本发明属于一种生物制品领域，特别是涉及一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法。
背景技术：
硒是人体所必须的一种元素，可以确定的是低硒会导致大骨节病和克山病，此外缺硒会在诸多方面潜在地影响人体健康。长久以来，地区性硒源匮乏严重影响着人们的健康和生活水平，开发富硒功能性食品可以有效缓解这一问题。硒主要以无机硒盐、简单的有机硒化合物和含硒氨基酸等形式存在。有机硒的毒性较低，其中已知的含硒氨基酸有两种：硒化甲硫氨酸和硒化半胱氨酸。硒化的氨基酸可通过特殊的装配途径合成到特异性蛋白中形成了硒化蛋白。根据世界卫生组织推荐，成人每日硒摄入量应该控制在30-40μg，男子的每日最适硒摄入量为60μg，女子为53μg。
富硒产品主要有两种，一种是通过向土壤喷洒硒，提高农产品的硒含量，通过该法已开发出大量的富硒农产品，如富硒的粮食、茶、蔬菜、水果等；另一种是向食品中加入富硒添加剂，这类补硒产品包括富硒的食盐、酸奶、奶粉、微生态制剂等。
许多乳酸菌具有富集有机硒的功能。朱琴等人在专利“一种富硒乳酸菌制剂及其生产方法”(cn201110319785.5)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集5-15mg硒。陈龙等在专利“一种富硒乳酸菌制剂及其生产方法和应用”(cn200510039258.3)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集5-15mg硒。专利“一种富硒乳酸菌制剂生产方法及其复习乳酸菌制剂”(cn201310736926.2)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌、唾液乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集4-12mg硒。这三篇专利报道的硒含量远高于理论富硒量，表明其方法中带入数倍的无机硒，其所制备的乳酸菌制剂是无机硒和有机硒的混合物，并无法体现有机硒低毒的特点。秦顺义等人在专利“一种提高肉鸡肌肉肉色的富硒乳酸菌制剂及其应用”(cn201410819192.9)中报道鼠李糖杆菌用于富硒，每克制剂乳酸菌数109cfu，每克制剂硒含量5.2-22.8μg，且将近一半仍为无机硒，虽然无机硒含量大大降低，但仍是无机硒和有机硒的混合物。
目前国内外制备富硒乳酸菌的培养基基本采用传统的mrs培养基。乳酸菌菌体在发酵过程中，可将发酵液中的无机硒转化为乳酸菌体内的有机硒。传统方法中，发酵后的乳酸菌浓度一般低于(0.8-5)×109cfu/ml，且在培养过程中加入的亚硒酸钠浓度在5-120mg/l,该浓度值远高于乳酸菌的耐受浓度，造成乳酸菌生长缓慢，发酵时间通常需要36h以上，耗时长且终点活菌数低，因此富硒成本较高。此外，传统方法所得发酵液中残留的亚硒酸钠极高，通常需要经过洗涤以除去大部分亚硒酸钠，洗涤后菌体中仍残留较高的在发酵过程中未被吸收转化的硒单体和亚硒酸钠，因此所得菌体多为无机硒和有机硒的混合物，影响了菌体产品的使用。
针对已报道专利乳酸菌发酵密度低、获得的菌体制剂的硒产物是无机硒和有机硒混合物的问题，本案发明人力求研发一种提高发酵密度，降低生产成本，且最终获得的微生物制剂所含有的硒产物均为有机硒的富硒方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵密度高，生产成本较低，且最终获得的微生物制剂所含有的硒产物均为有机硒的富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法。
为了达成上述目的，本发明的技术方案是：
一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，包括如下步骤：
一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，包括如下步骤：
(1)将罗伊氏乳杆菌从平板接种到种子培养基中，37℃厌氧培养12-18h，每升种子培养基配方包括以下原料：20g蔗糖、20g酵母浸膏、3.0g磷酸氢二钾，7.0g乙酸钠、1.0g柠檬酸铵、0.2g硫酸镁、0.18g硫酸锰、1.0g吐温80和余量的蒸馏水，配置时用磷酸调ph至6.2后得到种子培养基；
(2)将种子按3％-10％接种量接种到发酵培养基中，厌氧培养16-24h，每升发酵培养基配方包括：80-150g蔗糖、80-150g酵母浸膏、2-7g柠檬酸铵、5-9g乙酸钠、2-6g磷酸氢二钾、0.2-0.6g硫酸锰、0.5-0.8g硫酸镁和1-3g吐温80，配置时用磷酸调ph至5.5-6.2后得到发酵培养基；
(3)在步骤(2)发酵进行到4h，每升发酵培养基中加入浓度为1g/l亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml；发酵进行到12-16h,每升发酵培养基补加浓度为1g/l亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml，发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液。
进一步地，还包括步骤(4)：在步骤(3)中的终点发酵液中添加稳定剂，制得富硒罗伊氏乳杆菌营养液；
所述稳定剂为果胶、明胶、变性淀粉、速溶琼脂、乳蛋白、羧甲基纤维素纳、耐酸cmc、藻酸丙二醇酯、黄原胶、卡拉胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶中多种的组合或者其中一种。
进一步地，所述乳蛋白包括酪蛋白酸钠和/或乳清蛋白。
进一步地，在步骤(4)中，富硒罗伊氏乳杆菌营养液活菌数为(0.8-5)×1010cfu/ml，硒含量为1400-3000μg/l。
进一步地，还包括步骤(4)：将步骤(3)中的终点发酵液进行过滤，过滤后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，然后添加冻干保护剂，将添加了冻干保护剂的菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂；
所述冻干保护剂为甘油、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖、聚乙烯比咯烷酮、葡聚糖、奶粉、维生素e中的多种的组合或其中一种。
进一步地，在步骤(4)中，通过平板菌落计数法测得，富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂的活菌数为(0.1-5)×1012cfu/g，硒含量为126-260μg/g。
进一步地，在步骤(3)中，通过平板菌落计数法测得，罗伊氏乳杆菌在发酵培养基中培养18h时，活菌数为(0.8-5)×1010cfu/ml；
发酵完成后，终点发酵液的硒含量为1200-3000μg/l，菌体硒含量为126-260μg/g。
进一步地，在步骤(3)中，将终点发酵液进行离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，菌体干重为9-12g/l。
本发明一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，采用改善后含蔗糖的培养基获得高密度发酵的富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，增加了单位体积发酵液消化吸收无机硒的能力，同时通过二阶段补硒控制发酵液中硒浓度处于较低水平，便于乳酸菌利用发酵过程，将发酵液中的无机硒，完全转化为乳酸菌体内的有机硒，此外由于控制了发酵过程的硒浓度，菌体生长不受抑制，可在24h内达到较高的活菌浓度，解决了传统工艺上培养基中无机硒含量远高于乳酸菌的耐受能力而造成乳酸菌生长缓慢的问题，同时避免了所得菌体包含单质硒的问题。因此本发明获得的富硒罗伊氏乳杆菌发酵液兼具完全有机硒和高活菌数的优点。
综上，本发明具有如下优点：
1、本发明采用高密度发酵培养基和工艺，可使得最终菌体浓度比普通mrs培养基获得的菌体浓度大大提高。
2、本发明采用分阶段补硒策略，可以克服发酵过程中无机硒抑制菌体生长，且同时保证无机硒100％转化为有机硒，避免所获得的制剂同时包含无机硒和有机硒。
3、本发明的工艺无需在最终发酵完成后洗涤菌体以去除未转化的无机硒，可直接作为动物引用水的添加剂等，无需其它分离操作。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
菌种来源：本发明一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法所用的罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)来源于国家工业微生物保藏中心(保藏菌种编号cicc6118)。本发明中罗伊氏乳杆菌作为富硒对象，该菌体是被国家卫生部批准可用于人和动物的益生菌。
菌种活化：向保藏的罗伊氏乳杆菌的冻干菌粉，加入无菌水2ml，然后在厌氧环境中将其接入mrs培养基(即乳酸菌培养基)平板中活化。mrs培养基组成如下：蛋白陈10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80体积1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g和蒸馏水1000ml。
种子制备：从上述活化的平板挑菌落接种至种子培养基，37℃厌氧培养12-18h，得到种子。每升种子培养基配方包括以下原料：20g蔗糖、20g酵母浸膏、3.0g磷酸氢二钾，7.0g乙酸钠、1.0g柠檬酸铵、0.2g硫酸镁、0.18g硫酸锰、1.0g吐温80和余量的蒸馏水，配置时用磷酸调ph至6.2后得到种子培养基。
需要说明的是，上述mrs培养基和种子培养基均需分装后于121℃高压灭菌15min—20min，然后冷却备用。
稳定剂：本发明所用的稳定剂为果胶、明胶、变性淀粉、速溶琼脂、乳蛋白(酪蛋白酸钠、乳清蛋白)、羧甲基纤维素纳(cmc)、耐酸cmc、藻酸丙二醇酯、黄原胶、卡拉胶、瓜尔豆胶和阿拉伯胶中的多种的组合或者其中一种。
冻干保护剂：本发明所用的冻干保护剂为甘油、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖、聚乙烯比咯烷酮、葡聚糖、奶粉和维生素e中的多种的组合或其中一种。
实施例1：
(1)将上述培养好的种子按10％(v/v)的接种量接种到高密度发酵培养基中，厌氧培养24h。本实施例中每升高密度发酵培养基配方包括以下原料：150g蔗糖、150g酵母浸膏、7g柠檬酸铵、9g乙酸钠、6g磷酸氢二钾、0.6g硫酸锰、0.8g硫酸镁和3g吐温80，配置时用磷酸调ph至6.2，得到发酵培养基。
(2)在步骤(1)发酵进行到4h时，每升发酵培养基(即发酵液)中加入浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液3.3ml；发酵进行到16h时,每升发酵培养基(即发酵液)补加浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液3.3ml。发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液；需要说明的是，在发酵过程中，步骤(2)中的发酵培养基实质为含有罗伊氏乳杆菌的发酵液。
通过平板菌落计数法测得，罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)在高密度发酵培养基中培养18h后活菌数达到了5×1010cfu/ml。发酵完成时候，终点发酵液的硒含量为3000μg/l，湿菌体的硒含量为260μg/g。将终点发酵液进行离心，菌体离心后，原子吸收光谱法测定上清液硒浓度为0，即表明发酵液中的无机硒已完全转化为罗伊氏乳杆菌体内的有机硒。终点发酵液经离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，该菌体干重为11g/l(即每升的终点发酵液中含有11g干重计的菌体)；
(3)在步骤(2)中的终点发酵液中添加羧甲基纤维素纳(cmc)6g/l和海藻糖3g/l，即，每升发酵液中添加6g羧甲基纤维素纳(cmc)，以及每升发酵液中添加3g海藻糖。而后获得稳定的富硒罗伊氏乳杆菌营养液，于4℃保存，供以使用。营养液活菌数为5×1010cfu/ml，硒含量为3000μg/l。
实施例2：
(1)将上述培养好的种子按3％(v/v)接种量接种到高密度发酵培养基中，厌氧培养20h。本实施例中每升高密度发酵培养基配方包括以下原料：80g蔗糖、80g酵母浸膏、3g柠檬酸铵、5g乙酸钠、3g磷酸氢二钾、0.4g硫酸锰、0.6g硫酸镁、2g吐温80和磷酸调ph至5.5，得到发酵培养基。
(2)在步骤(1)发酵进行到4h，每升发酵培养基(即发酵液)
中加入浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液1.1ml；发酵进行到16h,每升发酵培养基(即发酵液)补加浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液1.97ml。发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液；
通过平板菌落计数法测得，l.reuteri在高密度发酵培养基中培养18h活菌数达到了0.8×1010cfu/ml。发酵完成时候，终点发酵液硒含量为1400μg/l，菌体硒含量为155μg/g。将终点发酵液进行离心，菌体离心后，原子吸收光谱法测定上清液硒浓度为0。终点发酵液经离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，菌体干重为9g/l(即每升的终点发酵液中含有9g干重计的菌体)；
(3)在步骤(2)中的终点发酵液中添加变性淀粉10g/l和甘露醇5g/l，即，每升终点发酵液中添加10g变性淀粉，以及每升终点发酵液中添加5g甘露醇。而后获得稳定的富硒罗伊氏乳杆菌营养液，于4℃保存，供以使用。营养液活菌数为0.8×1010cfu/ml，硒含量为1400μg/l。
实施例3：
(1)将上述培养好的种子按5％(v/v)接种量接种到高密度发酵培养基中，厌氧培养16h。本实施例中每升高密度发酵培养基配方包括以下原料：100g蔗糖、100g酵母浸膏、5g柠檬酸铵、7g乙酸钠、4g磷酸氢二钾、0.4g硫酸锰、0.7g硫酸镁和2g吐温80，配置时用磷酸调ph至6.2，得到发酵培养基。
(2)在步骤(1)发酵进行到4h，每升发酵培养基(即发酵液)中加入浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液3.3ml；发酵进行到16h,每升发酵培养基(即发酵液)补加浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液2.6ml。发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液；
通过平板菌落计数法测得，l.reuteri在高密度发酵培养基中培养18h活菌数达到了4.6×1010cfu/ml。发酵完成时候，终点发酵液的硒含量为2640μg/l，菌体的硒含量为220μg/g。将终点发酵液进行离心，菌体离心后，原子吸收光谱法测定上清液硒浓度为0。终点发酵液经离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，该菌体干重为12g/l(即每升的终点发酵液中含有12g干重计的菌体)；
(3)将步骤(2)中的终点发酵液过滤，得到富硒罗伊氏乳杆菌的湿菌体，每克湿菌体添加1ml的冻干保护剂，该冻干保护剂为25％奶粉溶液(即100g蒸馏水溶解有25g奶粉)，冷冻干燥后可获得富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂，该制剂为冻干菌粉。冻干菌粉的活菌数为(0.1-5)×1012cfu/g，硒含量为126-260μg/g。优选地，冻干菌粉的活菌数为5×1012cfu/g，硒含量为176μg/g。
实施例4：
(1)将上述培养好的种子按10％(v/v)接种量接种到高密度发酵培养基中，厌氧培养18h。本实施例中每升高密度发酵培养基配方包括以下原料：90g蔗糖、90g酵母浸膏、3g柠檬酸铵、5g乙酸钠、4g磷酸氢二钾、0.3g硫酸锰、0.6g硫酸镁和2g吐温80，配置时用磷酸调ph至5.5，得到发酵培养基。
(2)在步骤(1)发酵进行到4h，每升发酵培养基(即发酵液)加入浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液1.8ml；发酵进行到12h,每升发酵培养基(即发酵液)补加浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液2.6ml。发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液；
通过平板菌落计数法测得，l.reuteri在高密度发酵培养基中培养18h活菌数达到了2.8×1010cfu/ml。发酵完成时候，终点发酵液的硒含量为1890μg/l，菌体的硒含量为189μg/g。将终点发酵液进行离心，菌体离心后，原子吸收光谱法测定上清液硒浓度为0。终点发酵液经离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，菌体干重为10g/l(即每升的终点发酵液中含有10g干重计的菌体)；
(3)将步骤(2)中的终点发酵液过滤，得到富硒罗伊氏乳杆菌的湿菌体，每克湿菌体添加1ml的冻干保护剂，该冻干保护剂包括5％甘油溶液(即100g蒸馏水溶解有5g甘油)和25％奶粉溶液(即100g蒸馏水溶解有25g奶粉)的混合液，冷冻干燥后可获得富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂，该制剂为冻干菌粉，冻干菌粉的活菌数为4.5×1012cfu/g，硒含量为145.4μg/g。
实施例5：
(1)将上述培养好的种子按10％(v/v)接种量接种到高密度发酵培养基中，厌氧培养24h。本实施例中每升高密度发酵培养基配方包括以下原料：90g蔗糖、90g酵母浸膏、3g柠檬酸铵、5g乙酸钠、4g磷酸氢二钾、0.3g硫酸锰、0.6g硫酸镁和2g吐温80，配置时用磷酸调ph至5.5，得到发酵培养基。
(2)在步骤(1)发酵进行到4h，每升发酵培养基(即发酵液)加入浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液3.3ml；发酵进行到12h,每升发酵培养基(即发酵液)补加浓度为1g/l的亚硒酸钠溶液1.1ml。发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液；
通过平板菌落计数法测得，l.reuteri在高密度发酵培养基中培养18h活菌数达到了1.6×1010cfu/ml。发酵完成时候，终点发酵液的硒含量为2006μg/l，菌体的硒含量为200μg/g。将终点发酵液进行离心，菌体离心后，原子吸收光谱法测定上清液硒浓度为0。终点发酵液经离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，菌体干重为10g/l(即每升的终点发酵液中含有10g干重计的菌体)；
(3)将步骤(2)中终点发酵液过滤，得到富硒罗伊氏乳杆菌的湿菌体，每克湿菌体添加1ml的冻干保护剂，该冻干活性剂包括2％海藻糖(即100g蒸馏水溶解2g海藻糖)和25％奶粉(即100g蒸馏水溶解25g奶粉)，冷冻干燥后可获得富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂。，该制剂为冻干菌粉，冻干菌粉的活菌数为4.2×1012cfu/g，硒含量为157.5μg/g。
本发明提出的富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，在发酵的同时实现同步富硒，富硒罗伊氏乳杆菌营养液和富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂均具有较高的活菌数，最高分别相应可达5×1010cfu/ml和5×1012cfu/g,且其中只含有机硒，有机硒含量最高分别相应可达3000μg/l和176μg/g；因此所制备的富硒罗伊氏乳杆菌营养液和富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂是一种优异的补硒益生菌制品，可用于食品和饲料添加剂。
本发明提出的富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，具有以下有益效果：
1、本发明采用高密度发酵培养基和工艺，可使得最终菌体浓度比普通mrs培养基获得的菌体浓度提高近10倍。
2、本发明采用分阶段补硒策略，可以克服发酵过程中无机硒抑制菌体生长，且同时保证无机硒100％转化为有机硒，避免所获得的制剂同时包含无机硒和有机硒。
3、本发明的工艺无需在最终发酵完成后洗涤菌体以去除未转化的无机硒，可直接作为动物引用水的添加剂等，无需其它分离操作。
上述实施例并非限定本发明的产品方法，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。