抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性方法与流程

技术特征：

1.一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、载体构建；

步骤(2)、烟草叶绿体转化和同质化筛选；

步骤(3)、分子检测。

2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，步骤(1)中载体构建包括：MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化；载体pWYP21451的构建，线性化载体的准备；插入片段的准备；重组载体的无缝连接。

3.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，MSI99基因、aadA基因和gfp基因的密码子优化的具体方法为：WORKS3.0及Synthetic Gene Designer将MSI99基因、aadA基因、GFP基因在不改变其编码的氨基酸序列的情况下，进行密码子优化工作，并将经过优化后的核苷酸序列进行分析，依次记录其GC含量及分布性、CAI值、最适密码子使用频率、重复序列结构域。

4.根据权利要求3所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化之后，将优化的3个基因序列依次置于烟草Prrn启动子和Trps16终止子之间，并在每个基因前添加核糖体结合位点，MSI99基因与Prrn启动子紧密相连，且在GFP基因和aadA基因两端添加位点特异性重组位点attP和attB序列。

5.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述线性化载体的准备方法：取质粒pEASY-Nt，用Nsi I酶切，酶切体系37℃反应2h，回收酶切产物，获得载体片段。

6.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述插入片段的准备方法：将获得的表达框片段无缝连接到线性化的载体片段上，提取质粒pEASY-synth，进行PCR扩展目的片段，所获得的PCR产物经PCR回收试剂盒回收，即为插入片段。

7.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述重组载体的无缝连接方法：将获得的载体片段和插入片段建立连接体系，将重组的混合液体转化大肠杆菌感受态细胞Mach1，涂于含卡那霉素和氨苄青霉素的平板上，过夜培养，挑取单菌落至含抗生素的LB培养液中，振荡过夜培养；将获得的菌液提取重组质粒，稀释后作为模板，进行PCR鉴定，即获得烟草叶绿体表达载体pWYP21451。

8.根据权利要求1所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，步骤(3)中分子检测包括目的基因、选择性标记基因的PCR检测；叶绿体转基因同质化的PCR检测；Southern blot分析；GFP荧光检测；蛋白表达分析。

9.根据权利要求8所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述目的基因、选择性标记基因的PCR检测包括MSI99基因的PCR检测、GFP基因的PCR检测和aadA基因的PCR检测。

10.一种鉴定上述任一权利要求所述的表达方法表达后对稻瘟病的抗性方法：

首先用MTT法确定最小抑制浓度；

对于活体抗性，接种水稻幼苗的菌液浓度为5×105个孢子/mL，接种后幼苗在温度为28℃，相对湿度为95％的黑暗条件下放置24h；喷施浓度为8.0ug/mL的MSI-99蛋白粗提液一次，48h后再次喷施；每10株幼苗喷施3mL；7天后调查植株发病情况。