本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。
背景技术：
兔病毒性出血症病毒ⅱ型(rhdv2)又称为新型兔瘟，是一种新发的、目前已广泛流行于欧洲、澳大利亚的动物传染病。该病毒可引起免疫过经典兔瘟疫苗的兔患病，同时还能感染野兔，致病率高，并且该病毒能够感染经典兔病毒性出血症病毒不能感染的小于四十日龄的幼龄家兔，其引起的主要临床症状包括急性肝坏死，气管出血，肺脏出血，肝脏出血以及坏死等，同时临床中多伴有脾脏肾脏肿大。目前该病毒在澳大利亚已经有取代经典兔瘟的趋势，而在欧洲该病毒也严重影响了养兔业发展，严重危害着野生动物的安全。在已爆发新型兔瘟的国家，例如荷兰，法国、意大利、波兰等，其仍采用经典的灭活疫苗法来防治新型兔瘟，但是传统的灭活疫苗其在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇，产生的免疫效果以及维持时间相对较短，而且需要多次注射灭活疫苗，对抗原量的需求比较大，成本相对而言也比较高；也可能产生毒性或存在潜在的对机体不利的免疫反应，与此同时灭活苗在一定程度上也存在散播强毒的潜在危险，最重要的是在灭活疫苗的制备过程中也必须使用rhdv2感染致死的兔内脏组织为原料，而如今在国内尚未有关于新型兔瘟病毒的报道，其是否由于检测手段的不完善性导致的也不得而知。rhdv2的衣壳蛋白是rhdv2的主要结构蛋白，由该病毒的vp60基因编码，该蛋白并且能够自我组装成为病毒样颗粒，病毒样颗粒不含有病毒的核酸，可以模拟病原刺激机体产生免疫保护效应，而且利用杆状病毒表达系统表达的衣壳蛋白，具有翻译后修饰功能，使得重组的蛋白在结构和功能上与天然蛋白更接近。
目前利用杆状病毒表达系统生产制备的疫苗已广泛使用于各类疾病的预防，例如乙型肝炎和人乳头瘤病毒等等。鉴于rhdv2可能对我国养兔业带来巨大的经济损失，制备该病毒的亚单位疫苗以及日后研究该病毒的检测方法对于我国养兔业具有重要的意义，也为我们未来继续研究rhdv如何演化成为rhdv2提供一定的研究基础。而目前尚未有采用杆状病毒表达rhdv2衣壳蛋白的相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。
本发明参照ncbi公布的兔病毒性出血症病毒ⅱ型rhdv2的衣壳蛋白(vp60)编码基因开放阅读框，设计了一对含有特异性酶切位点的引物，扩增rhdv2的衣壳蛋白编码基因，将扩增的基因克隆于昆虫杆状病毒表达载pfast-bac-hta中。
本发明涉及兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白基因重组杆状病毒的制备研究，通过扩增兔病毒性出血症病毒ⅱ型的衣壳蛋白vp60全长片段，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白的杆状病毒，然后将该病毒的表达产物通过相关技术手段进行了鉴定，本发明提供了一种可以成功表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白的方法，表达的衣壳蛋白可以自我包装成病毒样颗粒(viruslikeparticles)，在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症ⅱ型。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：
a、扩增rhdv2的vp60基因；
b、将步骤a得到的vp60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；
c、将步骤b得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；
d、将步骤c得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。
优选地，步骤a中，扩增rhdv2的vp60基因采用的引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选地，所述引物的酶切位点分别为gaattc和tctaga。
优选地，所述昆虫杆状病毒表达载体为pfastbac-hta；所述感受态细胞为dh10bac感受态细胞；所述昆虫细胞为sf9昆虫细胞；所述脂质体为cellfectin脂质体。本发明采用的昆虫杆状病毒表达载体pfastbac-hta含有his标签，利于后期的纯化；采用的sf9昆虫细胞是无血清培养，有利于后期大规模悬浮培养；采用cellfectin脂质体可获得更高的转染效率，若采用其他脂质体，则转化效率不高，不利于获得重组杆状病毒。
本发明还提供了一种根据前述方法制备的表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。
本发明还提供了一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的表达产物鉴定方法，包括以下步骤：将所述表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒感染昆虫细胞后进行培养，取培养的病毒上清液，通过western-blot以及ifa方法对病毒表达的特征蛋白进行鉴定。
优选地，所述表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒与昆虫细胞的比例为1:10～1:100。
优选地，所述培养条件为：28℃培养96h～120h。
本发明还提供了一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的应用，所述应用包括：采用所述表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒制备兔病毒性出血症ⅱ型亚单位疫苗，或制备rhdv2酶联免疫吸附试剂中的应用。
本发明所述的杆状病毒表达的产物与抗his蛋白的单克隆抗体存在免疫学反应。同时因为利用的该杆状病毒载体表达水平高，且含有his标签，可以方便后期的纯化步骤，可以制备成兔病毒性出血症ⅱ型亚单位疫苗，也可以作为日后建立rhdv2酶联免疫吸附试剂制备研发中的包被用抗原。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优点—表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，开展了rhdv衣壳蛋白在昆虫细胞上的表达。在表达rhdv2蛋白的过程中，通过免疫印迹、间接免疫荧光等方法表明实验获得了具有生物活性的rhdv2-vp60蛋白，并准确地鉴定了表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。并通过电镜观察发现表达的该病毒蛋白可以组装成为病毒样颗粒(viruslikeparticles)。目前，基于杆状病毒表达系统生产的疫苗已广泛使用，因为杆状病毒只能感染非脊椎动物，且其感染的宿主昆虫细胞也不能在外界寄生，因此，利用该表达系统表达的vp60蛋白具有较高的生产实践意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1rhdv2-vp60的pcr扩增图；其中：m为dna标准trans2kplusii；1为rhdv2-vp60f/r扩增片段；2为阴性对照；
图2重组质粒pfast-rhdv2-vp60的酶切鉴定图；其中：m为dna标准markertrans2kplusii；1-3为pfasthta-rhdv2-vp60经ecori和xbai双酶切的平行试验；
图3重组质粒bacmid-rhdv2-vp60的pcr扩增图；其中m：dna标准markertrans2kplusii；1-12：bacmid-rhdv2-vp60f/r扩增片段的平行试验；
图4重组质粒bacmid-rhdv2-vp60的pcr鉴定；其中m：dna标准markertrans2kplusii；1-5：bacmid-rhdv2-vp60用引物m13f和m13r的pcr产物的平行试验；
图5重组质粒在sf9昆虫细胞上表达图，其中图5a为转染bacmid-rhdv2-vp60的sf9昆虫细胞；图5b为正常sf9昆虫细胞；
图6重组蛋白的表达鉴定图；其中：m为蛋白预染marker；1为sf9昆虫细胞上清；2为sf9昆虫细胞沉淀；
图7重组杆状病毒mbacmid-rhdv2-vp60感染sf9细胞间接免疫荧光检测(ifa)；其中：图7a：感染细胞10倍荧光显微镜下视野；图7b：正常细胞10倍荧光显微镜下视野；
图8杆状病毒mbacmid-rhdv2-vp60表达的衣壳蛋白的电镜检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1.1菌种、质粒、细胞
pjet1.2-vp60质粒由荷兰瓦赫宁根大学病毒学实验室赠送，，pfastbac-hta质粒、dh10bac感受态细胞购于invitrogen公司，trans1-t1感受态细胞购于北京全式金生物有限公司，sf9昆虫细胞由本实验室保存。
1.2主要试剂
小量凝胶回收试剂盒购于上海生工生物有限公司；小量质粒提取试剂盒购于axygen公司；限制性内切酶ecori以及xbai、t4dna连接酶购于neb公司；dna标准markertrans2kplusii、peasy-blunt-zero克隆载体购于北京全式金生物有限公司；phusiondna-polymerase，sfm900ii昆虫培养基，cellfectinii转染试剂盒购于thermo-fisher公司；鼠源his标签一抗、hrp标记和fitc标记的羊抗鼠igg购于cst公司；乙醇、异丙醇等化学试剂均购于上海生工生物有限公司。
1.3引物的设计和合成
根据rhdv2序列登录号碱基序列设计了一对引物用于vp60基因的扩增和鉴定。
rhdv2f(seqidno.1)：5’-cggaattcatggagggcaaagcccgc—3’；
rhdv2r(seqidno.2)：5’-gctctagatcagacataagaaaagccattgg-3’；
下划线分别为ecori和xbai限制酶酶切位点，扩增的目的基因片段为1740bp。
参照《bac-to-bac杆状病毒表达系统》使用手册，合成用于鉴定重组病毒的通用引物m13forward(seqidno.3):5’-gttttcccagtcacgac-3’；m13reverse(seqidno.4):5’-caggaaacagctatgac-3’，引物交由上海生工生物合成。
1.4目的基因的扩增
以pjet1.2-vp60质粒为模板，rhdv2f/rhdv2r为引物，利用phusiondnapolymerase进行片段的高保真特异性扩增，得目的片段rhdv2-vp60。如图1所示，在1740bp处出现单一条带，证明获得所需的目的基因片段。
1.5克隆载体peasy-rhdv2-vp60的构建与鉴定
将步骤1.4扩增得到的目的片段与peasy-vector于室温连接半小时后，将连接产物转化至trans1-t1感受态细胞后涂板，倒置平板于37℃的恒温培养箱过夜培养，挑取单菌落进行pcr鉴定，pcr为阳性即得到了克隆载体peasy-rhdv2-vp60，将pcr为阳性的菌液进行保存。重组质粒用引物rhdv2f/rhdv2r进行pcr初步鉴定，扩增产物为1740bp，与理论值相符。
1.6重组质粒peasy-rhdv2-vp60的纯化
采用axygen公司的小提质粒提取步骤1.5的阳性菌液，获得纯化的阳性质粒peasy-rhdv2-vp60，于-20℃保存。
1.7表达载体pfast-rhdv2-vp60的构建与鉴定
将步骤1.6得到的peasy-rhdv2-vp60和昆虫杆状病毒表达载体pfastbac-hta用限制性内切酶ecori以及xbai于37℃进行双酶切，酶切后分别回收，酶切产物用t4dna连接酶16℃水浴过夜连接，将连接产物转化至trans1-t1感受态细胞，倒置平板在37℃恒温培养箱过夜培养。挑菌进行菌落pcr鉴定，同时重组阳性质粒抽提质粒后经ecori以及xbai双酶切后有1740bp的目的基因条带，大小与预期结果相符(如图2所示)，并送上海生工生物测序进一步测序结果也证实已成功插入外源基因，且阅读框正确，证明成功构建了重组质粒pfast-rhdv2-vp60。
1.8重组质粒bacmid-rhdv2-vp60的构建和鉴定
将步骤1.7鉴定正确的重组表达载体pfast-rhdv2-vp60转化dh10bac感受态细胞，涂于含有卡那霉素、四环素、庆大霉素三种抗生素的平板上，平板上同时涂布x-gal和iptg，37度培养36-48h，培养可见的白色菌落稀释后再次涂布于有卡那霉素、四环素、庆大霉素三种抗生素的平板上，平板上同时涂布x-gal和iptg，再次37℃培养36-48h。挑取单菌落，以rhdv2f/rhdv2r和m13f/m13r进行菌落pcr鉴定，获得鉴定正确的阳性菌。
1.9重组质粒的提取
参考《分子克隆手册》采用异丙醇-醋酸钠法(碱提法)提取步骤1.8得到的阳性菌的重组质粒，再次使用rhdv2f/rhdv2r以及m13f/m13r进行pcr鉴定，结果如图3和图4所示，扩增产物为4120bp，该结果证明目的基因已转座成功，重组质粒bacmid-rhdv2-vp60构建成功。
1.10重组质粒在昆虫细胞中的表达
sf9昆虫细胞在28℃培养箱使用sfm900ii昆虫培养基进行培养，参照invitrogenbac-to-bacbaculovirusexpressionsystem在cellfectin脂质体介导下将得到的重组质粒bacmid-rhdv2-vp60进行转染sf9昆虫细胞，以未转染细胞为阴性对照。每隔24h观察一次在28℃培养箱中的细胞生长情况，于96h-120h左右收取细胞培养液，3000rpm离心10min,上清液即为重组杆状病毒液，保存于4℃，命名为mbacmid-rhdv-vp60。经传代得到第三代重组病毒，进行western-blot分析其表达产物，结果为阳性时，将其分装冻存于-80℃作为种毒。
1.11表达产物的鉴定
1)western-blot鉴定
将步骤1.10中传代得到的第三代病毒mbacmid-rhdv-vp60按照1:10～1:100的比例感染sf9昆虫细胞，28℃培养72-96小时后，取病毒感染的sf9昆虫细胞的上清和沉淀进行鉴定，使用bio-rad电泳仪，将样品进行sds-page电泳，后用bio-rad半干转转膜仪将凝胶上的各条带转移至硝酸纤维素膜(nc)上，以鼠源抗his标签的单抗为一抗(1:1000倍稀释)，hrp标记的羊抗鼠igg(1；10000倍稀释为二抗)进行westernblot分析鉴定。如图5所示，28℃培养48h-60h可在倒置显微镜下观察到细胞病变，与正常细胞相比转染细胞变大变圆，细胞核增大，细胞核内出现多角体，转染96h左右约90％细胞出现感染现象。如图6所示，蛋白质分子量在63kda处出现一条特征性的条带。
2)间接免疫荧光检测(ifa)
在6孔板上，将第五代重组病毒接种对数生长期的sf9昆虫细胞，培养至发生病变约感染后48h用间接免疫荧光法检测重组蛋白的表达，使用鼠源his标签的单抗为一抗(1:200倍稀释)，fitc标记的羊抗鼠igg(1；5000倍稀释为二抗)进行鉴定。结果如图7所示，图7a和图7b的对比可见感染病毒成功表达重组蛋白的细胞出现荧光，而空白对照无荧光。
westernblot以及ifa均证明该重组病毒能够成功表达重组蛋白。
3)重组蛋白的电镜检测
将步骤1.10收集重组杆状病毒感染72h后的sf9sf昆虫细胞培养上清液(含重组蛋白)，用超声波破碎仪破碎细胞两分钟(作用5s，停顿5s)后差速离心纯化后，用1m磷钨酸进行负染制片后，透射电镜观察(图8)可发现大小约为30nm，多面体对称的病毒样颗粒，并符合典型的杯状病毒科病毒样颗粒的形态。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用
<130>dag35715
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cggaattcatggagggcaaagcccgc26
<210>2
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gctctagatcagacataagaaaagccattgg31
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gttttcccagtcacgac17
<210>4
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
caggaaacagctatgac17