本发明涉及基因工程技术方法及其仪器技术领域，尤其涉及一种核酸快速提取方法及其试剂盒。
背景技术：
核酸包括dna、rna两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。
提供分离纯化核酸总的原则：1)应保证核酸一级结构的完整性；2)排除其它分子的污染。
在分离过程中，应该注意以下事项：
1.)尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；
2)减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在ph4-10的条件下进行；
3)减少物理因素对核酸的降解，而易造成降解的因素主要包括机械剪切力和高温；核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异；
4)防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，如dna酶和rna酶；其中dna酶是需要金属二价离子mg2+、ca2+的激活，使用edta、柠檬酸盐螯合金属二价离子基本可以抑制dna酶活性。而rna酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解rna提取过程的主要危害因素。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种易于在户外操作的核酸快速提取方法。
本发明的目的之二在于提供一种快速核酸提取试剂盒。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种核酸快速提取方法，包括以下步骤：
1)将样品置入含有提取溶液的收集管，分散裂解均匀；所述提取溶液中含有tris缓冲液；
2)将吸附膜浸渍于提取溶液；所述吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜；
3)使用洗涤缓冲液浸洗吸附膜，将吸附膜置于洗脱液或pcr反应液中释放核酸。
进一步地，步骤1)中，所述tris缓冲液的ph值为8.0。
进一步地，步骤1)中，所述提取溶液中，还含有最终浓度为以下浓度的以下组分：1m的异硫氰酸胍、0.5wt％tritonx100，1wt％tween-20，60μg/ml的蛋白酶k。
进一步地，步骤1)中，加入研磨球进行分散；所述提取溶液中，还含有最终浓度为以下浓度的以下组分：2m的异硫氰酸胍、150mmnacl、10mmedta，1％tween-20，0.5％sds。
进一步地，所述研磨球为钢球。
进一步地，步骤3)中，在ph＝8.3的条件下释放核酸。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种快速核酸提取试剂盒，包括提取溶液、吸附膜、洗涤缓冲液和洗脱液，所述提取溶液中含有tris缓冲液，所述提取溶液的ph值为8.0；所述吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜；所述洗脱液的ph值为8.3。
进一步地，所述提取溶液中，还含有最终浓度为以下浓度的以下组分：1m的异硫氰酸胍、0.5wt％tritonx100，1wt％tween-20，60μg/ml的蛋白酶k。
进一步地，还包括研磨球，所述研磨球为钢球。
进一步地，所述洗脱液为含有0.1wt％tween-20的tris缓冲液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种核酸快速提取方法及其试剂盒，以固相提取的原理，在弱碱性条件下，使带负电的核酸吸附于经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜，再通过洗脱液进行洗脱，以快速地获得核酸；该方法提取过程快速、杂质少、对温度的限制性小、核酸不易解离，适用于户外等条件简陋的场合。
附图说明
图1为本发明操作示意图；
图2为吸附膜吸附能力试验的对照组的荧光定量pcr检测结果；
其中曲线a-f代表pcr反应中加入的核酸浓度依次为38000pg/μl,3800pg/μl,380pg/μl,38pg/μl,3.8pg/μl,0.38pg/μl；
图3为吸附膜吸附能力试验的试验组的荧光定量pcr检测结果；
其中曲线a-f代表pcr反应中加入的核酸浓度依次为38000pg/μl,3800pg/μl,380pg/μl,38pg/μl,3.8pg/μl,0.38pg/μl；
图4为吸附膜吸附能力试验的普通pcr测结果对照图
其中泳道a-f代表对照组pcr反应中加入的核酸浓度依次为38000pg/μl,3800pg/μl,380pg/μl,38pg/μl,3.8pg/μl,0.38pg/μl；
其中泳道a-f代表试验组pcr反应中加入的核酸浓度依次为38000pg/μl,3800pg/μl,380pg/μl,38pg/μl,3.8pg/μl,0.38pg/μl；
图5为不同样品的核酸提取检测结果；
其中，m:dl2000marker；1:副溶血弧菌；2:猪链球菌ii型；3:伪狂
犬血清；4:伪狂犬细胞上清；5:猪瘟淋巴组织；
图6为提取时间优化图；
图7为洗涤时间优化图；
图8为灵敏度试验；
图9为实施例1的提快速核酸提取试验盒与axgen核酸提取试验盒的比较其中，m:dl2000marker；1：axgen的核酸提取试剂盒；2：实施例1。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供一种核酸快速提取方法，包括以下步骤：
1)将样品置入含有提取溶液的收集管，分散均匀；所述提取溶液中含有tris缓冲液；
2)将吸附膜浸渍于提取溶液；所述吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜；
3)使用洗涤缓冲液浸洗吸附膜，于洗脱液或pcr反应液释放核酸。
该方法利用在tris缓冲液的弱碱条件下，经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜的表面分布有大量的季铵碱基，与样品中的核酸进行阴离子交换，从而快速将核酸吸附于纤维素膜，洗涤去杂质后，再洗脱释放核酸，进一步进行pcr扩增等，以快速获得样品的遗传信息。
以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的病料或试剂均可通过市售的方式或普通的试验手段获得。
部分试剂或试剂盒的来源信息如下所示：体液病毒rna/dna小量制备试剂盒购自axygen公司；rna酶抑制剂、m-mlv逆转录酶购自promega公司；dntp购自takara公司；琼脂糖凝胶dna纯化回收试剂盒以及普通质粒小量提取试剂盒均购自omega公司。
以下具体实施方式中，可检测的样品的形式包括但不限于血清、细胞上清或组织样品。
实施例1：
一种快速核酸提取试剂盒，包括提取溶液、吸附膜、洗涤缓冲液和洗脱液或pcr反应液，所述提取溶液中含有tris缓冲液，所述提取溶液的ph值为8.0；所述吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜；所述洗脱液的ph值为8.3；
该提取溶液包括以最终浓度计的以下组分：1m的异硫氰酸胍、100mmtris(ph8)、0.5wt％tritonx100、1wt％tween-20、60μg/ml的蛋白酶k；
该洗涤缓冲液由以最终浓度计的以下组分组成：30mmtris(ph8.0)、0.1％tween-20.
实施例2：
一种快速核酸提取试剂盒，包括提取溶液、吸附膜、研磨球、洗涤缓冲液和洗脱液或pcr反应液，所述提取溶液中含有tris缓冲液，所述提取溶液的ph值为8.0；所述吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜；所述洗脱液的ph值为8.3；
该提取溶液包括以最终浓度计的以下组分：2m异硫氰酸胍，100mmtris(ph8)，150mmnacl，10mmedta，1％tween-20，0.5％sds；
该研磨球为钢质研磨球，尺寸为4mm或2mm，对组织起到研磨作用；通常1.5ml的离心管中加入2-4颗钢球；
该洗涤缓冲液由以最终浓度计的以下组分组成：30mmtris(ph8.0)、0.1％tween-20；该洗脱液为pcr扩增体系；
该吸附膜的制作方式及负载包括但不限于以下方式：
1)使用scottoptimumhandtowel滤纸作为纤维素膜，使用含有季铵离子的强阴离子树脂进行浸渍处理，得到吸附膜；
2)将塑料薄板剪裁为高为6cm宽为2mm的长方形，吸附膜剪裁为长5mm宽2mm的长方形，用防水胶固定在塑料薄板上，固定部分用石蜡密封，下缘伸出3mm，手柄长度为6cm，得到负载有吸附膜的取样条。
实施例3：
一种核酸快速提取方法，使用实施例1的快速核酸提取试剂盒，包括以下步骤：
1)将阳性样品血清100μl加入含有400μl的提取溶液的1.5ml收集管，摇晃分散均匀1min；
2)将吸附膜浸渍于500μl提取溶液1min；
3)使用洗涤缓冲液浸洗吸附膜1min，将吸附膜置于pcr扩增体系中浸泡1min释放核酸后取出；
4)将pcr扩增体系放置于pcr仪器上进行扩增。
实施例4：
一种核酸快速提取方法，使用实施例2的快速核酸提取试剂盒，包括以下步骤：
1)将阳性组织样品500mg置入含有500μl的提取溶液的1.5ml收集管，加入2颗直径为4mm以及2颗直径为2mm的研磨球，摇晃分散均匀1min；
2)将吸附膜浸渍于500μl提取溶液1min；
3)使用500μl洗涤缓冲液浸洗吸附膜1min，将吸附膜置于20μlpcr扩增体系中浸泡1min释放核酸后取出；
4)将pcr扩增体系放置于pcr仪器上进行扩增。
性能检测与效果评价
1.吸附膜吸附能力试验
利用阳性质粒配制成核酸浓度依次为38000pg/μl、3800pg/μl、380pg/μl、38pg/μl的系列梯度样品，采用实施例3的方法，研究吸附膜对核酸的吸附能力，即本发明提供核酸快速提取方法及试剂盒的灵敏性试验，作为试验组。将系列梯度样品直接采用荧光定量pcr检测，作为对照组。
荧光定量pcr检验结果显示，直接检测的核酸的浓度为38000pg/μl、3800pg/μl、380pg/μl、38pg/μl以及3.8pg/μl的样品荧光信号均为阳性，而浓度0.38pg/μl的样品荧光信号为阴性，如图2所示。而经过吸附膜吸附后的样品荧光检测结果与对照组的相同，对应的cq值稍有减小，如表1。
普通pcr上的结果与荧光定量pcr的结果相符，如图4所示，都是在核酸为380pg/μl时衰减较明显，普通pcr结果中经过吸附膜处理后浓度3.8pg/μl和0.38pg/μl的样品结果为阴性，不及荧光定量pcr结果敏感。
表1试验组与对照组荧光定量pcrcq值比较
2.对核酸样品的适用性试验
以猪伪狂犬的血清和细胞上清、副溶血弧菌、猪链球菌ii型以及猪瘟阳性组织样品作为待测样品，使用实施例1的方法进行检测，琼脂糖凝胶检测结果如图5所示，结果表明，以上5种核酸样品均有目的条带出现，与阳性样品的检测结果相符。
3.提取时间及洗涤时间优化
在实施例3的基础上，将吸附膜浸渍于提取溶液中的时间调整为30s、2min和5min，再进行荧光定量检测，其结果如图6所示，说明，在浸渍1min的提取时间，扩增完成后，其cq值最高，即扩增效率最高，即提取时间为1min时较理想；
在实施例3的基础上，将吸附膜浸渍于洗涤缓冲液中的时间调整为30s、2min和5min，再进行荧光定量检测，其结果如图7所示，说明，在浸渍1min的洗涤时间，在扩增完成后，其cq值最高，即扩增效率最高，即洗涤时间为1min时较理想。
4.吸附膜的吸附核酸的灵敏度
在实施例4的基础上，将107copies/μl的标准质粒梯度稀释至106-101copies/μl，把吸附膜分别放于梯度稀释的质粒溶液中浸泡1min，再在洗涤缓冲液中洗涤1min，然后在pcr扩增体系中洗脱1min，再进行扩增。pcr扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶进行检测。
结果如图8所示，对标准质粒梯度稀释液进行灵敏度试验的检测结果显示，吸附膜吸附核酸的灵敏度在普通pcr中可以达到103个copies/μl。
5.与axgen的核酸提取试剂盒效果比较
用axgen的病毒rna/dna小量制备试剂盒和实施例1提供的快速核酸提取试剂盒采用实施例1提供的方法提取的伪狂犬病毒血清核酸，结果如图9所示，泳道1与泳道2的亮度无明显差异，即pcr检测结果无差异，两种核酸提取方法提取效果无差异。
本发明提供的试剂盒可以用于细菌、真菌、酵母、藻类和病毒病原种类的核酸提取，包括但不限于以下种类：
细菌：mrsa，ca-mrsa；微球菌属(micrococcussp.)；表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)；聚团肠杆菌(enterobacteragglomerans)；乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)；金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(有色素的)；金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(无色素的)；肺炎克雷伯氏菌(klibsiellapneumonialmoniae)；铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)；粪链球菌(streptococcusfaecalis)；大肠杆菌(escherichiacoli)；奇异变形杆菌(proteusmirabilis)；差异柠檬酸杆菌(citrobacterdiversus)；伤寒沙门氏菌(salmonellatyphosa)；猪霍乱沙门氏菌(salmonellacholeraesuis)；牛棒杆菌(cornyebacteriumbovis)；包皮垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)；结核分枝杆菌(mycobacteriumtubercμlosis)；狗布鲁氏菌(brucellacanis)；流产布鲁氏菌(brucellaabortus)；猪布鲁氏杆菌(brucellasuis)；突变链球菌(streptococcusmutans)；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；产气荚膜梭状芽胞杆菌(clostridiumperfringens)；流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)；猪嗜血杆菌(haemophilussuis)；干酪乳酸杆菌(lactobacilluscasel)；乳明串珠菌(leuconostoclactis)；单核细胞增多性李司忒氏菌(listeriamonocytogenes)；痤疮丙酸杆(propionibacteriumacnes)；普通变形杆菌(proteusvμlgaris)；
真菌：链格孢属(alternaria)；黄曲霉(aspergillusflavus)；烟曲霉(aspergillusfumigatus)；黑曲霉(aspergillusniger)；土曲霉(aspergillusterreus)；花斑曲霉(aspergillusversicolor)；aureobadisiumpμllμlans；cephaldascusfragrans；球毛壳(chaetomiumglobosum)；草本支孢霉(cladosporiumherbarum)；表皮癣菌属(epidermophyton)；镰刀菌龙葵(fusariumnigrum)；腐皮镰刀菌(fusariumsolani)；glicocladiumroseum；毛霉(mucor)；乳卵孢子菌(oosporalactis)；扩展念珠菌(pencilliumalbicans)；tricophytonmentagraphophytes；扩展线虫(pencilliumelegans)；pencilliumfunicμlosum；pencilliumhumicola；特异青霉(pencilliumnotatum)；产糖芽霉菌(pμllμlariapμllμlans)；青霉素皮蠹(penicilliumvariabile)；黑色根霉菌(rhizopusnigricans)；ricoderm；葡萄穗霉(stachybotrysatra)；trichophytoninterdigitalie；trichdermaflavus；橘青霉(penicilliumcitrinum)。
酵母和藻类：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)；白色念珠菌(candidaalbicans)；颤藻lb143(oscillatoriabornetilb143)；柱孢鱼腥藻(anabaenacylindrica)；羊角竹叶b-325(selenastrumgracileb-325)；pleurococcuslb11；schenedesmusquadricuada；盘藻lb9c(goniumlb9c)；团藻lb9(volvoxlb9)；普通小球藻(chlorellavμlgaris)；蓝藻(cyanophyta)(蓝-绿色)；金藻(chrysophyta)(褐色)；绿藻(chlorophyta)(绿色)seienastum；绿藻(chlorophyta)(绿色)原球藻(protococcus)。
病毒：hiv；登革(dengue)；甲/乙型流感(influenzaa/b)；sars；h1n1(猪流感(swineflu))；猪瘟病毒(classicalswinefevervirus)；猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus)；猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)；草鱼呼肠孤病毒(grasscarpreovirus)；猪圆环病毒(porcinecircovirus)；猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus)；h3n2；1型单纯疱疹(herpessimplextype1)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。