本发明涉及一种hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法，属于生物样本检测领域。
背景技术：
同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)是一种人体内的含硫氨基酸，为甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成，体内不能直接合成hcy，只能从食物中的甲硫氨酸脱甲基后转变而来。近些年，大量的研究表明，高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，hhcy)是导致心脑血管疾病的又一个主要发病因素，升高的血浆同型半胱氨酸和患有高血压的人群中在导致心脑血管疾病上具有协同效果。高同型半胱氨酸血症与一些疾病如脑血管疾病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等的发病关系越来越多的受到关注。研究表明hcy水平与心血管事件风险呈正相关，hcy每升高5μmol/l脑卒中风险升高59％，缺血性心脏病风险升高32％，hcy每降低5μmol/l脑卒中风险降低24％，缺血性心脏病风险降低16％。调研数据显示，血液hcy含量升高已成为加速动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子。
在正常人体内同型半胱氨酸水平含量不多，影响血液hcy水平的因素主要有遗传、营养状况、肾功能衰竭、摄入的药物、男女性别、年龄及不良的生活方式等。遗传因素较为重要，因此遗传因素对hcy代谢的影响也成为日前的研究热点。遗传因素主要是由于hcy代谢过程中几种关键酶缺陷或基因突变使其活性下降所致。
蛋氨酸合成酶(ms)是hcy在甲基化途径中的关键酶，如果编码ms的基因发生突变，将引起相应的酶缺乏或活性发生改变，从而导致hcy的代谢异常。ms最常见的突变是第2756位碱基的a/g突变，且可导致血清hcy水平的改变。因此在以hcy的血清水平作为众多疾病的判断标准时，如果没有考虑到自身的关键酶突变带来的血清水平改变，则有可能导致hcy的血清水平存在较大偏差，会干扰检测结果的判断，由此对后续的工作带来很大的影响。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以蛋氨酸合成酶的基因突变为基础，获得一种hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒的技术方案如下：
ms基因突变即2756位a→g导致919位密码子的缺失突变，使编码的天冬氨酸置换为甘氨酸。由于该密码子编码的氨基酸位于酶活性区域，因此该位点突变会通过改变蛋白质的二级结构，使ms活性减弱，从而影响hcy代谢过程，导致血浆中hcy处在高水平状态。因此，本发明针对ms作为hcy的代谢关键酶进行试剂盒的研发。
本发明中的试剂盒所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括特异性扩增引物和线性指数扩增体系，待扩增的模板序列包含在如序列表seqidno:1所示的序列中，高效扩增组用于待扩增模板的线性指数pcr扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组包括：退火引物、dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和klenow酶。
本发明根据待测片段的特点，设计出特异性高、准确性好的引物，扩增时采用线性指数pcr(late-pcr)可以大量产生便于焦磷酸测序的单链dna，无需对常规的双链dna进行解螺旋和分离，简化了检测流程，节约了检测所需的原料及试剂。
本试剂盒中的焦磷酸测序组还包括三磷酸腺苷双磷酸酶，当测序组中不含三磷酸腺苷双磷酸酶时，检测后的发光不会被消耗，因此发光值会发生叠加，这种检测方式虽然简便但检测的准确度低，因此优选的酶系还包括三磷酸腺苷双磷酸酶，进行传统的焦磷酸出峰式检测，便于机器识读及分型。
引物序列中有一条为过量引物，一条为限制性引物，过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。
设计引物时，由于线性指数pcr对于引物的要求较高，要求引物之间的tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过late-pcr扩增出待测的目的产物，就可以采用。
优选的，本发明中如序列表seqidno：2所示的引物为过量引物，如序列表seqidno：3所示的引物为限制性引物。
本发明中过量引物与限制性引物的具体选择可以根据实际需要扩增的单链进行调换，也就是说，如序列表seqidno：2所示的引物为限制性引物，如序列表seqidno：3所示的引物为过量引物。引物的用量可以根据实际需要和本领域常识进行调整，用量多的一条引物为过量引物，用量少的一条引物为限制性引物，本发明的保护范围不应受到引物名称和使用量的限制。
更优选的，过量引物与限制性引物在体系中的添加量为指数倍，最少为10倍。
优选的，扩增试剂还包括扩增缓冲液、dntps和mg2+。
本发明中的扩增产物优选采用焦磷酸测序进行序列检测，焦磷酸测序引物优选如序列表seqidno：4所示。但焦磷酸测序并不是唯一的测序方式，任何的可以检测基因序列的现有技术均可以作为检测方法被本发明采用，因此，焦磷酸测序不应作为是对本发明的限制。
本发明的第二个目的在于提供一种采用上述任一一款试剂盒的扩增方法，所述方法包括如下步骤：
a)提取dna样本；
b)以提取出的dna样本为模板，利用如序列表seqidno：2和seqidno：3所示的扩增引物，进行线性指数pcr扩增；
c)将扩增产物进行退火处理，退火引物如序列表seqidno：4所示，制备单链模板；
d)将制备好的单链模板进行焦磷酸测序，确定snp位点的基因型。
所述扩增体系采用25μl体系，具体为：
1×pcrbuffer、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。
扩增条件为95℃预变性5min，60℃扩增循环，72℃延伸10min，4℃保持，其中每87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个扩增循环。
扩增后优选采用焦磷酸测序，虽然扩增后的产物大部分为单链，但仍有部分区域为双链，为了使焦磷酸检测根据准确和快速，仍对扩增产物进行退火处理，制备为单链模板。
优选的，退火处理时采用两种试剂：试剂a为不含apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括dtt、aps、pvp、atpsulfurylase、klenow、荧光素和荧光素酶，试剂b为试剂a与apyrase的混合液。
其中，试剂a的一种最优选的配置方案是：0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶。
试剂b最优选的一种配置方案是：试剂a与3.2u/mlapyrase的混合液。
退火时，取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。
本发明采用合作开发的焦磷酸测序仪进行测序，测序结果与现有的市售焦磷酸测序仪相比，不仅结果更加准确，且精度高样本用量小，检测出峰准确，无需重复验证试验。
由于本发明的试剂盒是基于高精度的扩增引物设计的，因此本发明的第三个目的是提供一种hcy代谢关键酶的特异性扩增引物在制备检测试剂盒中的应用，即所述特异性引物用于制备hcy代谢关键酶基因的检测试剂盒中的应用。
本发明中的快速扩增检测试剂盒及扩增方法可以用于hcy基因的临床或药理学检测，检测样本来源不限，检测结果可以作为基因筛查、疾病易感性、用药指导等多方面的诊断依据，采用本发明中的扩增试剂盒、扩增方法或其他常规扩增方法均可以实现对msa2756g基因的高效扩增检测，对于该基因的研究和临床发展具有重要的意义。
与现有技术相比，本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链dna可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。本试剂盒中的引物及实验方法均是经过精密的设计和测试得出的，适用于各种样本的msa2756g的snp位点检测，并且检测效率高，检测结果准确。直接使用本发明中的扩增检测试剂盒和检测方法，对实验员的操作要求低，对检测环境的耐受力强，可以随时快速地进行扩增检测工作，方便快捷，检测成本低，结果准确且得出时间短，可以最大程度地减轻被检者的经济和精神负担，具有良好的市场潜在价值。
附图说明
图1是本发明提供的扩增产物凝胶电泳图；
图2是本发明提供的c碱基的焦磷酸测序图；
图3是本发明提供的a碱基的焦磷酸测序图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本发明中采用的仪器和试剂如下：
ptc-255pcr扩增仪，美国mjresearch公司；
焦磷酸测序仪，武汉菲思特生物科技有限公司；
taqdna聚合酶、dntps(10mmol/l)、10×buffer和mgcl2(25mmol/l)(大连takara公司)；amplitaqgold聚合酶(appliedbiosystems公司)；klenowfragment(无外切酶活性)、乙烯基吡咯烷酮(pvp)和luciferase(promega公司)，牛血清白蛋白(bsa)、aps和apyrase(sigma公司)，α-硫化脱氧三磷酸腺苷(datpαs)、dgtp、dttp和dctp(amershampharmaciabiotech公司)；atpsulfurylase由本公司实验室表达；其它试剂均为分析纯，所有试剂均用灭菌去离子水稀释。试剂盒中引物由上海invitrogen公司合成，具体引物名称及序列请见序列表。
本发明中的快速扩增检测试剂盒包括：引物扩增组和焦磷酸测序组，其中引物扩增组包括扩增引物、dna聚合酶、扩增缓冲液、dntps和mg2+，焦磷酸测序组包括退火引物、dna聚合酶(amplitaqgold聚合酶)、atp硫酸化酶(atpsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)和dntp，以及配置反应液用的klenow酶(klenowfragment)。
试剂盒中配有完整的操作方法，如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。
一、扩增引物设计
本发明中采用线性指数pcr对msa2756g的snp片段进行扩增，msa2756g的rs号为1805087，序列长1101bp，snp位点位于第501位，发生错配时可能发生a/c错配，具体序列如序列表seqidno:1所示，r表示snp位点，seqidno:1序列具体如下，下划线处表示特异性引物的连接位置：
ggcccagaatgcccatgtgtctagccttaattgttcagtcttcagtccctgcagaggtca
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根据上述基因序列，采用primerprimer5软件设计扩增和退火引物，其中e为过量引物，过量引物序列如序列表seqidno：2所示，l为限制性引物，限制性引物序列如序列表seqidno：3所示，a为扩增产物。tm值的计算采用oligoanalyzer3.1软件计算。引物序列及参数如下表1所示：
表1
二、线性指数pcr扩增
1.取样
本次实施例中选取50例人血样本进行测试，样本来源于武汉市中心血站，样本进行预处理为dna模板，避免血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
2.线性指数扩增
线性指数扩增的反应体系为25μl体系，体系中具体成分如下：
1×pcrbuffer(50mmolkcl、15mmoltris-hcl、ph8.0)、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。
扩增条件为：95℃5min，60℃扩增循环(87℃10s，66℃10s，72℃20s)，72℃延伸10min，4℃保持。
三、焦磷酸测序
3.1引物设计
根据扩增产物设计退火引物，退火引物序列如序列表seqidno：4所示：5'-ttgctcatctatggctatcttg-3'。
3.2反应液的配制
试剂a：0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶；
试剂b：试剂a，3.2u/mlapyrase。
3.3单链模板的制备
取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。
3.4焦磷酸测序
将3.3步骤中的反应溶液全部转入焦磷酸测序反应池中，按照设计好的引物顺序加入dntp，采用焦磷酸测序仪进行测序，dntp加入顺序及检测结果如图2所示，其中图2所示为碱基为c的检测结果图，图3所示为碱基为a的检测结果图。
3.5统计结果
根据对本实施例中50例样本的检测结果进行统计分析，msa2756g基因型频率分布情况如下表2所示：
表2msa2756g基因型频率分布统计表
本实施例中的检测样本较小，加之msa2756g的基因多态性位点较多且具有地域、民族分布不均的特点，故本次检测结果不代表该基因型的整体分布情况，仅表示本次实施例检测的统计结果。
结果显示，常规血样中野生纯合子(aa)的分布频率较高，野生纯合子对msa2756g的含量检测无过多影响，因此该类基因携带者在本次检查中占比较大，因此msa2756g的检测结果可信度较高，突变型纯合子(gg)的基因分布频率极少，说明该类型基因携带者缺陷较为严重。
结合检测者的血浆hcy水平，在不考虑其他原因的情况下发现，msa2756g位点的突变对hcy水平确有较大影响，因此，当检测者的msa2756g位点检测处突变后，应对该位点突变者的血浆hcy水平检测结果存疑。
本试剂盒中的检测结果不仅可以作为msa2756g的辅助判断指标，并且随着对该基因多态性位点研究的不断深入，以及基因数据库的逐渐建立，本试剂盒的检测结果可作为多种疾病的基因检测结果使用。
四、检测结果验证
4.1琼脂糖凝胶电泳
将经过线性指数扩增的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果图如图1所示，图中未标记条带为dnamarker，1～5道为随机抽取的扩增产物，6道为阴性对照。图中目的条带位置显示扩增的目的片段大小正确。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>新开源云扬（广州）医疗科技有限公司
<120>一种hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法
<130>2018
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1001
<212>dna
<213>homosapiens
<220>
<221>gene
<222>（1）..（1001）
<223>msa2756g位点基因序列
<400>1
ggcccagaatgcccatgtgtctagccttaattgttcagtcttcagtccctgcagaggtca60
aacataagcatgagcgaaggtcccccaccataaatcagactgttagcataaacgatgtga120
cgtggcccagggtgccaggtatacagtgactctcttatcaggcaggctgtcccaagggtt180
tagagtttgtctcccagaaaccagtcaaaggccagtcccttctttggcttgtgcagggtt240
tgaacatcccaagcccactgagtttaccttttcctgcacgccaggcaggaattagcacag300
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atggttttgaggagtgtaaaaggctttggatcattttagagaatttctgtcttctagttc660
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atcagaactatggtaatgaataaaacatgagttcatactcagcagggaaacaggtgctga840
aacagtgtactgaaatgactcccacagacccccattcttcaggagctaatggaagaaaat900
ggagacatgaggcaggaccagtataagccttttgcctgactgcccaacactgactgtgca960
gaatgatgttttaagaactgtccgtctcttgatcagcttca1001
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（19）
<223>msa2756g基因过量引物序列
<400>2
tcatctatggctatcttgc19
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（22）
<223>msa2756g基因限制性引物序列
<400>3
ccagtaaatgtttggctgaata22
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>misc_feature
<222>（1）..（22）
<223>msa2756g基因退火引物
<400>4
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