一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用的制作方法

(一)
技术领域：
本发明涉及一种卤代醇脱卤酶的突变体及其应用。(二)
背景技术：
：心脑血管疾病是一种严重威胁人类，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。2015年国内调血脂类药物总体市场已超过200亿元人民币，他汀类药物独占鳌头，国内他汀药物终端零售价市场达到了151.43亿元的规模，占整个降血脂用药市场近80％。其中，阿托伐他汀上市近20年的临床证明，药物安全性高、不良反应小，在降低ldl胆固醇治疗方面优于其它他汀类药物。2015年，中国阿托伐他汀总体市场达到了83.19亿元，同比上一年增长了7.97％，并仍呈现逐年上涨的趋势。随着市场竞争的日益加剧以及企业社会责任的落实，阿托伐他丁的生产技术亟需改进和创新，一方面需减少工业生产对环境资源的破坏及能源的浪费，另一方面可降低企业成本和患者用药成本，以提升整个行业的经济效益和社会效益。采用生物催化技术升级阿托伐他汀药物关鍵中间体合成技术，能够建立节能、绿色、高效的新生产工艺。卤代醇脱卤酶具有一步转化法替代高能耗和高溶剂用量的化学合成步骤，具备高效催化的特性，适用于建立低能耗、低成本和环保的阿托伐他汀侧链合成新工艺。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种高效催化合成阿托伐他汀关键中间体(3r,5r)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(a7)合成的卤代醇脱卤酶突变体及其应用。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种卤代醇脱卤酶突变体(hhec-a)，所述卤代醇脱卤酶突变体hhec-a氨基酸序列seqidno.2所示。本发明所述卤代醇脱卤酶突变体hhec-a基因是将源于根癌农杆菌agrobacteriumtumefaciens卤代醇脱卤酶hhec(氨基酸序列seqidno.4)的人工合成基因，进行体外定向进化后，最终筛选得到的突变体。本发明还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明还涉及一种所述编码基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。优选以pet28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主(大肠杆菌bl21(de3))。本发明还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体在合成阿托伐他汀关键中间体(3r,5r)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述的应用以含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的含湿菌体的发酵液为反应介质，以(3r,5s)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(d3)为底物构成ph8.0-9.0的反应体系，在35℃进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(3r,5r)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(a7)。进一步，所述反应体系中，湿菌体用量为10～30g/l发酵液，所述底物终浓度为50g/l发酵液。进一步，所述发酵液按如下方法制备：(1)菌种活化：将含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选(escherichiacoli)bl21(de3)(pet28a-hhec-a))接种到含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；种子培养基组成：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l、卡那霉素50μg/l，溶剂为去离子水，ph7.0；(2)发酵培养：将种子液按体积浓度5％的接种量接种到发酵培养基中(装液量70％)，30℃培养6h；加入终浓度为5.0-7.0mm的α-乳糖，控制发酵温度22℃，继续发酵20h，得到所述的发酵液；所述发酵培养基质量组成：1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取粉、54mm甘油、2.8mm葡萄糖、25mmna2hpo4、25mmkh2po4、50mmnh4cl、5mmna2so4、2mmmgso4、卡那霉素50μg/l，溶剂为去离子水，ph值自然。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了的1株卤代醇脱卤酶突变体，与野生酶相比，其催化活性提高了22倍，比活力提高了约20倍。将突变体hhec-a用于全细胞催化d3转化a7的反应过程，当d3的投料量为50g/l时，9小时内d3转化率为92％(部分水解)，a7得率72％。突变体hhec-a催化d3转化为a7的产物得率是野生酶hhec的4.8倍。(四)附图说明图1为pet28a-hhec载体的结构示意图。图2为突变体酶活与野生型酶hhec的酶活比较。图3为催化过程中底物d3、中间环氧产物和产物a7的变化。(a)：野生型卤代醇脱卤酶hhec全细胞催化d3转化a7的反应过程；(b)：突变体hhec-a全细胞催化d3转化a7的反应过程。图4底物d3、中间环氧产物和产物a7气相分析色谱图。(a)：0.5g/ld3(d3标准品溶解在乙酸乙酯中)的气相分析色谱图；(b)：0.5g/la7(a7标准品溶解在乙酸乙酯中)的气相分析色谱图；(c)：催化反应过程取样进行气相分析的典型色图谱。其中标记的色谱峰a、色谱峰b和色谱峰c分别是底物d3、中间环氧产物和产物a7。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：lb培养基组成：酵母粉5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl10.0g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。种子培养基组成：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nahpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.49g/l、卡那霉素50μg/l，溶剂为去离子水，ph7.0。发酵培养基组成：1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取粉、54mm甘油、2.8mm葡萄糖、25mmna2hpo4、25mmkh2po4、50mmnh4cl、5mmna2so4、2mmmgso4、卡那霉素50μg/l，溶剂为去离子水，ph值自然。实施例1、根癌农杆菌a.tumefaciens卤代醇脱卤酶hhec基因的人工合成及其突变体hhec-a的筛选一、构建高效a.tumefaciens卤代醇脱卤酶hhec基因的大肠杆菌根据genbank数据库中根癌农杆菌a.tumefaciens卤代醇脱卤酶hhec基因的氨基酸序列(id：af397296)，由基因合成公司合成密码子优化的hhec基因(序列如seqidno.3，氨基酸序列为seqidno.4所示)，该基因合成时直接插入到pet28a质粒的ndei/hindiii酶切位点之间，如图1所示，得到重组表达质粒pet28a-hhec。将重组质粒pet28a-hhec转化到e.colibl21(de3)的高效感受态细胞，在含卡那霉素的lb琼脂平板上筛选，得到重组大肠杆菌e.colibl21(de3)(pet28a-hhec)。二、卤代醇脱卤酶hhec基因的体外定向进化首先采用易错pcr方法进行定向进化和筛选。根据合成的hhec序列(seqidno.3)，设计pcr扩增引物(hhec-f:5′-gcagccatatgagcacagcgattgtgac-3′，hhec-r:5′-cagcaagctttcattcaggcattccaggccag-3′)，下划线处为ndei和hindiii的酶切位点。以质粒pet28a-hhec为模板，采用如表1所示的pcr体系进行易错pcr反应。表1易错pcr体系的组成10×易错pcr缓冲液5.0μlmncl2(5mm)4.0μl10mmdntp1.0μl10μmhhec-f2.0μl10μmhhec-r2.0μltaqdna聚合酶(5u/μl)1.5μlddh2o34.5μl总体积50μlpcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃，8min，4℃保温。pcr结束后，将pcr产物进行胶回收试剂盒纯化，并通过一步克隆法(南京诺唯赞生物科技有限公司)法，克隆到pet28a质粒的ndei/hindiii酶切位点之间。连接产物转化到e.colibl21(de3)菌株中，构建易错pcr文库。采用基于检测氯离子显色浓度的高通量方法筛选易错pcr文库(kurtovics,janssonr,mannervikb.2007.archbiochembiophys464:284-287；bergmannjg,sanikj.1957.anal.chem.29:241-243.)，可以快速检测对底物(3r,5s)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(d3)催化活性显著提高的突变菌落。挑选的阳性克隆，用于进一步复筛，并测序验证，而后用于下一轮的易错pcr。通过五轮的易错pcr筛选得到催化活性提高5.6倍的突变体hhec-05，氨基酸突变位点如下：v9i、q87r、y177t、k203r、v205y、w237t。为进一步提高卤代醇脱卤酶对底物d3的催化活性，对hhec-05进行同源建模，通过分子对接，筛选最优构型，分析底物结合位点的关键氨基酸残基，包括q72、a83、p84、t134和p135，进行定点饱和突变，通过quickchange的方法引入nnk简并密码子(n:a/c/g/t；k:g/t)来替代目的氨基酸。在72位引入nnk简并密码子的定点突变引物为：72f：5’-gcggtgacctcagcttatggcnnkgtggatgtactggtgagcaac-3’72r：5’-gttgctcaccagtacatccacmnngccataagctgaggtcaccgc-3’在83和84位引入nnk简并密码子的定点突变引物为：8384-f:5’-gtgagcaacgatattttcnnknnkgaattcagaccgattgataag-3’8384-r:5’-cttatcaatcggtctgaattcmnnmnngaaaatatcgttgctcac-3’在134和135位引入nnk简并密码子的定点突变引物为：1345-f:5’-atcatctttattacgagcgcgnnknnktttggaccgtggaaagaactg-3’1345-r:5’-cagttctttccacggtccaaamnnmnncgcgctcgtaataaagatgat-3’quickchange法重叠延伸pcr具体实施条件如下：pcr反应体系均为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmix1μl，10μm正向引物1μl，10μm反向引物1μl，模板dna1μl，max聚合酶1μl，双蒸水补齐至50μl；pcr反应扩增条件：94℃预变性5min；随后进行94℃1min，56℃50s，72℃50s30个循环；最后保存在4℃。在上述通过pcr扩增得到的片段中加入限制性内切酶dpni，置于37℃金属浴中温浴30分钟进行酶切消化，将体系置于80℃金属浴中温浴30分钟灭酶。最后将酶切后的pcr产物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。采用上述的基于氯离子浓度显色的高通量筛选方法，对突变文库进行筛选，最终筛选得到突变体hhec-a(核苷酸序列如seqidno.1，氨基酸序列为seqidno.2所示)。实施例2卤代醇脱卤酶突变体hhec-a与亲本的催化特性比较一、卤代醇脱卤酶的诱导表达将e.colibl21(de3)(pet28a-hhec-a)、e.colibl21(de3)(pet28a-hhec-05)和野生型e.colibl21(de3)(pet28a-hhec)分别接种在含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃摇床培养至对数生长中期，获得种子液。将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量接种到发酵培养基中，30℃，培养6h；加入终浓度为5.6-7.0mm的α-乳糖，控制发酵温度22℃，继续发酵12h，得到表达卤代醇脱卤酶的菌液。二、卤代醇脱卤酶的纯化将发酵的菌液在4℃、9000×g离心10min，收集细胞；采用20mm的磷酸缓冲液(ph7.0)重新悬浮细胞，采用高压匀浆机进行细胞破碎；细胞破碎液进行离心，12000×g离心10min，收集上清液；将获得的上清液加入ni-nta亲和层析柱，上样后使用1×bindingbuffer洗脱直至吸光值平稳，分别加入终浓度50mm、100mm、150mm、200mm、250mm咪唑水溶液洗脱目的蛋白。通过酶活测定和sds-page分析，发现突变酶主要出现在150mm咪唑水溶液中，且条带单一。将含有目的蛋白的洗脱液通过gepd-10脱盐柱，使用20mm磷酸缓冲液(ph7.0)洗下目的蛋白。之后使用蛋白超滤离心管浓缩，从而得到酶液。三、卤代醇脱卤酶的酶学性质的测定(1)样品酶活测定：吸取上述制备的酶液0.05ml，加入0.44ml的50mmtris/so4(ph7.0)缓冲液，置于30℃水浴预热5min；加入0.01ml的质量浓度2％d3的甲醇溶液，开始酶的反应；反应20min后，加入0.2ml的饱和hg(scn)2乙醇溶液和1.8ml的60g/lfenh4(so4)2·12h2o(溶解在1mol/lhno3中)溶液，在460nm检测反应液的吸光度，与标准氯离子浓度标准曲线的吸光值对照，测定反应液中的氯离子浓度。氯离子浓度标准曲线绘制：①配置浓度为0mm、6mm、12mm、18mm、24mm和30mm的nacl水溶液；②采用96孔板，各孔中分别加入各个nacl水溶液40μl、饱和硫氰酸汞乙醇溶液60μl和150μl的60g/lfenh4(so4)2·12h2o(溶解在1mol/lhno3中)溶液，在460nm检测反应液的吸光值，绘制氯离子浓度标准曲线。以氯离子浓度(mm)为横坐标x，a460的吸光值为纵坐标y，线性拟合，可得到标准曲线方程：y＝0.0745x-0.023，r2＝0.995。酶活单位定义：1u酶活单位定义为每分钟酶催化反应产生1.0μmol氯离子所需的酶量。突变体hhec-05、突变酶hhec-a的酶活与野生型酶hhec的酶活比较如图2所示。其中，由易错pcr筛选的突变体hhec-05，其催化的相对活性是野生酶的5倍；经过关键氨基酸残基饱和突变，作进一步突变和筛选的突变体hhec-a，其相对酶活是野生酶的22倍。(2)酶液样品的蛋白质浓度测定：bradford法测定溶液中蛋白浓度，取200μl待测样品(酶液)加入2mlbradford试剂(bio-rad)，混匀后迅速在595nm下测定吸光值，空白为ph6.5磷酸盐缓冲液，每组样品三个平行。以牛血清蛋白(bsa)作为标样蛋白样品绘制标准曲线：首先配制1.0mg/ml的标准bsa水溶液；在各支试管中分别加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml的标准bsa水溶液，然后用去离子水补充到0.1ml；在各支试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g-250试剂，漩涡震荡混匀；放置约5min后，进行分光光度计分析。以蛋白质浓度(mg/ml)为横坐标x，以吸光值为纵坐标y，其标准曲线方程为y＝0.0042x+0.0082，r2＝0.958。将酶液样品的吸光值对照标准曲线可得酶液的蛋白浓度，不同样品蛋白浓度不同。(3)动力学参数测定：改变步骤(1)底物d3的添加量，终浓度分别为0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm、2.0mm和5.0mm，测定其初始反应速率，并根据米氏方程的双倒数法作图，进行线性拟合，计算得到酶的动力学参数，包括km和kcat值。突变酶hhec-a的酶活与野生型酶hhec的酶催化动力学参数比较如表1所示。表1野生型酶hhec与突变体hhec-a的催化性质比较卤代醇脱卤酶比活力(u/mg)km(mm)kcat(s-1)kcat/km(s-1·mm-1)hhec0.35±0.02112.8±0.26987.6突变体hhec-a7.2±0.154.6±0.1722348.5实施例3突变体hhec-a在催化(3r,5s)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(d3)转化为(3r,5r)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(a7)中的应用(1)菌种活化将表达突变体hhec-a的大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)(pet28a-hhec-a)命名为e.coliief-hheca。将该菌株的单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。将表达亲本的菌株(escherichiacoli)bl21(de3)(pet28a-hhec)单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。(2)2l发酵罐中的菌剂制备将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到1.5l的发酵培养基(装液量70％)中，30℃培养6h；加入终浓度为7.0mm的α-乳糖，控制发酵温度22℃，继续发酵20h，得到脱卤酶突变体hhec-a或脱卤酶亲本hhec的发酵液，菌体细胞含量为10-30g/l。(3)50ml全细胞催化转化采用50ml的全细胞酶液(即脱卤酶突变体hhec-a或脱卤酶亲本hhec的发酵液)，加入2.5g底物d3，取1.7ml的30％的nacn(过量)，溶解于3.4ml的水中，制成约质量浓度10％nacn水溶液，用于自动滴定控制反应液ph在8.0-9.0之间；将反应液置于35℃水浴进行催化反应9h。催化反应为非均相反应，过程取样检测底物d3、中间环氧产物和产物a7的动态变化，其中脱卤酶亲本hhec和脱卤酶突变体hhec-a的催化过程分别如图3中a和图3中b所示。取样方法为：连续搅拌过程中，取出100μl的反应液到1ml的乙酸乙酯中；12000×g离心5min；取上清用于气相色谱分析。同时，分别取d3标准品和a7标准品，用乙酸乙酯配制0.5g/l标准品溶液进行气相分析色谱检测。气相色谱分析方法：毛细管色谱柱：db170130m×0.53mm×1.5μm；柱温：100℃以20℃/min升温至200℃，保温20min；进样口温度：140℃；检测器温度：260℃；载气(n2)：5ml/min；分流比：20:1；进样量：1μl；空白溶液：乙酸乙酯。底物d3的出峰时间一般为4.8-5.0min，中间产物环氧物的出峰时间为3.4-3.5min，产物a7的出峰时间为6.5-7.0min。其气相色谱图如图4所示。脱卤酶亲本hhec的催化反应结果：底物d3投料量2.5g，在50ml反应体系中，其投料浓度为50g/l经过9h的全细胞催化，测得底物d3残留为1.35g，即底物转化率为46％(部分水解)；而产物a7生成为0.36g，产物得率为15％(部分水解)。脱卤酶突变体hhec的催化反应结果：底物d3投料量2.5g，在50ml反应体系中，其投料浓度为50g/l经过9h的全细胞催化，测得底物d3残留为0.2g，即底物转化率为92％(部分水解)；而产物a7生成为1.8g，产物生成率约为72％(部分水解)。所以，脱卤酶突变体hhec-a催化底物d3转化生成a7，其产物得率是野生型脱卤酶hhec的4.8倍。序列表<110>浙江宏元药业股份有限公司、浙江工业大学<120>一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>765<212>dna<213>agrobacteriumtumefaciens<400>1atgagcacagcgattgtgacgaaccttaaacattttggcggcatgggctcagctctgaga60cttagcgaagcgggacatacggtggcatgccatgatgaatctttcaagcaaaaggatgaa120ctggaagcgtttgcggaaacatatccgcagctgaaaccgatgagcgaacaggaaccggcg180gaactgattgaagcggtgacctcagcttatggccatgtggatgtactggtgagcaacgat240attttcccaggagaattcagaccgattgataagtatgcggtggaagattatcgcggtgcg300gtggaagcgctgcagattagaccgtttgcgctggtcaatgctgtagcgagccaaatgaaa360aagcgcaaatcaggccatatcatctttattacgagcgcggcgtcctttggaccgtggaaa420gaactgagcacgtatacgtctgctcgtgcgggcgcttgcaccttagcgaatgcgctgtct480aaagaactgggcgaatacaacattccggtgtttgcgattggaccgaacactcttcactct540gaagatagcccgtatttctatccgacagaaccgtggaaaacaaatccggaacatgtagct600catgtgcgaaaatacacggcgcttcaacgcctgggcacacaaaaagaactgggcgaactg660gttgcgtttctggctagcggcagctgcgattatcttacgggccaggtgtttacgcttgct720ggcggctttcctatgatcgaacgctggcctggaatgcctgaatga765<210>2<211>254<212>prt<213>agrobacteriumtumefaciens<400>2metserthralailevalthrasnleulyshispheglyglymetgly151015seralaleuargleuserglualaglyhisthrvalalacyshisasp202530gluserphelysglnlysaspgluleuglualaphealagluthrtyr354045proglnleulysprometsergluglngluproalagluleuileglu505560alavalthrseralatyrglyhisvalaspvalleuvalserasnasp65707580ilepheproglyglupheargproileasplystyralavalgluasp859095tyrargglyalavalglualaleuglnileargprophealaleuval100105110asnalavalalaserglnmetlyslysarglysserglyhisileile115120125pheilethrseralaalaserpheglyprotrplysgluleuserthr130135140tyrthrseralaargalaglyalacysthrleualaasnalaleuser145150155160lysgluleuglyglutyrasnileprovalphealaileglyproasn165170175thrleuhissergluaspserprotyrphetyrprothrgluprotrp180185190lysthrasnprogluhisvalalahisvalarglystyrthralaleu195200205glnargleuglythrglnlysgluleuglygluleuvalalapheleu210215220alaserglysercysasptyrleuthrglyglnvalphethrleuala225230235240glyglypheprometilegluargtrpproglymetproglu245250<210>3<211>765<212>dna<213>agrobacteriumtumefaciens<400>3atgagcacagcgattgtgacgaacgttaaacattttggcggcatgggctcagctctgaga60cttagcgaagcgggacatacggtggcatgccatgatgaatctttcaagcaaaaggatgaa120ctggaagcgtttgcggaaacatatccgcagctgaaacc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