一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法与流程

本发明属于分子生物学与基因工程
技术领域：
，具体涉及一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法。
背景技术：
：：近年来，我国水产养殖业发展迅猛，随着高密度、集约化、大规模水产养殖业的出现，鱼类疾病频繁爆发。水产养殖向高密度、集约化发展的同时，鱼类病害问题日益突出。其中弧菌病害是危害海水养殖鱼类最严重的细菌病害之一。弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病。弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌，是海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌，该病在全球范围内广泛发生,其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失,还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡。近几年来，我国的海水养殖病害情况非常严重。据统计，在我国已发现的几十种海水养殖病害中，以弧菌病对海水养殖造成的损失最大，几乎所有海水养殖鱼类都有感染弧菌，如石斑鱼、真鲷、卵形鲳鲹、眼斑拟石首鱼、军曹鱼等均曾患弧菌病。弧菌病严重发生时，鱼类死亡率高达90％以上，每年直接经济损失达数百亿元，给养殖生产带来巨大的经济损失，严重影响了我国海水养殖业的发展。传统防治细菌性病原菌的方法是向水体中或者鱼类饲料中添加抗生素或者直接注射抗生素等方法，这种方法不仅成本高而且由此也带来一系列问题，包括滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等不良后果。因此，弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。但一直以来缺少相应的疫苗用于防控，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。研究表明，细菌性致病菌的外膜蛋白(Outermembraneproteins,OMPs)在维持自身菌体结构及物质转运方面发挥着重要作用。但同时对于宿主来说,病原菌OMPs却是一种重要的保护性抗原，能够有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫。并且,某些OMPs还在多种病原菌间高度保守,可对不同种或同种不同血清型菌株的感染产生交叉保护,从而成为亚单位疫苗最具潜力的免疫抗原候选成分。因此，细菌外膜蛋白可以作为潜在的保护性抗原在鱼类细菌性病害的防治中得到应用。弧菌外膜蛋白免疫鱼类后能刺激鱼类产生特异性免疫反应，使鱼类获得抗病性。微萍隶属于浮萍科，又称无根萍、芜萍等，是世界上最小的被子植物。大小1-1.5mm，没有根茎叶的分化，仅以叶状体结构生存。叶状体一般为无性繁殖，即“芽殖”，进行有性生殖时，具有1雌蕊和1雄蕊。微萍通常漂浮于水面，有时会形成休眠体沉入水底，在肥力充足温度合适的条件下迅速繁殖，生长最盛时每平方米可有植物体200万个，状似一片绿色的细砂。微萍广布于世界上温带和热带地区。利用微萍的优势，将微萍经过改造后建立生物反应器生产医药和生物活性物质，可以表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等活性物质和药品。微萍生物反应器与动物细胞生物反应器相比，表达的蛋白含量更高，分离纯化更简便，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，增加了效力，减少了副作用，大大降低了成本。微萍生物反应器制药的产品质量、成本和安全方面已显现出优势，并很快得到科学家和生物制药业的认可。有科学家预测，未来5-10年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统，而微萍凭借自身的特点将在生物反应器制药方面展现独特的应用优势，具有巨大的开发应用前景。目前已经有2种浮萍成功开发为商业化生物反应器，分别是美国的BIOLEX公司用Lemnaminor建立的表达系统(简写为LEXSystemTM)和法国LemnaGene公司用Spirodelaoligorhiza建立的表达系统(简写LemnaGeneTMSA)。其中LEXSystem是一个能高水平且稳定生产药用蛋白和单克隆抗体的系统，从2004年建立该系统以来，已成功表达干扰素(IFN)、人生长素(hGH)、Fab片段、单克隆抗体、重组人类血纤维蛋白溶酶等35种蛋白。LenmaGene公司也成功生产了疫苗、蛋白质药物和工业用酶。开发微萍作为新的药用蛋白生物反应器符合时代需求，对于解决越来越突出的滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等问题有着重要的实际价值。由于微萍易于转化并能提供廉价的蛋白质源,因此利用转基因浮萍开发新型疫苗是一种最经济有效的途径,并且具有相当大的潜能。在生物反应器方面，微萍最大的优势是可表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等。微萍作为表达系统还具有一些无法取代的优点：1)无性繁殖，表达的品系可稳定遗传。2)生产周期短，浮萍大约2-3天繁殖一代，生物产量每36小时翻一番。3)表达的蛋白含量高，约占鲜重的30％左右。4)表达产物安全，微萍的整个生活史可以在严格的无菌条件完成，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，大大降低了成本。5)表达产物易于糖基化，增加了效力，减少了副作用。6)成本低于50USD/g，而动物细胞生物反应器的生产成本高达300-10000USD/g。而到目前为止，尚没有关于利用微萍作为生物反应器生产鱼类抗败血症疫苗这方面的报道。技术实现要素：：本发明针对现有原核和真核生物为宿主的生物反应器表达外源蛋白表达量低、可溶性差、无生物活性和不安全等缺点,利用自然水体常见的可食用的微萍作为生物反应器,提供了一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法。本发明的另外一个目的是获得了弧菌外膜蛋白基因LamB，并成功构建了LamB基因植物表达载体。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法，包括下述步骤：1)诱导微cluster组织:野生微萍灭菌2-3钟后，在SH培养基培养，诱导形成由畸形芽融合成集群样的Callus-likeclusters，用于后续基因转化。2)目的基因的扩增：以提取的弧菌DNA作为模版，利用PCR反应获得目的基因，反应体系的引物:LamB-F:5′-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5′-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3′，获得的PCR产物LamB基因序列为SEQIDNO.1所示。3)LamB基因与pGEM-Teasyvector载体系统连接4)LamB基因基因与植物表达载体连接：通过overlapPCR在LamB基因5’段连接组成型启动子CaMV35S、增强子(tcup)、和信号肽(Pr1b)，同时在其3’段连接蛋白质滞留信号(KDEL)、蛋白标记(MYC)和nos终止子。然后将修饰过的LamB基因连接到由相同酶切的双元载体pMYC9701上，获得植物表达载体pMYC9701-LamB，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增。5)植物表达载体pMYC9701-LamB转化根癌农杆菌EHA1056)微萍愈伤组织与农杆菌共培养：7)选择与再生培养：将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH再生培养基(0.6％agar+2％sucrose+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+300mg/Lcefo)平板上，每周换一次培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养两周。继续将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH筛选培养基(0.6％agar+2％sucrose+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+300mg/Lcefo+5mg/Lhygromycin)平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养筛选两周。再将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH(0.6％agar+2％sucrose+300mg/Lcefo+5mg/Lhygromycin)平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时继续培养筛选两周。再转移到SH叶状体诱导固体培养基(0.6％agar+2％sucrose+300mg/Lcefo)平板上，每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时诱导叶状体，获得转基因微萍植株。8)微萍转化植株的鉴定：①从最初的微萍转化植株中提取总基因组DNA,用PCR验证LamB基因的存在，来筛选转化植株；②提取微萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT-PCR鉴定LamB基因发生转录。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明成功构建了微萍高效稳定转化体系，获得了转基因微萍的稳定表达植株，并且成功表达抗弧菌病毒LamB蛋白，大大提高了微萍作为生物反应器表达外源蛋白的可操作性，并采用高效表达的启动子和信号肽,介导弧菌外膜蛋白(LamB)在微萍细胞内大量积累,最终达到较高水平,大量生产鱼类可食用的抗弧菌病疫苗，本发明不仅可以克服其他表达系统外源蛋白表达量低、可溶性差、无生物活性等问题,还可以完全杜绝动物病原菌的污染问题。本发明可以充分利用了微萍结构简单，生长繁殖快，生物量大，富含淀粉和蛋白质等优势，高效快速表达鱼类疫苗，为防止鱼类弧菌病提供了廉价、高效、安全的生物防治方法。本发明开发微萍作为生物反应器表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等，且作为表达系统还具有一些无法取代的优点：无性繁殖，表达的品系可稳定遗传；生产周期短，微萍大约2-3天繁殖一代，生物量每36小时翻一番；表达的蛋白含量高，约占鲜重的30％左右；便于分离和纯化表达产物，表达的外源蛋白可直接分泌到培养液中，价值培养成分简单，便于分离纯化，微萍也可以直接食用；表达产物安全，微萍的整个生活史可以在严格的无菌条件下完成，排除了微生物和动物细胞反应器中病院微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病原微生物的程序，大大降低了成本；表达产物易于糖基化，增加了效力，减少了副作用；成本低于50USD/g，而动物细胞生物反应器的生产成本高达300-10000USD/g。而到目前为止，尚没有关于利用微萍作为生物反应器生产鱼类抗弧菌病疫苗这方面的报道。它涉及到农杆菌介导的微萍稳定转化体系的建立，同时涉及到利用微萍作为生物反应器来高效生产鱼类抗弧菌病疫苗的一种方法。本专利利用自然水体中常见的微萍作为重组蛋白的“生产车间”,采用特异性表达的启动子和信号肽，实现抗弧菌疫苗蛋白在微萍内大量积累,获得表达目的蛋白的微萍稳定转基因株系。带有目的基因的微萍可以直接被鱼类食用以达到治病、免疫的效果，微萍作为生物反应器表达鱼类疫苗比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。附图说明图1为获得的弧菌外膜蛋白LamB基因阳性PCR鉴定图。图2为通过coclonyPCR获得的LamB基因转化到大肠杆菌中的阳性PCR鉴定图。图3为提取质粒pGEM-Teasy载体的阳性PCR鉴定图。图4为tcup-Pr1b和被修饰过的LamB基因的阳性overlapPCR鉴定图。图5为构建的LamB基因表达元件。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：1、诱导微cluster组织:野生微萍采用0.1w/v氯化汞灭菌2-3钟后，在SH培养基(1％甘露醇、1％山梨醇、2％葡萄糖、5mg/l2，4-D、0.5mg/lof6-ВА)上，在光照16h,黑暗8h,温度21℃条件下培养，期间每周更换培养基培养四个月，诱导形成由畸形芽融合成集群样的Callus-likeclusters，用于后续基因转化。2、目的基因的扩增：在28℃培养箱中过夜培养溶藻弧菌(VibrioAlginolitycus)，用于提取细菌DNA。1)将1～5ml细菌培养物以10,000rpm离心1分钟；2)除去上清液，获得溶藻弧菌菌体备用；3)使用细菌DNA提取试剂盒(TIANampBacteriaDNAkit)进行溶藻弧菌DNA的提取；4)通过Nanodrop测定DNA浓度，将提取物稀释至50μg/ml浓度。以提取的弧菌DNA作为模版，利用PCR反应获得目的基因，PCR反应体系的组成如下：反应体系的引物:LamB-F:5′-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3LamB-R:5′-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3′PCR反应条件：95℃变性5min；95℃变性30s，48℃退火45s,72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。凝胶电泳：称取0.6g琼脂糖，加入50ml的1×TAE，微波加热2分钟至沸腾，冷却2-3分钟，倒入插有梳子的凝胶电泳槽，凝固45分钟。用移液枪取1μlDNA加载缓冲液(TRANS)，5μlPCR产物，混合并加入到凝胶电泳孔中。同时在第一泳道加入5μl1kbmaker。设置凝胶电泳仪电压180V，进行凝胶电泳大约15-20分钟。然后将凝胶在溴化乙锭溶液中染色10分钟。在300nmUV下观察染色凝胶，成像，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因DNA。测序分析：把PCR产物送基因公司进行测序。通过NCBI中的BLAST进行LamB基因的同源性检索。PCR产物序列：LamB基因(PCR纯化产物)与pGEM-Teasyvector载体系统连接，步骤：反应混合物(在0.5mlPCR管中)，将反应混合物放在4℃下孵育过夜。2xrapidligationbuffer5μlpGEM-TEasyVector1μlPCRproduct3μlT4DNALigase1μlTotal10μl将步骤(1)过夜混合物转化到大肠杆菌DH5ɑ，采用电转化的方法，步骤：每50μl大肠杆菌DH5ɑ电转感受态细胞中加入2μl步骤(1)过夜混合物，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min。打开电转移，调节电压为2KV，将步骤(1)过夜混合物转移至预冷的电极杯底部轻轻敲击电极杯。将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μlSOC液体培养基：2％w/v胰蛋白胨，0.5w/v酵母提取物，0.05w/vNacl,2.5mMKcl,10mMMgcl2,20mM葡萄糖，pH7.0,重悬细胞后转移至1.5ml灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时。准备8μlIPTG(100mg/ml)和40μlX-gal(20mg/ml)涂布于添加100mg/L氨苄青霉素的固体LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNacl,6g/L琼脂，pH7.0,)上。将复苏产物于12000rpm离心1min后除去上清液，涂布平板，37℃过夜培养。挑取3-5个白斑单克隆置于5ml添加100mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNacl,pH7.0摇菌过夜。采用康为世纪质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒后于-20℃保存，并进行PCR检测和序列分析。3、目的基因与植物表达载体连接：构建表达元件：通过overlapPCR在LamB基因5’段连接组成型启动子CaMV35S、增强子(tcup)、和信号肽(Pr1b)，同时在其3’段连接蛋白质滞留信号(KDEL)、蛋白标记(MYC)和nos终止子。然后将修饰过的LamB基因连接到由相同酶切的双元载体pMYC9701上。(1)采用电转化的方法将植物表达载体pMYC9701转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增，步骤：①每50μl大肠杆菌DH5ɑ电转感受态细胞中加入2μl植物表达载体，置于冰上9-11分钟，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将步骤(1)过夜混合物转移至预冷的电极杯底部轻轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μlSOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5ml灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时。④将上步转化产物于添加了50mg/L卡那霉素的固体LB培养基涂布平板，37℃过夜培养；⑤挑取3-5个单克隆置于5ml液体LB培养基摇菌，扩大培养。⑥采用康为世纪质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒后于-20℃保存，并进行PCR检测和序列分析。(2)修饰过的目的基因与植物表达载体连接pMYC9701：目的基因与植物表达载体的步骤与连接至T载体的步骤相同，步骤：①根据选择的植物表达载体设计引物，在步骤2获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，PCR检测；②使用相同的内切酶同时双酶切上一步获得的目的基因和植物表达载体，反应体系：1μlDNA或植物表达载体，1μl内切酶A，1μl内切酶Abuffer，1μl内切酶B，1μl内切酶Bbuffer，补水至20μl,37℃培养至少4h；③将双酶切目的基因与双酶切植物表达载体连接，10μl反应体系为：2×rapidligationbuffer5μl，酶切植物表达载体1μl，酶切目的基因3μl，T4DNAligase1μl,反应体系于4℃过夜；④将步骤③的过夜混合物用电转化的方法转入大肠杆菌DH5ɑ后涂布于50mg/L卡那霉素的固体LB培养基，37℃过夜；⑤挑选3-5个单克隆置于5ml液体LB液体培养基摇菌过夜；⑥采用康为世纪质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒后于-20℃保存，并进行PCR检测和序列分析。4、植物表达载体在根癌农杆菌EHA105中的转化：(1)每50μl根癌农杆菌EHA105电转感受态细胞中加入2μl植物表达载体，置于冰上10分钟，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min；(2)打开电转移，调节电压为2KV，将步骤(1)过夜混合物转移至预冷的电极杯底部轻轻敲击电极杯；(3)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μlSOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5ml灭菌离心管中，置于28℃，200rpm复苏一小时；(4)离心，去除上清液后，取转化产物于固体YEB培养基:添加20μg/mL利福平Rifampici和50μg/mL卡那霉素Kanamycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、6g/L琼脂，pH7.0，凃板；(5)挑取单克隆置于5mL液体YEB：添加20μg/mL利福平Rifampici和100μg/mL壮观霉素Spectinomycin，6g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、6g/L琼脂，pH7.0，摇菌；(6)取2ml菌液分装于4个1.5ml灭菌离心管中按1:1储存于40％v/v甘油，并置于-80℃保存用于后续试验，剩余菌液采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒，PCR检测。5、制备侵染菌液：按照平板划线法，蘸取转化的根癌农杆菌EHA105菌液在添加20μg/mL利福平Rifampici和50μg/mL卡那霉素Kanamycin的固体YEB培养基上划线，28℃培养2-3天。添加20μg/mL利福平的YEB培养基培养根癌农杆菌EHA105电转感受态细胞用作空白对照，第2-3天进行继代培养，取根癌农杆菌EHA105于固体YEB平板上划线培养2-3天后，刮取培养的根癌农杆菌EHA105菌体至液体YEB混匀，使用biodrop微量核酸蛋白测定仪测得悬浮菌体600nm吸光度OD值1.0-1.5时，用于下一步侵染转化。6、愈伤组织与农杆菌共培养：用牙签接种转化有目的基因的农杆菌到含有10mg/mlRifampicin和50μg/mL卡那霉素Kanamycin的固体YEB培养基上，画线四条，然后在28℃培养箱内培养两天。在15ml离心管中加YEB液体培养基8ml，然后取适量活化后的农杆菌到离心管中，摇匀待用。用15ml离心管称取微萍2克，将摇匀的菌液取5ml加入到盛有微萍的离心管中，再加入1g玻璃珠，在28℃摇床中摇匀30分钟。准备20个平板，每个平板上放八张滤纸，用SH培养液将滤纸浸润，且留有0.5-1.0ml液体培养基。将摇菌管中的植物平均分配到20个平板中，在16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时。7、选择与再生培养：将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH再生培养基(0.6％agar+2％sucrose+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+300mg/Lcefo)平板上，每周换一次培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养两周。继续将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH筛选培养基(0.6％agar+2％sucrose+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+300mg/Lcefo+5mg/Lhygromycin)平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养筛选两周。再将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH(0.6％agar+2％sucrose+300mg/Lcefo+5mg/Lhygromycin)平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时继续培养筛选两周。再转移到SH叶状体诱导固体培养基(0.6％agar+2％sucrose+300mg/Lcefo)平板上，每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时诱导叶状体，获得转基因微萍植株。8、微萍转化植株的鉴定：③从最初的微萍转化植株中提取总基因组DNA,用PCR验证LamB基因的存在，来筛选转化植株；④提取微萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT-PCR鉴定LamB基因发生转录；本发明的生产周期短，微萍大约2-3天繁殖一代，生物量每36小时翻一番；表达的蛋白含量高，约占鲜重的30％左右；便于分离和纯化表达产物，表达的外源蛋白可直接分泌到培养液中，价值培养成分简单，便于分离纯化，微萍也可以直接食用；表达产物安全，微萍的整个生活史可以在严格的无菌条件下完成，排除了微生物和动物细胞反应器中病院微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病原微生物的程序，大大降低了成本；表达产物易于糖基化，增加了效力，减少了副作用；成本低于50USD/g，而动物细胞生物反应器的生产成本高达300-10000USD/g。而到目前为止，尚没有关于利用微萍作为生物反应器生产鱼类抗弧菌病疫苗这方面的报道。序列表<110>青萍湾（武汉）生物科技有限公司<120>一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法<160>1<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1029<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1ccggtggtgagctgcacgtttagctgctggttctgcattcgcagtggatttccacggtta60catgcgtgctggcgttggcgtgaacgctgacggtggtcaacaattaacattcgaaaagaa120caagatcggtcgtctaggtaatgaaagcgatatctacggcgagattcaactaggtaaaga180agtttacaacaacaacggcaaaacgttctacgtagactctatggttgcaatgacttctaa240cggttcaaacgactgggaaagcacttctgctaactgtggtttggataacggcgaagtgaa300atgtgtagacgatgcacaattcgcactacgtcagttcaacgttcaagctaaaggcctact360aaactttgctcctgaagcaacgctttgggcaggtaaacgctactaccaacgtcacgacat420tcatatctctgacttctactactggaacatctctggcgcgggcgctggtgttgaaggtat480cgaagctggtcctggtaaagtttctttcgcttgggttcgtaacgaccgcggcgatatcgc54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