本发明属于药学技术领域，具体涉及一种新的孕甾类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
多药耐药（multidrugresistance，mdr）是指肿瘤细胞接触某一种抗肿瘤药物后产生抗药性，也对结构不同、机制各异的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药，是临床肿瘤化疗最常见的问题，至今未能解决。此种现象自发现以来，多药耐药逆转剂已逐渐成为化疗药物的研发热点。其中，以维拉帕米为代表的三代p-糖蛋白（p-glycoprotein，p-gp）抑制剂表现出众，临床前研究表明此类逆转剂通过抑制外排蛋白p-gp、增加细胞内的抗肿瘤药物浓度发挥作用，与抗肿瘤药联用可有效逆转多药耐药，但其临床试验却均以失败告终。药物合用后，毒性升高、疗效降低、药物相互作用复杂等问题极大地限制了其使用。
米仔兰（aglaia）为楝科楝亚科，米仔兰族的一个属，大约有250-300种，分布于印度、马来西亚、澳大利亚以及波利尼西亚。我国产7种1变种，分布于南部、西南部和东南部各地。传统中医药及民间用药应用中，多种米仔兰属植物均可入药，具有活血、消肿、止痛、疏肝、行气、驱虫等作用。缩序米仔兰（aglaiaabbreviatac.y.wu）为楝科米仔兰属植物，灌木至小乔木，该种在我国产自云南、广西等省区，主要生长于沟谷雨林或者是常绿阔叶林林下。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种新的孕甾类化合物及其制备方法。经试验发现：该孕甾类化合物可用于制备抑制肿瘤细胞药物或耐药肿瘤细胞药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种孕甾类化合物，该化合物的结构式如下所示：
上述孕甾类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
1）取粉碎过的缩序米仔兰茎皮干粉，用85－95%乙醇在室温下浸提，浸提液经减压浓缩得到乙醇浸膏；
2）将乙醇浸膏悬浮于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，萃取液浓经缩得到二氯甲烷浸膏；
3）将二氯甲烷浸膏用水溶解后，过d101大孔树脂，先水洗以除去糖及其他水溶性杂质，再用60－90%乙醇依次洗脱，检测合并得到5个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e；
将fr.b用甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用体积比20：1－1：2的石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱，检测合并得到4个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.b1、fr.b2、fr.b3、fr.b4；
fr.b2经反相c18柱用50－90%甲醇-水梯度洗脱，得到三个组分，按洗脱顺序，依次记为：fr.b2a、fr.b2b、fr.b2c；
将fr.b2b采用制备hplc（rp-c18），75%甲醇–水作流动相，在波长210nm、流速10ml/min的条件下纯化，收集出峰时间为8.5min的化合物即为孕甾类化合物。
本发明提供了上述孕甾类化合物在制备抑制肿瘤细胞药物方面的应用。
本发明还提供了上述孕甾类化合物在制备耐药肿瘤细胞药物方面的应用。
进一步优选的，所述的肿瘤细胞可以为白血病细胞或口腔表皮样癌细胞等。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
1）本发明化合物结构稳定，属于孕甾类化合物，且其提取原料来自生长于低山灌丛或山谷河岸的缩序米仔兰。缩序米仔兰广泛分布于我国南方地区，资源十分丰富。与以其它甾体化合物为原料制备油菜甾醇类植物化合物相比，本发明生产条件温和，实验步骤少，技术难度小，生产成本低，环境污染小；同时其原料丰富、属于天然可再生资源；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，不会造成生态环境污染。2）经试验发现：本发明化合物对多种人肿瘤细胞株表现出较好的细胞毒活性，此外该化合物对耐药株的细胞毒活性要好于敏感株。
附图说明
图1为化合物1的hr-esi-ms谱；
图2为化合物1的ir谱；
图3为化合物1的1hnmr谱；
图4为化合物1的13cnmr谱；
图5为化合物1的hsqc谱；
图6为化合物1的hmbc谱；
图7为化合物1的roesy谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。下述实施例中，如无特殊说明，甲醇、乙醇均指的是体积百分比浓度。
实施例1
本发明化合物的提取原料为缩序米仔兰（aglaiaabbreviatac.y.wu），缩序米仔兰的茎皮于2014年10月采自西双版纳，由河南大学袁王俊教授鉴定，标本储存在河南大学药学院标本馆。
一种孕甾类化合物，该化合物的结构式如下所示：
上述孕甾类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
1）取粉碎过的缩序米仔兰的茎皮干粉10kg，用95%乙醇（3×35l）在室温下浸提3次，合并3次所得的浸提液并经减压浓缩得到乙醇浸膏；
2）将步骤1）所得乙醇浸膏悬浮于1l水中，依次用5l二氯甲烷、5l乙酸乙酯萃取，萃取液浓经缩得到135g二氯甲烷浸膏；
3）将二氯甲烷浸膏（135g）用500ml水溶解后，过d101大孔树脂，先水洗以除去糖及其他水溶性杂质，再用60%、70%、80%、90%乙醇依次洗脱，检测合并得到5个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e；
fr.b（15g）用15ml甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用体积比20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:2的石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱，检测合并得到4个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.b1、fr.b2、fr.b3、fr.b4；
fr.b2经反相c18柱用50%、70%、90%甲醇-水梯度洗脱，得到三个组分，按洗脱顺序，依次记为：fr.b2a、fr.b2b、fr.b2c；fr.b2b采用制备hplc（rp-c18），75%甲醇-水作流动相，在波长210nm、流速10ml/min的条件下纯化，收集出峰时间为8.5min的化合物即为孕甾类化合物（29mg；tr＝8.5min），记为化合物1。
下述给出了化合物1的相关试验数据（具体可见图1至7）。
无色针状晶体(meoh)，熔点：212~215℃。[α]−21.8(c0.091；chcl3);ir(kbr)νmax:3425,2938,1649,1547,1453,1401,611;;esi-ms:401.2[m+na]+;hr-esi-ms:401.2645([m+na]+,c23h38o4na;calcd401.2662)。1hnmr和13cnmr数据参见表1。
表1化合物1的1h(500mhz)和13c(125mhz)nmr数据归属
化合物1结构解析。
无色针状晶体（甲醇），熔点212~215℃，旋光值：[α]−21.8(c0.091；chcl3)。易溶于氯仿。薄层色谱后用浓硫酸-乙醇显色呈浅红色。红外光谱显示有羟基（3425cm-1），酯基（1649cm-1）。esi-ms:779.4[2m+na]+.hr-esi-ms:401.2645([m+na]+,c23h38o4na;calcd401.2662)，得出其分子式为c23h38o4。
化合物1氢谱中可以发现2个角甲基单峰信号（δh0.76和0.96），3个含氧次甲基质子信号[δh4.04(t,j=2.6hz),4.11(dq,j=10.9,6.0hz),5.11(dt,j=7.5,4.4hz)]，以及一个乙酰基上甲基单峰信号（δh2.02）。根据该化合物的1h和13cnmr数据，推断化合物1是一个三羟基取代的孕甾类化合物，并且其中一个羟基被乙酰化了。通过hmbc相关峰，分别确定了两个羟基取代位于3位和20位上，而乙酰氧基取代可以确定位于16位上，这是通过16位上的含氧质子(δh5.11,dt,j=7.5,4.4hz)与c-15，c-17和乙酰基的hmbc相关来确定的。
化合物1的相对构型通过roesy谱来确定的。16位上的氢质子与h-17存在roesy相关，但与me-18没有，这说明16位上的乙酰氧基是β取代。化合物1上20位的构型可以通过me-18化学位移确定为r*。因为me-18与h-20没有roesy相关，所以支链上最稳定的构型是20β羟基取代，这种状态下它比较靠近me-18，使该甲基的化学位移受到去屏蔽效应从而处于低场区。至此，化合物1的结构确定为(3α,5α,16β,20r*)-3,20-二羟基孕甾-16-乙酰基，经文献检索为新化合物。
化合物1的抑制肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞活性实验。
2.1实验仪器、材料及动物。
24、96孔细胞培养板（costar.inc.），biofugestratos高速低温离心机（thermoinc.）ckx41型显微镜（olympusinc.），hepaclass100型二氧化碳培养箱（thermoinc.）yxq-ls-50ⅱ型全自动数显蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）。人白血病细胞（k562）及耐阿霉素人白血病细胞（k562/a02），人乳腺癌细胞（mcf-7）及耐阿霉素人乳腺癌细胞（mcf-7/adm），人口腔表皮样癌（kb）及耐长春新碱人口腔表皮样癌（kb/vcr），以及人肝癌细胞（smmc-7721）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。二甲基亚砜（dmso）和噻唑兰（mtt）购自sigmainc.，胎牛血清购自paalaboratoriesgmbh，rpmi1640培养基购自invitrogeninc.，胰蛋白酶购自amrescoinc.。
2.2实验方法：mtt法检测细胞增殖抑制实验
1）取处于指数生长期状态良好的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化使贴壁细胞脱落，计数1×104个/ml，制成细胞悬液；
2）取细胞悬液接种于96孔板上，150µl/孔，置恒温37℃，5％co2培养箱中培养24小时；
3）换液，加入不同浓度受试药物，100µl/孔（终浓度为：0.01，0.1，1，10，100μm），常规培养72小时；
4）弃去上清液，每孔加入100µl、0.5mg/ml的mtt，在培养箱中孵育4h；
5）弃去上清液，每孔加入100µl的dmso，振荡摇床上面振荡15分钟；
6）用酶标仪测定，测定波长为570nm，计算抑制率：
抑制率=[a(阴性对照)-a(样品)]/[a(阴性对照)-a(空白)]×100。
2.3实验结果。
将化合物1进行人白血病细胞（k562）及耐阿霉素人白血病细胞（k562/a02）、人乳腺癌细胞（mcf-7）及耐阿霉素人乳腺癌细胞（mcf-7/adm）、人口腔表皮样癌（kb）及耐长春新碱人口腔表皮样癌（kb/vcr），以及人肝癌细胞（smmc-7721）七种人肿瘤细胞株的初步细胞毒活性实验。实验结果如表2所示。
由表2可以看出：化合物1对kb、kb/vcr、k562、k562/a02等人肿瘤细胞株表现出较好的细胞毒活性，值的注意的是化合物1对耐药株kb/vcr和k562/a02的细胞毒活性要好于敏感株。
表2.不同化合物的细胞毒活性数据*(ic50,μm)
*结果用每次实验平均值±s.d.表示（n=3）。