作为淋巴瘤类疾病的治疗药物，用于cd20分子高表达的肿瘤的治疗。附图说明图1所示为本发明实施例提供的cd20car载体的结构示意图。图2所示为本发明实施例提供的流式细胞仪检测cd20car-nk细胞阳性率的结果图；图2a为nk-92对照组，图2b为cd20nk-92实验组。图3所示为本发明实施例提供的cd20car-nk细胞杀伤raji细胞的实验结果图。具体实施方式除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。具体而言，本发明所述的编码scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的核苷酸的序列是任何能够编码该融合蛋白的任何dna序列，优选地，该序列为seqidno：12或其互补序列。另一方面，本发明所述的编码scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的核苷酸的序列可为在严紧条件下与由seqidno：12的核苷酸序列进行杂交、且编码该融合蛋白的多核苷酸或其互补序列；本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×ssc、5×denhardt液、0.5％sds、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×ssc、5×denhardt液、0.5％sds、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×ssc、5×denhardt液、0.5％sds、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严紧度。除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过fasta、blast等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。核苷酸序列的同一性，可以使用karlin及altschul的算法规则blast(proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268,1990；proc.natl.acad.sci.usa90:5873,1993)来确定。基于blast算法规则的程序blastn、blastx已被开发(altschulsf,etal:jmolbiol215:403,1990)。使用blastn分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用blastx分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用blast和gappedblast程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。本发明中，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体等(harlow等，1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等，1989,in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等，1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等，1988,science242:423-426)。术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scfv抗体和多特异性抗体。除非另有规定，“编码核苷酸”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列可包括内含子。术语“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的dna，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。本文中出现的英文名称不区分大小写；cd20car-nk、cd20-carnk表示的含义相同；cd20car-nk与anticd20-carnk表示相同的含义，均表示抗cd20分子的car-nk细胞；nk-92、nk92均表示nk92细胞。本发明所述的“nk”为人体正常nk细胞或nkt细胞或nk细胞系，其包括nk-92细胞，yt细胞，nkl细胞，hank-1细胞，nk-ys细胞，khyg-1细胞，snk-6细胞和imc-1细胞等。本发明的具体实施例中以nk-92细胞为例进行说明。为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。下面以scfv(anticd20)-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白为例进行详细的说明。以下实施例中scfv(anticd20)-cd8tm-4-1bb-cd3ζ与scfv(anticd20)-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白与scfv1-scfv2-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白表示相同的含义。实施例1慢病毒表达载体的制备基因合成scfv(anticd20)-cd8-4-1bb-cd3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如seqidno：11所示，基因序列如seqidno：12所示)。通过酶切，将其转化连接到prrslin载体中，基因上游为ep-1α启动子。载体转化stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得prrlsin-scfv(anticd20)-cd8-4-1bb-cd3ζ慢病毒转染载体(如图1所示)。实施例2慢病毒的制备(1)转染前24小时，以每皿约8×106将293t细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。(2)准备溶液a和溶液b溶液a：6.25ml2×hepesbuffer缓冲液(5个大皿一起包装的量，效果最好)。溶液b：分别加入以下质粒的混合物：112.5μgprrlsin-scfv(2-27)-cd8-4-1bb-cd3ζ(targetplasmid)；39.5μgpmd2.g(vsv-genvelop)；73μgpcmvr8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl2m钙离子溶液。溶液b总体积：6.25ml。充分混匀溶液b，轻轻涡旋溶液a的同时，逐滴加入溶液b，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述a和b的混合溶液，逐滴加入含293t细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使dna与钙离子的混合物均匀分布。(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。pes膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特ultra-clearsw28centrifugetubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)。以pbs平衡离心管，25000rpm(82，700g)，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μlpbs，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。冰上冷却后，置于-80℃保存。实施例3cd20carnk-92细胞的制备将nk-92细胞密度调整至2-3×105/ml，按体积比(v/v)病毒载体：细胞培养基＝1:5-10的比例添加病毒载体(实施例2所制备的)，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2-3×105/ml。72h后进行car抗体染色，同时流式分选cd20carnk-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。利用流式检测carnk-92细胞阳性率，流式检测结果如图2a和图2b所示。图2a和图2b中，所采用的抗体为apc荧光标记，在横坐标上进行表示，nk92细胞若成功表达car分子，该信号值将显著升高。从图2a和图2b中可以看出，apc荧光标记的信号值显著升高，表明nk-92细胞成功表达出car分子，car-nk92阳性率为98.58％。实施例4cd20car-nk细胞对体外肿瘤杀伤效果的评估利用cck-8方法检测cd20car-nk细胞对raji细胞的杀伤效果。实验操作方法如下：(1)在24孔板中配制1mlraji细胞悬液(2x10^4个/孔)。将培养板在培养箱预培养12h。(2)弃去24孔板的培养上清，每孔加入1ml效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例为1:1或5:1。培养基对照孔只加1ml培养基，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育2h，实验分组如下表1。表1cd20car-nk细胞对raji细胞的杀伤效果试验分组组别效应细胞效靶比(e：t)杀伤时间(小时)1nk921:122cd20carnk-921:123nk925:124cd20carnk-925:12(3)每孔加入100ulcck-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h。(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。(5)杀伤率＝(as-ab)/(ac-ab)x100％；as：试验孔(含有肿瘤细胞的培养基、cck-8、car-nk)；ac：对照孔(含有肿瘤细胞的培养基、cck-8)；ab：空白对照(不含细胞和car-nk的培养基、cck-8)；cd20car-nk细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图3所示。如图3所示实验结果显示，与nk92对照组比较，本发明所制备的cd20carnk-92细胞能够显著杀伤raji靶细胞株，在效靶比为5：1时，杀伤效率可以达到80％以上。本发明的cd20carnk-92是将cd20car分子侵染nk92细胞株并经过流式筛选获得单一克隆细胞，将性状稳定杀伤活性高的carnk92单克隆细胞株培养并扩增获得。该细胞可以用于大规模生产制备，可以用于不同病人且不会产生gvhr排斥。cd20carnk-92细胞与car-t细胞相比，无需分离病人外周血单核细胞(pbmc)，无需特异活化t细胞和制备car-t细胞(该过程需要病人等待10天以上时间)，不需要个性定制且能用于多个病人，缩短了时间，cd20car-nk92细胞可以大批量制备培养，病人即来即用；另一方面，常规制备的car-t细胞，由于是分离病人的t细胞经病毒感染而制备的，t细胞不是同一个单克隆来源，而分选出的car-nk92细胞来源于同一个单克隆，性状和活性均一且稳定，便于大规模生产和质控；同时与nk92细胞相比，由于进行了car载体导入，其杀伤活性特异，肿瘤治疗效果明显。另外，本实施例中提供的cd20car结构为双单链抗体串联结构域，其含有两个识别不同cd20表位的抗体序列，可以提高cd20靶向识别能力和降低脱靶率及复发率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江阿思科力生物科技有限公司<120>以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vh1<400>1glnilevalleuserglnserproalaileleuseralaserprogly151015glulysvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrile202530histrppheglnglnlysproglyserserprolysprotrpiletyr354045alathrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpthrserasnproprothr859095pheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>2<211>120<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vl1<400>2glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530asnmethistrpvallysglnthrproglyargglyleuglutrpile354045glyalailetyrproglyasnglyaspthrsertyrasnglnlysphe505560lysglylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserthrtyrtyrglyglyasptrptyrpheasnvaltrpgly100105110alaglythrthrvalthrvalser115120<210>3<211>122<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vh2<400>3gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheasnasptyr202530alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serthrilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalyslysserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralaleutyrtyrcys859095alalysaspileglntyrglyasntyrtyrtyrglymetaspvaltrp100105110glyglnglythrthrvalthrvalserser115120<210>4<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vl2<400>4gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrpproile859095thrpheglyglnglythrargleugluilelys100105<210>5<211>321<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vh1<400>5cagatcgtgctgagccagagccccgccatcctgagcgccagccccggcgagaaggtgacc60atgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatccactggttccagcagaagcccggc120agcagccccaagccctggatctacgccaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgcgc180ttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagccgcgtggaggccgag240gacgccgccacctactactgccagcagtggaccagcaacccccccaccttcggcggcggc300accaagctggagatcaagcgc321<210>6<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vl1<400>6caggtgcagctgcagcagcccggcgccgagctggtgaagcccggcgccagcgtgaagatg60agctgcaaggccagcggctacaccttcaccagctacaacatgcactgggtgaagcagacc120cccggccgcggcctggagtggatcggcgccatctaccccggcaacggcgacaccagctac180aaccagaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacaagagcagcagcaccgcctac240atgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgcagcacc300tactacggcggcgactggtacttcaacgtgtggggcgccggcaccaccgtgaccgtgagc360<210>7<211>366<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vh2<400>7gaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggccgcagcctgcgcctg60agctgcgccgccagcggcttcaccttcaacgactacgccatgcactgggtgcgccaggcc120cccggcaagggcctggagtgggtgagcaccatcagctggaacagcggcagcatcggctac180gccgacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacgccaagaagagcctgtac240ctgcagatgaacagcctgcgcgccgaggacaccgccctgtactactgcgccaaggacatc300cagtacggcaactactactacggcatggacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtg360agcagc366<210>8<211>321<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>vl2<400>8gagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagcgcgccacc60ctgagctgccgcgccagccagagcgtgagcagctacctggcctggtaccagcagaagccc120ggccaggccccccgcctgctgatctacgacgccagcaaccgcgccaccggcatccccgcc180cgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctggagccc240gaggacttcgccgtgtactactgccagcagcgcagcaactggcccatcaccttcggccag300ggcacccgcctggagatcaag321<210>9<211>501<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>scfv1-scfv2<400>9glnilevalleuserglnserproalaileleuseralaserprogly151015glulysvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrile202530histrppheglnglnlysproglyserserprolysprotrpiletyr354045alathrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpthrserasnproprothr859095pheglyglyglythrlysleugluilelysargglyglyglyglyser100105110glyglyglyglyserglyglyglyglyserglnvalglnleuglngln115120125proglyalagluleuvallysproglyalaservallysmetsercys130135140lysalaserglytyrthrphethrsertyrasnmethistrpvallys145150155160glnthrproglyargglyleuglutrpileglyalailetyrprogly165170175asnglyaspthrsertyrasnglnlysphelysglylysalathrleu180185190thralaasplysserserserthralatyrmetglnleuse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