本发明涉及一种金纳米线dna生物传感器的制备方法及其对dna浓度的定量检测方法。
背景技术：
脱氧核糖核苷酸简称dna是人类遗传信息的特殊物质，它的变化将对人的身体产生很大的危害，所以发展一种快速的、灵敏的、简单的、选择性好的dna分析技术是十分必要的。已经有很多技术比如荧光光谱、表面增强拉曼散射、表面等离子体共振光谱、电化学等方法应用到dna检测中。但是荧光光谱、表面增强拉曼散射、表面等离子体共振光谱的仪器复杂而昂贵，检测比较费时且仪器大不便现场检测；电化学中构建的dna传感器都基于传统大电极和微电极，其尺寸比较大不适用于生物活体检测，检测灵敏度不高且制样复杂。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种金纳米线dna生物传感器的制备方法及其对dna浓度的定量检测方法。通过将带有巯基的dna直接修饰在金纳米线电极上构建dna生物传感器，利用亚甲基蓝这一信号分子来快速检测dna的浓度。
本发明采取的技术方案为：
一种金纳米线dna生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1、合成带有巯基末端的可与目标检测dna链完全配对的探针dna链；
s2：将金纳米线电极清洁活化后，浸泡在探针dna溶液中，于2～6℃静置10～16小时；
s3：将步骤s2得到的金纳米线电极清洗后放入巯基己醇溶液中1.5～3小时，制备得到sh-dna/au-nwes电极，即为金纳米线dna生物传感器。
所述步骤s2中，金纳米线电极的半径为15～25nm，长度为120～135nm。这样金纳米线电极将会有更多的位点提供给带有巯基的探针dna。
所述步骤s2中，所述金纳米线电极清洁活化的方法为：将金纳米线电极放在8ml的0.5mh2so4溶液中电位为-0.2～1.6v，扫描速率为50mv/s，扫描10圈。
所述步骤s2中，所述探针dna溶液的制备方法为：将探针dna链用0.1mph＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液配制成浓度为10-5m的探针dna溶液。
所述步骤s3中，巯基己醇溶液的浓度为0.8～1.2mm；这样浓度的巯基己醇可充分除去因非特异性作用修饰在电极表面上的多余探针dna。
本发明还提供了一种利用金纳米线dna生物传感器检测dna浓度的方法，包括以下步骤：
(1)将权利要求1制备得到的sh-dna/au-nwes电极分别与不同浓度的目标检测dna溶液在30～40℃孵化2～3小时；
(2)将sh-dna/au-nwes电极清洗后放入亚甲基蓝溶液中浸泡1～1.5小时，清洗后利用方波伏安法在磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝的还原信号，记为i0；分别将步骤(1)得到的电极清洗后，放入亚甲基蓝溶液中浸泡1～1.5小时，清洗后利用方波伏安法在磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝的还原信号，记为i；
(3)以目标检测dna溶液浓度的对数logc为x轴；以-0.2v电位处的电流差值△i为y轴，作图，拟合得到线性曲线和线性方程；所述△i＝i0-i；根据线性方程利用方波伏安法即可定量检测出目标检测dna的浓度。
所述线性曲线的线性方程为△i＝718.0886+34.5237logc，相关系数为0.9891，检出限为10-17m；△i的单位为pa，c的单位为m。
所述步骤(1)中，目标检测dna溶液的制备方法为：将目标检测dna链依次用0.1mph＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液配制成的浓度分别为10-17m、10-16m、10-15m、10-14m、10-13m、10-12m、10-11m、10-10m的目标检测dna溶液。
所述步骤(1)中，所述亚甲基蓝溶液的浓度为0.3～0.8m；机染料小分子亚甲基蓝(mb)与dna的磷酸骨架有着高的亲和力及在电化学方法中有一个十分明显的还原信号，作为检测dna指示剂方面有着不可比拟的优势。
所述磷酸盐缓冲溶液的ph为7.5。在磷酸盐缓冲溶液的ph在7.5时dna分子及mb的活性是最高的。
进一步地，所述利用金纳米线dna生物传感器检测dna浓度的方法具体包括以下步骤：
a、合成带有巯基末端的可与目标检测dna链完全配对的探针dna链，所述探针dna链的序列为：5'-sh-(ch2)6-gtatcattgcgggactctattg-3'；所述目标检测dna链序列为5'-caatagagtcccgcaatgatac-3'；
b、将半径为22nm，长度为125nm的金纳米线电极放在8ml的0.5mh2so4溶液中电位为-0.2～1.6v，扫描速率为50mv/s，扫描10圈清洁活化后，浸泡在浓度为10-5m探针dna溶液中，于4℃静置12小时；
c、将步骤b得到的金纳米线电极清洗后放入浓度为1mm的巯基己醇溶液中2小时，制备得到sh-dna/au-nwes电极；
d、将sh-dna/au-nwes电极分别与浓度为10-17m、10-16m、10-15m、10-14m、10-13m、10-12m、10-11m、10-10m的目标检测dna溶液在37℃孵化2小时；
e、将sh-dna/au-nwes电极清洗后放入0.5m的亚甲基蓝溶液中浸泡1小时，清洗后利用方波伏安法在磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝的还原信号，记为i0；分别将步骤d得到的电极清洗后，放入0.5m的亚甲基蓝溶液中浸泡1小时，清洗后利用方波伏安法在0.1mph7.5的磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝还原信号，记为i，
f、以目标检测dna溶液浓度对数logc为x轴；以-0.2v电位处的电流差值△i为y轴，作图，拟合得到线性曲线，其线性方程为△i＝718.0886+34.5237logc，△i的单位为pa，c的单位为m；相关系数为0.9891，检出限为10-17m；所述△i＝i0-i；根据线性曲线利用方波伏安法即可定量检测出目标检测dna的浓度。
以上步骤中电极清洗所用的溶剂均为浓度为0.1m、ph为7.0的磷酸盐缓冲液。
与现有技术相比，本发明公开的方法具有以下优点：
1.检测灵敏度高，检测限可低至10-17m，检测范围宽，在10-17m～10-10m范围内具有良好的线性关系；
2.构建的金纳米线dna生物传感器具有优越的选择性和再生性，且稳定性较高；
3.操作简单，不需要繁琐的样品预处理步骤，且可以很快的得到结果；
4.仪器小、轻便、廉价，花费小；
5.电极尺寸小，传质速率快，检测更灵敏。
附图说明
图1为sh-dna/au-nwes电极与不同浓度的目标检测dna溶液结合后测得的方波伏安图及线性拟合图；
图2为dna的检测原理图；
图3为在不同ph的磷酸盐缓冲溶液中测得的△i同ph的关系图；
图4为sh-dna/au-nwes电极对dna序列的选择性测试图；
图5为sh-dna/au-nwes电极的再生性能测试图；
图6为sh-dna/au-nwes电极与目标测试dna结合后的稳定性测试图。
具体实施方式
本发明中所涉及到的探针dna链、目标检测dna链、单碱基错配dna链和碱基完全不互补dna链均购买自生工生物工程上海股份有限公司，且均为干粉状。
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。
实施例1
一种利用金纳米线dna生物传感器检测dna浓度的方法，包括以下步骤：
s1、合成带有巯基末端的可与目标检测dna链完全配对的探针dna链，所述探针dna链的序列为：5'-sh-(ch2)6-gtatcattgcgggactctattg-3'；所述目标检测dna链序列为5'-caatagagtcccgcaatgatac-3'；
s2：将半径为22nm，长度为125nm的金纳米线电极放在8ml的0.5mh2so4溶液中电位为-0.2～1.6v，扫描速率为50mv/s，扫描10圈清洁活化后，浸泡在浓度为10-5m探针dna溶液中，于4℃静置12小时；
s3：将步骤s2得到的金纳米线电极经0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗后放入1ml浓度为1mm的巯基己醇溶液中2小时，制备得到sh-dna/au-nwes电极，即为金纳米线dna生物传感器；
s4：将sh-dna/au-nwes电极分别与0.1ml浓度为10-17m(a)、10-16m(b)、10-15m(c)、10-14m(d)、10-13m(e)、10-12m(f)、10-11m(g)、10-10m(h)的目标检测dna溶液在37℃孵化2小时；
s5：将sh-dna/au-nwes电极经0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗后放入1ml0.5m的亚甲基蓝溶液中浸泡1小时，清洗后利用方波伏安法在8ml浓度为0.1mph为7.5磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝的还原信号，记为i0；分别将步骤s4得到的电极经0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗后，放入0.5m的亚甲基蓝溶液中浸泡1小时，经0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗后利用方波伏安法在8ml浓度为0.1mph为7.5磷酸盐缓冲溶液检测电极的亚甲基蓝还原信号，记为i；
s6：以目标dna浓度对数logc为x轴；以-0.2v电位处的电流差值△i为y轴，作图，拟合得到线性曲线，如图1所示，其线性方程为△i＝718.0886+34.5237logc，△i的单位为pa，c的单位为m；相关系数为0.9891，检出限为10-17m；所述△i＝i0-i；根据线性曲线利用方波伏安法即可定量检测出目标检测dna的浓度，其检测原理图如图2所示。
所述探针dna溶液的制备方法为：将探针dna链干粉在离心机中4000rpm离心30s～60s；将离心好的探针dna链用0.1mph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配制成浓度为10-5m的探针dna溶液。
所述目标检测dna溶液的制备方法为：将目标检测dna链干粉在离心机中4000rpm离心30s～60s；将离心好的目标检测dna链用0.1mph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液依次配制成浓度为10-17m、10-16m、10-15m、10-14m、10-13m、10-12m、10-11m、10-10m的目标检测dna溶液。
所述金纳米线电极的制备方法为：
a、将直径为25um、长度为2cm的金丝穿进长度为8cm的铝硅酸盐玻璃毛细管中，将毛细管一端用环氧树脂胶封住其目的是为了在拉制过程中处于真空环境，然后在激光拉制仪上拉制出具有超细尖端的两段，拉制的两段玻璃尖端里的金丝要与玻璃很好的熔合且金丝要连续均匀的变化；激光拉制仪的参数设置为：加热温度480℃，拉力120n，速率255m/s；
b、之后使用银导电胶将直径为250um长为7cm的钨丝与玻璃管中的金丝连接，等银导电胶干了之后将锥形尖端用环氧树脂胶封装在规格为2×1.16(mm)的毛细管中，等胶晾干之后用不同目数的金相砂纸(400、600、800、1000目)抛光打磨，打磨过程中用光学显微镜观测，一旦检测到尖端露出，立即停止抛光，制备出金纳米盘电极；
c、将制备的金纳米盘电极依次用去离子水、乙醇超声清洗三次，每次超声2～3min；然后将制备好的金纳米盘电极浸泡在氢氟酸溶液中通过控制刻蚀不同的时间来制备不同长度的金纳米线电极，所述氢氟酸溶液中氢氟酸和水的体积之比为1：4。本实施例中选择刻蚀的时间为50s，得到半径为22nm，长度为125nm的金纳米线电极。
实施例2
检测环境的优化
作为检测的环境溶液，磷酸盐缓冲溶液的酸碱度对于dna的活性和指示剂分子mb的活性是有着显著影响的。所以实验中ph条件的优化是必须的，我们使用半径为22nm、长度为125nm的金纳米线电极构建的dna传感器对不同ph的0.1m磷酸盐缓冲溶液做了检测。
将半径为22nm、长度为125nm的金纳米线电极放在0.1ml的1.0×10-5m探针dna溶液中并将其放在4℃的冰箱中12小时，之后取出电极用0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗两至三次再在室温下将其放在1ml的1mm巯基己醇(mch)溶液中2小时除去因非特异性作用修饰在电极表面上的多余探针dna，得到了sh-dna/au-nwes电极。
再取1ml的1.0×10-5m目标检测dna溶液与sh-dna/au-nwes电极在37℃烘箱中孵化2小时获得带有目标dna的金纳米线电极，将此电极用0.1mph7.0磷酸盐缓冲溶液清洗两至三次；再在室温下放入1ml的0.5m亚甲基蓝溶液(mb)中浸泡1小时，取出电极用0.1mph7.0磷酸盐缓冲溶液清洗两至三次；将制备完整的电极放在不同ph的磷酸盐缓冲溶液检测mb的还原信号。如图3所示，依次检测了ph值从6.0到8.0范围里8ml的0.1m的磷酸盐缓冲溶液，从图中可以看出△i在ph为7.5处取得最大值，从而表明了在磷酸盐缓冲溶液的ph在7.5时dna分子及mb的活性是最高的，这与人体生物环境下的ph值是大致一样的。
实施例3
金纳米线dna生物传感器(sh-dna/au-nwes电极)的高选择性
在本实施例中选择了四种不同的碱基序列的dna，分别为：
a、探针dna链：5'-sh-(ch2)6-gtatcattgcgggactctattg-3'；
b、碱基完全互配dna链即目标检测dna链：5'-caatagagtcccgcaatgatac-3'；
c、单碱基错配dna链：5'-cattagagtctcgcaatgatac-3'；
d、碱基完全不互补dna链：5'-gcagcctagtaccgtcgatgag-3'。
将半径为22nm、长度为125nm的金纳米线电极放在0.1ml的1.0×10-5m探针dna溶液中并将其放在4℃的冰箱中12小时，之后取出电极用0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗两至三次再在室温下将其放在1ml的1mm巯基己醇(mch)溶液中2小时除去因非特异性作用修饰在电极表面上的多余探针dna，得到了sh-dna/au-nwes电极。
再分别取1ml浓度均为1.0×10-5m的目标检测dna溶液、单碱基错配dna溶液、碱基完全不互补dna溶液与sh-dna/au-nwes电极在37℃烘箱中分别孵化2小时，分别将获得的电极用0.1mph7.0磷酸盐缓冲溶液清洗两至三次；再在室温下放入1ml的0.5m亚甲基蓝溶液(mb)中浸泡1小时，经0.1mph7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗后利用方波伏安法分别在8ml浓度为0.1mph为7.5的磷酸盐缓冲溶液检测各电极的亚甲基蓝还原信号，如图4所示。
图中可以看出单碱基错配(c)检测到的信号分别是完全互补序列(d)的信号的63.4％，而碱基完全不互补序列(b)检测到的信号仅仅为d的15.4％。这样的检测数据结构表明了sh-dna/au-nwes电极对配对dna具有优越的选择性。
然而在图左下角的插图中是单链探针序列(a)的信号，信号强度仅为0.2pa，证明了小分子亚甲基蓝与磷酸骨架通过静电作用的力是非常微弱的，其表明利用配对的磷酸骨架提供的位点检测产生的背景电流是十分微小，几乎是可以忽略。
实施例4
金纳米线dna生物传感器(sh-dna/au-nwes电极)的再生性
生物传感器是否再生是对纳米电极稳定性的重要考察，只有保持稳定干净的电极表面才能使电极的再生实现可能。
选择半径为22nm，长度为125nm的金纳米线电极作为传感器的传感原件，这样有利的证明电极的稳定性是可靠的，将不会影响传感器的再生性。结果如图5所示。
图中a线表示浓度为1.0×10-5m的探针dna溶液与金纳米线电极制成的sh-dna/au-nwes电极与完全互补浓度为1.0×10-11m目标dna杂交后亚甲基蓝的还原峰，b是将杂交后的传感器放入3ml的4m盐酸胍溶液中浸泡1h后，用0.1m磷酸盐缓冲溶液清洗后测定的mb还原信号，可以看出b信号相对于a信号明显减小，这是由于盐酸胍常被用于dna双链的解链和蛋白质变性的试剂，经过解链的单链dna将会使mb嵌入的位点很大程度的减少，所以信号大幅度减小。然后将解链后的探针传感器再次与完全互补配对的目标dna进行再生，从c线可以看出再生后的mb信号又增大。从而可以得到该生物传感器具有很好的再生性，这对于以后在实际应用中有着重要的意义。
实施例5
金纳米线dna生物传感器(sh-dna/au-nwes电极)的再生性
良好的再生性也从侧面证明了该电极具有优良的稳定性，如图6所示。
将浓度为1.0×10-5m的探针dna溶液与金纳米线电极制成的sh-dna/au-nwes电极与完全互补浓度为1.0×10-11m目标dna杂交后，在室温条件下，进行连续一周的亚甲基蓝还原信号的稳定性检测，每天检测一次，不检测时就将电极放在去离子水中放入4℃冰箱中保存。从图中可以看出传感器在前5天均保持较小的电流值降低，在第6天之后该传感器无法保持好的电流值，而是出现与前一天相比较大的电流下降，其可能是因为电极表面提供的位点有限，传感器的dna活性和指示剂的活性随着在低温环境下保存的时间增加而降低。从而表明我们制备的传感器具有很好的稳定性。
上述参照实施例对一种金纳米线dna生物传感器的制备方法及其对dna浓度的定量检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>安徽师范大学
<120>一种金纳米线dna生物传感器的制备方法及其对dna浓度的定量检测方法
<130>1
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>26
<212>dna
<213>探针dna链
<400>1
5'-sh-(ch2)6-gtatcattgcgggactctattg-3'26
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>单碱基错配dna链
<400>2
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<210>3
<211>22
<212>dna
<213>单碱基错配dna链
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<210>4
<211>22
<212>dna
<213>碱基完全不互补dna链
<400>4
5'-gcagcctagtaccgtcgatgag-3'22