用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及寄生虫的分子生物学检测
技术领域：
，特别是涉及一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
：溶组织内阿米巴虫(Entamoebahistolytica)又称痢疾阿米巴虫，主要寄生于结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎。全世界约有5000万人感染，每年导致10万人死亡，其死亡率在原虫寄生虫中的患者中仅次于疟疾。目前检测痢疾性阿米巴虫所采用的方法主要还是传统常规的分离培养观察鉴定、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离培养鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成误判。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在检测上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的痢疾性阿米巴虫检测方法。技术实现要素：本发明的一个目的是提供痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒，使其能够快速、有效地对痢疾性阿米巴虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组，包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针引物。用于定量检测痢疾性阿米巴虫的试剂盒，其包括所述的引物组。所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针；所述定量检测指荧光定量PCR检测。所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。所述试剂盒，还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。所述常规试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水在内的商品化PCR反应混合液；所述商品化PCR反应混合液为2×PremixEXTaq。一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的方法，其特征在于，采用所述的引物，和/或，所述的试剂盒对待测样品进行检测。所述检测指荧光定量PCR检测；所述荧光定量PCR的反应体系包括：上游引物终浓度0.2μM；下游引物终浓度0.2μM；Taqman探针终浓度0.2μM；所述待测样品的DNA10-100μg；2×PremixEXTaq终浓度为0.5μl/μl，余量为灭菌去离子水。所述荧光定量PCR的反应程序包括：95℃30s；以95℃5s，60℃34s，为1个循环，共进行40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。本发明提供的痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’-ATGACTCAAAAACAGGAACAT-3’，下游引物：5’-TACAAATTTACCACTTTCACATACTG-3’，Taqman探针：5’-AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT-3’。作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为痢疾性阿米巴虫基因组DNA。本发明的另一个目的是提供荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的非诊断性方法，可对痢疾性阿米巴虫快速、有效检测，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方案：痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR非诊断性检测方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：上游引物：5’-ATGACTCAAAAACAGGAACAT-3’，下游引物：5’-TACAAATTTACCACTTTCACATACTG-3’，Taqman探针：5’-AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT-3’。作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。所述荧光定量PCR的20μl反应体系包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品DNA1μl；2×PremixEXTaq10μl，余量为灭菌去离子水。所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：(1)本发明根据国内已发现的痢疾性阿米巴虫株(Entamoebahistolytica)(Genbank：AF501278.1)的hgl基因序列设计引物，合成特异性引物及Taqman-BHQ1探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测痢疾性阿米巴虫，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。(2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-BHQ1探针荧光定量PCR检测法，使得利用Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的灵敏度约是普通PCR的100倍。(3)由于采用定量检测技术-Taqman-BHQ1荧光定量PCR(Real-timePCR)，该方法(Real-timePCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。(4)Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。综上，由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化荧光定量PCR的反应体系，发展了能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫的荧光定量PCR的非诊断性检测方法，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，本发明通过大量实验验证，本发明的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达10个/mL，说明敏感性非常高，同时所述检测试剂盒批内变异系数在0.36％-0.47％之间，批间变异系数在1.03％-1.96％之间，说明稳定性良好。附图说明上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。图1是检测痢疾性阿米巴虫的荧光定量PCR扩增曲线。图2是痢疾性阿米巴虫Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR特异性检测结果；图中，1：痢疾性阿米巴虫；2：棘阿米巴虫；3：迪斯帕内阿米巴虫4：诺氏阿米巴虫；5隐孢子虫；6灭菌的去离子水。图3是痢疾性阿米巴虫Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的敏感性检测结果；图中，A：1×107个/mL；B：1×106个/mL；C：1×105个/mL；D：1×104个/mL；E：1×103个/mL；F：1×102个/mL；G：1×101个/mL；H：1×100个/mL。图4是痢疾性阿米巴虫Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的标准曲线。具体实施方式除非特别指明，以下实施例中所用寄生虫由北京亿森宝生物科技有限公司保存，可购买获得。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。第1组实施例、本发明的引物本组实施例提供一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组，该引物的特点是，所述包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物；在进一步的实施例中，还具有如下特点：所述引物还包括探针引物；所述探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本领域技术人员可根据本发明的公开，人工合成所述引物，将它们用来定性或定量检测痢疾性阿米巴虫，能获得如本发明所述的预期效果，因此任何基于商业目的合成如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物，并将其放入标有“定量检测痢疾性阿米巴虫”用途的商品包装盒内的行为，或采用如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物用于商业检测痢疾性阿米巴虫的行为，均落入本发明请求保护的范围。第2组实施例、本发明的试剂盒本组实施例提供一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括第1组实施例任一所述的引物组。在一些实施例中，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针；所述定量检测指荧光定量PCR检测。在具体的实施例中，所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。上述“BHQ1”和“FAM”基团均为本领域常见的荧光基团，本领域技术人员还可以选用其它本领域常见的荧光淬灭基团和荧光报告基团来替换本文的“BHQ1”和“FAM”，例如，常见的荧光淬灭基团还包括：BHQ-2、Dabcyl2；常见的荧光报告基团还可以选自：TET、HEX、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X、Cy3(TYETM563)、Cy5(TYETM665)、JOE。在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。在优选的实施例中，所述常规试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水在内的商品化PCR反应混合液；在进一步优选的实施例中，所述商品化PCR反应混合液为2×PremixEXTaq。本领域商品化的PCR反应混合液还有多种，本领域技术人员可以选用其它品牌和其它类型的PCRMix。第3组实施例、本发明的检测方法本组实施例提供一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的方法。本组所有实施例都具有如下特征：所述方法包括：采用第1组实施例任一所述的引物，和/或，第2组实施例任一所述的试剂盒对待测样品进行检测。在一些实施例中，所述检测指荧光定量PCR检测；所述荧光定量PCR的反应体系包括：上游引物终浓度0.2μM；下游引物终浓度0.2μM；Taqman探针终浓度0.2μM；所述待测样品的DNA10-100μg；2×PremixEXTaq终浓度为0.5μl/μl，余量为灭菌去离子水。在进一步的实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序包括：95℃30s；以95℃5s，60℃34s，为1个循环，共进行40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。实验例1荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的非诊断性方法1、设计引物和Taqman-BHQ1探针根据国内已发现痢疾性阿米巴虫株的hgl基因序列，找出痢疾性阿米巴虫基因序列的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条Taqman-BHQ1探针，目的片段为80bp，其核苷酸序列为序列表中SEQIDNO.4。上游引物(Eh-F)：5’-ATGACTCAAAAACAGGAACAT-3’(SEQIDNO.1)，下游引物(Eh-R)：5’-TACAAATTTACCACTTTCACATACTG-3’(SEQIDNO.2)，Taqman探针引物(Eh-Taqman-BHQ1):5’FAM-AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT-BHQ1-3’(SEQIDNO.3)。其中探针的5’端标记FAM报告荧光基团，也可以选择HEX等其他基团。荧光探针的3’端标记BHQ1淬灭荧光基团。2、痢疾性阿米巴虫DNA提取利用DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号KG203)提取痢疾性阿米巴虫基因组DNA。放置于-20℃备用。3、荧光定量PCR扩增：按照如下表1所示的反应体系进行Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR：表1将一定量的检测样品的DNA模板加入PCR管中，放置于荧光定量PCR仪中进行扩增。同时设置阴性对照，阴性对照为灭菌的去离子水。荧光定量PCR反应条件如下：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。实验结果如图1，结果显示痢疾性阿米巴虫DNA使用荧光定量PCR检测为阳性扩增，Ct值为22.22和22.52，有S形扩增曲线。阴性样品则无扩增曲线。从扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。实验例2、荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的特异性验证利用总DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP419)提取痢疾性阿米巴虫、棘阿米巴虫、迪斯帕内阿米巴虫、诺氏阿米巴虫、隐孢子虫基因组DNA。将提取的痢疾性阿米巴虫、棘阿米巴虫、迪斯帕内阿米巴虫、诺氏阿米巴虫、隐孢子虫基因组DNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行本发明所述的Taqman探针法荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图2所示，痢疾性阿米巴虫DNA模板在22.94Ct处有扩增，扩增曲线呈S形，、棘阿米巴虫、迪斯帕内阿米巴虫、诺氏阿米巴虫、隐孢子虫DNA模板以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。实验例3、荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的敏感性验证及标准曲线的建立常规的检测痢疾性阿米巴虫的方法是参照中华人民共和国卫生行业标准WS287-2008《细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准》，将采集的新鲜粪便样品，加碘液或生理盐水混合均匀后，使用细胞计数器在显微镜下进行计数，并计算样品浓度。荧光定量PCR方法使用已知浓度的痢疾性阿米巴虫悬浊液DNA核酸提取物进行10倍倍比稀释后进行检测，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用Ct值和模板其实浓度制作标准曲线，列出线性关系方程，将样本的Ct值代入方程可对未知样品进行绝对定量测定。痢疾性阿米巴虫在洛克液鸡蛋血清培养基中，置37℃培养48小时后，进行镜检计数，然后将浓度为1×107个/mL的痢疾性阿米巴虫培养液进行10倍梯度稀释。提取各梯度浓度痢疾性阿米巴虫的基因组DNA作为模板，无菌水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应。结果显示，20μl反应体系中，最低检测下线为10个/mL，如图所示，在最佳反应条件下，最低检测限1×10个/mL的基因组DNA起始模板的Ct值大约为35.87，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，扩增效率为105.23％，相关系数为0.995，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。Ct值与起始模板的对数存在线性关系方程为Y＝-3.20Log(X)+39.80，其中Y为样本Ct值，X为样品浓度。将上述标准浓度为1×107个/mL的痢疾性阿米巴虫培养液，取1mL混入1g新鲜无痢疾性阿米巴虫的粪便样本中。同时进行常规镜检和荧光定量PCR检测进行定量检测，无菌水作为阴性对照。结果显示，常规检测的最低检测下线为1000个/mL，荧光定量PCR最低检测下限为10个/mL(最低检出限：10个/mL)。如下表2所示荧光定量PCR检测结果的准确性要更高，更接近样品的真实浓度。表2标准样品浓度常规镜检计数荧光定量PCR方法1×107个7.55×106个9.41×106个1×106个6.15×105个8.89×105个1×105个5.75×104个9.42×104个1×104个3.36×103个7.32×103个1×103个88个8.72×102个1×102个无7.91×101个1×101个无8.27个1×100个无无阴性对照无无实验例4、痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒的制备及检测1、试剂盒的制备：配制如下试剂并保存。试剂1：痢疾性阿米巴虫荧光PCR反应液1mL，具体体系如下表3所示：表3试剂2：阳性对照(痢疾性阿米巴虫基因组cDNA)1mL；试剂3：阴性对照(灭菌去离子水)1mL。2、试剂盒的稳定性分析选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。每管痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR反应体系为20μl：需19μl试剂1，阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)1μl。Taqman探针法荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。从表4中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.36％-0.47％之间，批间变异系数在1.03％-1.96％之间，说明本试剂盒稳定性良好。表4试剂盒稳定性分析由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化荧光定量PCR的反应体系，发展了能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫的荧光定量PCR的非诊断性检测方法，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒稳定性好。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>北京亿森宝生物科技有限公司<120>用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组、试剂盒及方法<130>P170909/YSB<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Eh-F<400>1atgactcaaaaacaggaacat21<210>2<211>26<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Eh-R<400>2tacaaatttaccactttcacatactg26<210>3<211>28<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Eh-Taqman-BHQ1<400>3agcaactgttcaaccaacaccagcatgt28<210>4<211>80<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>痢疾性阿米巴虫hgl基因特异性片段<400>4atgactcaaaaacaggaacatgtaaagcaactgttcaaccaacaccagcatgttcagtat60gtgaaagtggtaaatttgta80当前第1页1 2 3