本发明涉及肿瘤细胞治疗技术研发过程的基因工程载体构建与鉴定领域，尤其涉及一种针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法。
背景技术：
癌症的免疫疗法(cancerimmunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法，它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症。免疫治疗经历了多年的不断发展，近几年取得了越来越多令人振奋的研究成果。而在众多免疫疗法中，最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。
嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t)，即car-t技术，是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scfv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(cd8、cd28)、胞内信号分子(cd3ξ)，共刺激因子(cd28、4-1bb、ox40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的t细胞，使患者t细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的t细胞，也即car-t细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的t细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。car的修饰可使t细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调mhc分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗的策略。
随着car-t细胞治疗技术的不断研发与升级，目前出现了第四代car-t细胞治疗技术，区别于第二/三代car-t技术，第四代car-t细胞表达细胞因子。表达的细胞因子包括il12、il2等重要的免疫细胞因子，能够改善肿瘤区域免疫抑制微环境，促进car-t细胞发挥作用。然而，在表达细胞因子car载体的构建过程中，对基因工程car载体进行鉴定与确认是至关重要的环节。重组了细胞因子导致整体目的基因分子量达到3000-4000bp，由于分子量过大，这给后续质粒转染阳性菌落的菌落pcr鉴定以及测序带来困难，极容易出现假阴性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序准确性的针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定。
作为本发明的优选方式之一，以慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒为对象，选用pcdh酶切位点前后两端序列以及car分子中cd3ζ中序列来设计两对引物，分别鉴定前段car分子以及后段细胞因子序列。
作为本发明的优选方式之一，所述两对引物具体如下：
引物1：
f1：accctgcttgctcaactctacgtc
r1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；
引物2：
f2：ggagtacgatgttttggacaagagacg
r2：cagcgtatccacatagcgtaaaagg。
作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：
(1)设计两对引物
以慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒为对象，选用pcdh酶切位点前后两端序列以及car分子中cd3ζ中序列来设计两对引物：
引物1：
f1：accctgcttgctcaactctacgtc
r1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；
引物2：
f2：ggagtacgatgttttggacaagagacg
r2：cagcgtatccacatagcgtaaaagg；
(2)两套pcr反应体系的配置
pcr反应体系1：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf1，1ul1pmolr1，1ul待测菌液；
pcr反应体系2：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf2，1ul1pmolr2，1ul待测菌液；
(3)pcr反应
在pcr仪上按照下列程序顺序进行pcr反应：
(4)琼脂糖凝胶电泳
①配置2％的琼脂糖凝胶：
称量琼脂糖粉末，加入到tae缓冲液中，高火加热，冷却，再根据体积加入万分之一的核酸染料，混匀后倒入胶板，挑出气泡后将梳子垂直插入凝胶中；
②样品准备：
选用dna上样缓冲液，上样前将样品和dna上样缓冲液按一定比例混匀；
③上样：
室温下静置配置的2％的琼脂糖凝胶，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶板；将凝胶放入电泳槽中，点样孔置于负极，添加电泳缓冲液至没过胶板；将混匀后的样品进行上样；
④电泳：
上样后，盖上电泳槽盖子，并接通电源。
作为本发明的优选方式之一，所述配置2％的琼脂糖凝胶步骤中，称量琼脂糖粉末，加入到tae缓冲液中，微波炉中高火加热2-5min，冷却至55-65℃，再根据体积加入万分之一的核酸染料。
作为本发明的优选方式之一，所述样品准备步骤中，上样前将样品和dna上样缓冲液按照(4-6)：1比例混匀。
作为本发明的优选方式之一，所述电泳步骤中，电泳电压为110-130v，时间为20-30min。
作为本发明的优选方式之一，本方法适用于不限于慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒。
本发明相比现有技术的优点在于：对car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，由传统的“使用一对引物整体扩增测序鉴定”升级为“使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定”，这种改变将大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序的准确性，预防由于检测片段过程造成检测假阴性结果的产生。
附图说明
图1是实施例1-3中针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法的流程图；
图2是实施例1-3中慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒图；
图3是实施例3中pcr产物电泳结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定，以大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序的准确性，具体步骤如下：
(1)设计两对引物
以慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒为对象，如图2所示，选用pcdh酶切位点前后两端序列以及car分子中cd3ζ中序列来设计两对引物：
引物1：
f1：accctgcttgctcaactctacgtc
r1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；
引物2：
f2：ggagtacgatgttttggacaagagacg
r2：cagcgtatccacatagcgtaaaagg；
(2)两套pcr反应体系的配置
pcr反应体系1：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf1，1ul1pmolr1，1ul待测菌液；
pcr反应体系2：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf2，1ul1pmolr2，1ul待测菌液；
(3)pcr反应
在pcr仪上按照下列程序顺序进行pcr反应：
(4)琼脂糖凝胶电泳
①配置2％的琼脂糖凝胶：
称量琼脂糖粉末，加入到tae缓冲液中，微波炉中高火加热2min，冷却至55℃，再根据体积加入万分之一的核酸染料，混匀后倒入胶板，挑出气泡后将梳子垂直插入凝胶中；
②样品准备：
选用dna上样缓冲液，上样前将样品和dna上样缓冲液按照4：1比例混匀；
③上样：
室温下静置配置的2％的琼脂糖凝胶，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶板；将凝胶放入电泳槽中，点样孔置于负极，添加电泳缓冲液至没过胶板；将混匀后的样品进行上样；
④电泳：
上样后，盖上电泳槽盖子，并接通电源，电压110v，时间20min。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定，以大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序的准确性，具体步骤如下：
(1)设计两对引物
以慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒为对象，如图2所示，选用pcdh酶切位点前后两端序列以及car分子中cd3ζ中序列来设计两对引物：
引物1：
f1：accctgcttgctcaactctacgtc
r1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；
引物2：
f2：ggagtacgatgttttggacaagagacg
r2：cagcgtatccacatagcgtaaaagg；
(2)两套pcr反应体系的配置
pcr反应体系1：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf1，1ul1pmolr1，1ul待测菌液；
pcr反应体系2：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf2，1ul1pmolr2，1ul待测菌液；
(3)pcr反应
在pcr仪上按照下列程序顺序进行pcr反应：
(4)琼脂糖凝胶电泳
①配置2％的琼脂糖凝胶：
称量琼脂糖粉末，加入到tae缓冲液中，微波炉中高火加热5min，冷却至65℃，再根据体积加入万分之一的核酸染料，混匀后倒入胶板，挑出气泡后将梳子垂直插入凝胶中；
②样品准备：
选用dna上样缓冲液，上样前将样品和dna上样缓冲液按照6：1比例混匀；
③上样：
室温下静置配置的2％的琼脂糖凝胶，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶板；将凝胶放入电泳槽中，点样孔置于负极，添加电泳缓冲液至没过胶板；将混匀后的样品进行上样；
④电泳：
上样后，盖上电泳槽盖子，并接通电源，电压130v，时间30min。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种针对第四代嵌合抗原受体car载体pcr鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定，以大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序的准确性，具体步骤如下：
(1)设计两对引物
以慢病毒载体pcdh构建的第四代car质粒为对象，如图2所示，选用pcdh酶切位点前后两端序列以及car分子中cd3ζ中序列来设计两对引物：
引物1：
f1：accctgcttgctcaactctacgtc
r1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；
引物2：
f2：ggagtacgatgttttggacaagagacg
r2：cagcgtatccacatagcgtaaaagg；
(2)两套pcr反应体系的配置
pcr反应体系1：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf1，1ul1pmolr1，1ul待测菌液；
pcr反应体系2：10ulprimistarhspremix2x，17ulddh2o，1ul1pmolf2，1ul1pmolr2，1ul待测菌液；
(3)pcr反应
在pcr仪上按照下列程序顺序进行pcr反应：
(4)琼脂糖凝胶电泳
①配置2％的琼脂糖凝胶：
称量琼脂糖粉末，加入到tae缓冲液中，微波炉中高火加热4min，冷却至60℃，再根据体积加入万分之一的核酸染料，混匀后倒入胶板，挑出气泡后将梳子垂直插入凝胶中；
②样品准备：
选用dna上样缓冲液，上样前将样品和dna上样缓冲液按照5：1比例混匀；
③上样：
室温下静置配置的2％的琼脂糖凝胶，直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶板；将凝胶放入电泳槽中，点样孔置于负极，添加电泳缓冲液至没过胶板；将混匀后的样品进行上样；
④电泳：
上样后，盖上电泳槽盖子，并接通电源，电压120v，时间25min；电泳结果如图3所示，图3中：最左边的泳道为marker条带；泳道1为采用传统方法(使用一对引物整体扩增)的pcr产物电泳条带，大小为2313bp；泳道2、3为采用本实施例方法(使用两对引物单独进行扩增)的pcr产物电泳条带，其中，泳道2具体使用第二对引物(引物2)，大小是732bp，泳道3具体使用第一对引物(引物1)，大小为1584bp。
本实施例相比现有技术的优点在于：对car质粒阳性菌落进行pcr鉴定时，由传统的“使用一对引物整体扩增测序鉴定”升级为“使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定”，这种改变将大大提高pcr扩增效率，同时也提高测序的准确性，预防由于检测片段过程造成检测假阴性结果的产生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。