一种生姜蛋白酶提取方法与流程

本发明属于天然产物提取
技术领域：
，具体涉及一种生姜蛋白酶提取方法。
背景技术：
：生姜(zingiberofficinaleroscoe)是一种药食兼用蔬菜，有发汗解表，解毒，止呕，杀菌等功效，是一种具有开发价值的经济作物。其中罗平小黄姜质细纤小，辣味充足，含油量较高，色泽鲜美，芳香浓郁，风味独特，是一种重要的香辛调味品。以罗平小黄姜鲜姜为原料加工制成的干姜、泡姜及其它腌制品更是风味独特，易运输保存等优点，是进一步精深加工、制药、食品生产、保健日化产品生产的重要原料。在我国的河南、山东、云南、四川等地广泛栽培。开发利用的植物蛋白酶已经是工业、食品领域的研究方向。生姜蛋白酶是从生姜根茎中提取出的一种具有水解蛋白酶类，是一种由蛋白酶、凝乳酶、胶原酶组成的复合酶，是继木瓜蛋白酶等多种植物蛋白酶发现的一种新的作用于肽键的一种巯基蛋白水解酶类。代景泉对生姜蛋白酶的深度研究发现，生姜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，因结构与木瓜蛋白酶等相似，被归为木瓜蛋白酶的新成员，属于丝氨酸家族蛋白酶，其活性部位是半胱氨酸残基上的巯基，具有蛋白酶和胶原蛋白酶的双重性质，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键。生姜蛋白酶在生产乳制品中具有分解作用，具有凝固豆乳和牛乳的作用，对酪蛋白、大豆分离蛋白等有很好的消化作用；生姜蛋白酶对肉类的嫩化；生姜蛋白酶用于酒类的澄清。基于此，获得高质量的生姜蛋白酶是人们的普遍追求。目前，对于蛋白酶的提取方法有许多，其主要有沉淀法，超滤法等。沉淀法主要是盐析沉淀法和有机溶剂提取法，具体包括硫酸铵沉淀法，丙酮沉淀法，乙醇沉淀法等。硫酸铵沉淀法提取生姜蛋白酶成本低，工艺简单。经沉淀的粗酶粉，加入硫酸铵静置沉淀，离心取沉淀，透析除盐后冷冻干燥。但是现有技术中采用硫酸铵沉淀法提取得到的生姜蛋白酶普遍具有酶活力低的问题，不能满足市场的需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生姜蛋白酶提取方法，使所提取的生姜蛋白酶具有较高的酶活力。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种生姜蛋白酶的提取方法，包括以下步骤：1)将生姜浆液与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在0～4℃条件下静置15～20min，将静置后的混合液进行固液分离，得到上清液；生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2～4ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.0～7.0；2)将所述步骤1)中得到的上清液与硫酸铵盐混合进行盐析，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为30～50％；3)将所述盐析混合液经过在15～25℃条件下静置提取，将提取料液进行固液分离，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。优选的，所述步骤1)中生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:3ml。优选的，所述步骤1)中磷酸缓冲液的ph值为6.5。优选的，所述步骤1)中磷酸缓冲液为包含以下含量的pb溶液：0.8～1.2mmol/ledta，4～6mmol/ll-半胱氨酸；所述pb溶液的摩尔浓度为0.05mol/l。优选的，所述步骤1)和步骤3)中固液分离均采用离心方法进行；所述离心的转速为3500～4500r/min；所述离心的时间为4～8min。优选的，所述步骤2)中盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为40％。优选的，所述步骤3)中静置提取的温度为18～20℃。优选的，所述步骤3)中静置提取的时间为1.5～3h。优选的，所述步骤1)中生姜在捣碎前依次进行清洗、切碎和称量。优选的，所述步骤3)中生姜蛋白萃余物经过体积浓度为75％的甲醇溶液超声提取，得到姜辣素。优选的，所述提取的超声功率为100w，超声频率为40khz。本发明提供了一种生姜蛋白酶的提取方法，将生姜浆液与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在0～4℃条件下静置15～20min，将静置后的混合液进行固液分离，得到上清液；生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2～4ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.0～7.0；将所述上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为30～50％；将所述盐析混合液经过在15～25℃条件下静置提取，固液分离，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。采用硫酸铵沉淀法优化生姜蛋白酶的提取方法，提取得到的生姜蛋白酶的酶活为316.29u，酶比活力为854.72u/mg。同时，本发明提供了一种生姜蛋白酶的提取方法，提取得到的生姜粗蛋白得率在0.037mg/g以上。进一步的，本发明提供的一种生姜蛋白酶的提取方法，还包括将得到的生姜蛋白萃余物经过75％甲醇超声提取，得到姜辣素。从生姜蛋白萃余物中进一步提取，不仅能够得到姜辣素，还能进一步提高生姜的工业生产利用率，将生产下脚料变废为宝。本发明提供的方法获得的姜辣素的得率为0.484％。附图说明图1为实施例1中牛血清白蛋白标准曲线；图2为实施例4中酪氨酸含量与吸光度值的关系；图3为实施例5中6-姜辣素标准曲线；图4为实施例6中姜辣素标准品的液相色谱图；图5为实施例6中未提取生姜蛋白酶姜粉中姜辣素的液相色谱图；图6为实施例6中提取生姜蛋白酶萃余物姜辣素的液相色谱图。具体实施方式本发明提供了一种生姜蛋白酶的提取方法，包括以下步骤：1)将生姜浆液与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在0～4℃条件下静置15～20min，将静置后的混合液进行固液分离，得到上清液；生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2～4ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.0～7.0；2)将所述步骤1)中得到的上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为30～50％；3)将所述盐析混合液经过在15～25℃条件下静置提取，固液分离，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。本发明将生姜浆液与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在0～4℃条件下静置15～20min，将静置后的混合液进行固液分离，得到上清液；生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2～4ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.0～7.0。在本发明中，生姜原料优选依次进行清洗、切碎、称量、捣碎和匀浆，得到生姜浆液。本发明对所述清洗、切碎、称量和捣碎的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的方案即可。所述生姜的种类没有特限制，采用本领域所熟知的生姜品种即可。本发明对所述捣碎的没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的捣碎方式即可。本发明实施例中，所述捣碎的方法是采用捣碎机捣碎，匀浆，四层纱布过滤，收集滤下部分。在本发明中，所述磷酸缓冲液优选为包含以下含量的pb溶液：1mmol/ledta，5mmol/ll-半胱氨酸；所述pb溶液的摩尔浓度为0.05mol/l。所述磷酸缓冲液的ph值优选为6.5。生姜浆液的质量与磷酸缓冲液的体积比优选为2g:2ml。磷酸缓冲液与生姜浆液混合有利于酶活力的保持。在本发明中，所述固液分离均优选采用离心方法进行。所述离心的转速优选为3500～4500r/min，更优选为4000r/min。所述离心的时间优选为4～8min，更优选为5min。得到的上清液后，本发明将所述上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为30～50％。本发明对所述混合方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方案即可。所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度优选为40％。本发明对所述硫酸铵盐的来源没有特限制，采用本领域所熟知的硫酸铵盐的来源即可。硫酸铵盐使盐析混合液中蛋白质物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离。得到盐析混合液后，本发明将所述盐析混合液经过在15～25℃条件下静置提取，固液分离，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。在本发明中，所述盐析混合液置于15～25℃条件下的目的是此温度条件盐析作用增强。在本发明中，静置提取的温度优选为20℃。静置提取的时间优选为1.5～3h。在本发明中，所述固液分离均优选采用离心方法进行。所述离心的转速优选为3500～4500r/min，更优选为4000r/min。所述离心的时间优选为4～8min，更优选为5min。在本发明中，所述生姜蛋白酶的蛋白含量的测定方法优选根据牛血清白蛋白标准曲线，定量测定生姜蛋白酶。在本发明中，生姜蛋白酶的酶活测定方法，包括以下步骤：将上述方案提取得到的生姜蛋白酶制成生姜蛋白酶溶液，将生姜蛋白酶溶液对酪蛋白溶液进行酶解，三氯乙酸终止酶解反应，测定酶解底物酪氨酸的含量，根据酪氨酸标准曲线方程式，计算酶解底物酪氨酸的含量，进而计算得到生姜蛋白酶活力。具体如下：将粗酶配制成适宜浓度的粗酶液。将提取的生姜蛋白酶粗酶加入磷酸缓冲液定容至15ml，用移液枪移取2ml，加入上述磷酸缓冲液稀释三倍，得到粗酶液。分别取粗酶液2.0ml与2.0ml1％的酪蛋白溶液混合，40℃水浴保温反应5min，立即加入0.4mol/l的三氯乙酸4.0ml终止反应，静置10min后过滤。对照组则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量三氯乙酸阻止反应。在275nm处以对照组溶液调消光度0，测定吸光度，取三次测定的平均值。生姜蛋白酶酶活力的定义：在一定温度下(40℃)，每分钟分解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。i.生姜蛋白酶活力(u蛋白)＝a*n*n/t其中，a表示由样品测得的od值，查标准曲线得相应的酪氨酸含量，μg/ml；n：反应液的总体积相对于测定体积的倍数；n：酶液的稀释倍数；t：反应时间。ii.生姜蛋白酶比活力的计算：[u/mg蛋白]＝u*1000/bⅲ.粗蛋白得率b(mg/g)＝c*提取液总体积*稀释倍数*10-3/样品质量其中，c表示测得od值后，查牛血清白蛋白标准曲线所得蛋白质浓度，单位为μg/ml。在本发明中，所述生姜蛋白萃余物优选经过体积浓度为体积浓度为75％的甲醇溶液超声提取，得到姜辣素。所述姜辣素绘制色谱图，再将得到色谱图与姜辣素标准品的液相色谱图比较对照，确定得到的物质为姜辣素。姜辣素的含量根据6-姜辣素标准曲线进行计算。下面结合实施例对本发明提供的一种生姜蛋白酶提取方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1选取健康的生姜用水清洗干净后切块，称量10g，捣碎，匀浆，过四层纱布，收集滤下部分；将滤下部分与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在4℃条件下静置15min，将静置后的混合液进行离心，4000r/min离心5min，得到上清液；滤下部分的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.5；将所述上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为30％；将所述盐析混合液经过在15℃条件下静置提取1.5h，离心，4000r/min离心5min，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。实施例2选取健康的生姜用水清洗干净后切块，称量10g，捣碎，匀浆，过四层纱布，收集滤下部分；将滤下部分与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在4℃条件下静置20min，将静置后的混合液进行离心，4000r/min离心5min，得到上清液；滤下部分的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:4ml；所述磷酸缓冲液的ph值为6.0；将所述上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为40％；将所述盐析混合液经过在20℃条件下静置提取3h，离心，4000r/min离心5min，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。实施例3选取健康的生姜用水清洗干净后切块，称量10g，捣碎，匀浆，过四层纱布，收集滤下部分；将滤下部分与磷酸缓冲液混合，得到的混合料液在4℃条件下静置18min，将静置后的混合液进行离心，4000r/min离心5min，得到上清液；滤下部分的质量与磷酸缓冲液的体积比为2g:2ml；所述磷酸缓冲液的ph值为7.0；将所述上清液与硫酸铵盐混合，得到盐析混合液；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为50％；将所述盐析混合液经过在25℃条件下静置提取2h，4000r/min离心5min，得到沉淀和生姜蛋白萃余液，所述沉淀为生姜蛋白酶。对比例1按照实施例1的方案提取生姜蛋白酶，不同之处是静置提取的温度为30℃，滤下部分的质量与磷酸缓冲液的体积比为1g:3ml；所述盐析混合液中硫酸铵盐饱和度为60％。重复3次试验。实施例4(1)牛血清白蛋白标准曲线绘制用0.15mol/lnacl溶液配制成100μg/ml的牛血清白蛋白溶液。取10支试管编号，每支试管按以下表格顺序分别加入0.15mol/lnacl溶液、100μg/ml牛血清白蛋白溶液、0.01％(w/v)考马斯亮蓝g-250溶液。表1牛血清白蛋白标准溶液的配置试管编号0123456789氯化钠溶液(ml)1.000.900.800.700.600.500.400.300.200.10牛血清白蛋白溶液(ml)0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.90考马斯亮蓝g—250(ml)5.005.005.005.005.005.005.005.005.005.00紫外可见分光光度计测定各溶液的吸光度，以0号试管为空白对照，在595nm处比色。以牛血清白蛋白溶液浓度(μg/ml)为横坐标，以净od值为纵坐标，绘制标准曲线(均测三次取平均值)。(2)酪氨酸标准曲线的制备：取10支试管编号，每支试管按以下表格顺序分别加入0.1mol/l的盐酸溶液、100μg/ml的酪氨酸溶液。表2酪氨酸标准溶液配制以0号试管为空白实验，将10支试管分别在275nm下测定酪氨酸溶液的的吸光度，以酪氨酸溶液的浓度为横坐标，以酪氨酸浓度对应275nm下的净od值为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程(均测三次取平均值)，见图2。将实施例1～3制备的生姜蛋白酶加入提取时所对应ph、对应浓度的磷酸缓冲液定容至15ml，用移液枪移取2ml，加入上述磷酸缓冲液稀释三倍。分别取稀释后粗酶液2.0ml与2.0ml1％的酪蛋白溶液混合，40℃水浴保温反应5min，立即加入0.4mol/l的三氯乙酸4.0ml终止反应，静置10min后过滤。对照组则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量三氯乙酸阻止反应。在275nm处以对照组溶液调消光度0，测定吸光度(均测三次取平均值)。生姜蛋白酶酶活力的定义：在一定温度下(40℃)，每分钟分解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。生姜蛋白酶活力(u蛋白)＝a*n*n/t式ⅰa表示由样品测得的od值，查标准曲线得相应的酪氨酸含量，单位μg/ml；n：反应液的总体积相对于测定体积的倍数；n：酶液的稀释倍数；t：反应时间。生姜蛋白酶比活力的计算：[u/mg蛋白]＝u*1000/b式ⅱ粗蛋白得率b(mg/g)＝c*提取液总体积*稀释倍数*10-3/样品质量式ⅲ其中，c表示测得od值后，查牛血清白蛋白标准曲线所得蛋白质浓度，单位为μg/ml。实施例1～3提取得到的生姜蛋白酶酶活力、蛋白含量、粗蛋白得率和比活力见表3。表3实施例1～3提取的生姜蛋白酶酶活力、蛋白含量、粗蛋白得率和比活力一览表实施例5标准曲线的绘制：配制浓度为1.3032mg/ml的6-姜辣素标准液，吸取标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml，分别置于至10ml容量瓶中，甲醇定容，混匀，制成浓度为0.06516、0.13032、0.26064、0.52128、1.04256μg/μl标准品溶液。色谱条件：液相色谱柱intersustain-c18(4.6mm×250mm，5um)；流速：1.0ml/min；流动相：v(甲醇)：v(水)＝60:40；检测波长：280nm；进样量：10μl；柱温：35℃。测峰面积，得到相关数据，以6-姜辣素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得回归方程：y＝6000000x+9419.7，r2＝0.9999。6-姜辣素进样在0.06516～1.04256μg/μl范围内与峰面积内呈良好线性关系。结果见图3。实施例6将实施例1～3提取过程中得到的生姜蛋白萃余物，进行姜辣素提取，高效液相色谱法绘制色谱图绘制。高效液相色谱法检测进样量10μl，色谱条件：液相色谱柱intersustain-c18(4.6mm×250mm，5um)；流速：1.0ml/min；流动相：v(甲醇)：v(水)＝60:40；检测波长：280nm；进样量：10μl；柱温：35℃。采用6-姜辣素标准品、未提取生姜蛋白酶的姜粉和提取生姜蛋白酶萃余物提取的姜辣素按照上述参数进行液相色谱检测。检测结果见图4～6。图4为6-姜辣素标准品色谱图；图5为未提取生姜蛋白酶姜粉中姜辣素的色谱图；图6为提取生姜蛋白酶萃余物中姜辣素的色谱图。由图4可知，进样量10μl的6-姜辣素标准品，峰面积为：4541193，峰高为：230284；由图5可知，进样量10μl的未提取生姜蛋白酶姜粉姜辣素提取液，峰面积为：560469，峰高为：28107；由图6可知，进样量10μl的生姜蛋白酶萃余物姜辣素提取液，峰面积为372151，峰高为18436。由图4和图6比对发现，生姜蛋白萃余液中残留的物质为姜辣素。由峰高，峰面积，经过回归方程计算得到含量。未提取生姜蛋白酶姜粉经体积浓度为75％的甲醇溶液超声提取后，姜辣素的质量含量为0.734％。生姜蛋白酶萃余物干燥后，经75％甲醇超声提取后，姜辣素的质量含量为0.484％。可能是由于蛋白酶萃余物的物料经过提取生姜蛋白酶的过程，状态疏松，颗粒密度小，纤维组织被破坏，姜辣素随着淀粉等物质的析出而部分流失。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12