本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在防治国槐腐烂病中的应用，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
国槐腐烂病，又称国槐烂皮病。该病由两种病原菌引起，分别为镰刀菌引起的镰刀菌型腐烂病和小穴壳菌型腐烂病。国槐腐烂病的发生会对国槐的生长造成危害，尤其是新栽植的幼树发病较为严重，严重影响国槐的生态生长和观赏价值，甚至导致死亡。目前，对国槐腐烂病的防治，采用的常规方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。化学防治极易造成农药残留，环境污染，同时化学农药的长期使用，使得病原菌产生抗药性，导致防治效果下降甚至失败；而抗病品种培育周期长，抗性单一；生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗菌作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发抗病性等来抑制某些病原菌的存活和活动，具有无毒、无污染、不产生抗药性、高效的优点，表现出广阔的应用前景。
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，其生理特征丰富多样，在自然界中广泛存在，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌突出的特征是能产生内生耐热以及对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性的芽孢，这有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、能够形成抗逆性较强的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌具有有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，其主要的生防机制是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于高效防治国槐腐烂病的新的微生物——枯草芽孢杆菌菌株LD1。本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是国槐)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LD1，是从山东省东营市盐碱地土壤中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.14680。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB(Luria-Bertani)培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。
(3)固体培养基配方：包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁7％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙65％。
(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种用于防治国槐腐烂病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1。
本发明还提供了一种用于防治国槐腐烂病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有腐烂病的国槐施用上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1或者上述生物防治制剂。
本发明也提供了上述枯草芽孢杆菌菌株LD1或者上述生物防治制剂在防治国槐腐烂病中的用途。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备所述枯草芽孢杆菌菌株LD1的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，并用灭菌纱布过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株LD1的孢子移植到LB液体培养基，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28～30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，并用灭菌纱布过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
其中，步骤(1)中的LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。
步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁7％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙65％。
步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂能够高效的防治国槐腐烂病，是一种极具应用前景的生物防治制剂。试验结果表明：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物防治国槐腐烂病效果显著，防治效果达到76.85％，且国槐生长健壮，无药害产生。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
实施例1
1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1的分离与纯化
本发明的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)芽孢杆菌的分离
土样于2015年5月采集自山东省东营市盐碱地，采用5点取样法，分别采集样地四周和中央的10～20cm土层的土壤，等量混匀。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
(2)国槐腐烂病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA(Potato Dextrose Agar)平板，用打孔器在芽孢杆菌、国槐腐烂病病原菌边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的菌株LD1进行鉴定。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治国槐腐烂病的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1。实验证明，该枯草芽孢杆菌固体发酵培养物在防治国槐腐烂病中显示出非常高效的防治效果。因而，本发明的枯草芽孢杆菌是具有广泛应用前景的枯草芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治国槐腐烂病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性
在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
GGGTTACCTTACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAGGTCATAGGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCCTTCCAGTTGGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCC。
该菌株LD1鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14680。
实施例2
1、枯草芽孢杆菌发酵过程
LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。
固体培养基：固料、无机盐和水，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁7％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙65％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。
大量发酵培养配方：同固体培养基配方。
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养
将枯草芽孢杆菌菌株(B.subtilis)LD1从试管斜面中挑取少量孢子，移至LB液体培养基中，29℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养
将种子液按10％的质量比接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，29℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵
将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(29℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，固体发酵培养物活性菌达30亿/克。
为了明确枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物对国槐腐烂病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年3～4月份在山东省济宁市进行了大田试验，现将试验结果报告如下：
1供试材料及方法
1.1供试药剂
按本发明实施例2发酵方法生产的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物(30亿/克)；50％退菌特可湿性粉剂(济南汤普乐生物技术有限公司生产，市售)。
1.2供试材料与防治对象
供试材料为国槐；防治对象为国槐腐烂病(Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.)。
1.3试验地情况
试验地设在山东省泰安市宁阳县西疏镇，该镇国槐腐烂病近几年发生严重。试验在国槐苗圃中进行，试验土壤为轻粘壤土，有机质含量为0.98％，pH为7.2，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时国槐腐烂病处于发病初期。
1.4试验设计及安排
本试验共3个处理，分别为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物10倍液、50％退菌特可湿性粉剂300倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理120株。于2016年3月28日、4月5日和4月12日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件
第1次施药(3月28日)当日多云，风力3级，最高气温为12.1℃，最低气温为2.9℃，相对湿度为35％。第2次施药(4月5日)，当日少云，风力2级，最高气温为16.5℃，最低气温为-2.3℃，相对湿度为29％；第3次施药(4月12日)当日多云，风力2级，最高气温为14.4℃，最低气温为1.9℃，相对湿度为29％。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查120株，调查主干下部树皮，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察国槐的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
分级方法(以单株为单位)：
0级：无病班；
1级：病斑面积占发病部位树皮一周表面积的5％以下；
3级：病斑面积占发病部位树皮一周表面积的6％～10％；
5级：病斑面积占发病部位树皮一周表面积的11％～25％；
7级：病斑面积占发病部位树皮一周表面积的26％～30％；
9级：病斑面积占发病部位树皮一周表面积的50％以上。
1.5.3药效计算方法
药效按式(1)、(2)计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理施药前病情指数；
PT1————药剂处理施药后病情指数。
1.5.4对国槐生长的影响
观察药剂对国槐有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对国槐的其他有益影响(例如刺激生长等)。
用下列方式记录药害：
(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。
(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
①按照药害分级方法记录国槐的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。
药害分级方法：
—：无药害；
+：轻度药害，不影响林木生长；
++：中度药害，可复原，不会造成林木减产；
+++：中度药害，影响林木正常生长，对林木产量和质量造成一定程度的损失；
++++：严重药害，林木生长受阻，产量和质量损失严重。
②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。
2结果
2.1供试药剂对国槐腐烂病的防治效果
供试药剂对国槐腐烂病的防治效果如表1-2所示。表2结果显示，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物和50％退菌特可湿性粉剂对国槐腐烂病均有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到75％以上。
从国槐腐烂病田间试验的病情指数来看(表2)，最后一次施药后14d，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1防治效果为76.85％，明显高于50％退菌特可湿性粉剂53.40％的防治效果。
表1三种药剂处理前国槐腐烂病病害情况
表2三种药剂处理对国槐腐烂病的防治效果
2.2国槐安全性调查
经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，国槐生长健壮，无药害产生，说明枯草芽孢杆菌固体发酵培养物供试浓度对国槐安全。
3小结
3.1从病情指数和防治效果来看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1(保藏号CGMCC No.14680)对国槐腐烂病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d的防治效果达75％以上。3.2从国槐长势看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1对国槐具有促进生长效果(国槐生长健壮)，没有药害，安全可靠。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南美华景观设计工程有限公司
<120> 一株枯草芽孢杆菌及其在防治国槐腐烂病中的应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1393
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株LD1的16s rDNA基因序列
<400> 1
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