用于对短链核酸转染的SOF纳米基因载体及制备方法和应用与流程

文档序号:15457473发布日期:2018-09-15 01:30

本发明属于基因转染技术领域,具体涉及一种能够对多种细胞进行有效基因转染的纳米基因载体及其制备方法与应用。



背景技术:

基因治疗是将治疗基因或靶向基因导入靶细胞,使得治疗基因或靶向基因在细胞内表达,从而治疗因基因异常或缺陷而导致的疾病,是目前医学治疗研究领域中一种新的治疗手段,已被广泛应用于癌症、遗传性疾病、心血管疾病、感染性疾病以及自身免疫性疾病等多种疾病。基因治疗分为治疗基因或靶向基因的选择,治疗基因或靶向基因导入靶细胞和治疗基因或靶向基因在靶细胞中表达三个部分。其中最关键的部分就是第二步——治疗基因或靶向基因导入靶细胞(基因转染或基因传递)。对于游离的基因而言,其可以被内吞进入细胞,但是过程太慢且基因(DNA或RNA)对血清中的核酸酶的消化作用异常敏感,容易被降解,使得基因传递效果很差。细胞内外的障碍都会阻碍基因的传递、转录及表达,因此基因治疗需要合适的转录系统。有效的基因载体对于基因治疗手段很重要,目前的临床基因治疗的主要挑战在于缺乏高效、安全的基因载体。

基因载体大致可分为病毒类载体和非病毒类载体两大类。病毒类载体能够在多种细胞中实现高效基因转染,生物相容性好,也是目前临床基因治疗中选用较多的载体,但是,病毒转染方法存在免疫原性、遗传毒性等安全问题,且准备程序复杂,不易大规模制备,在一般实验室中很难普及。非病毒类载体,主要分为阳离子脂质体型基因载体和阳离子聚合物型基因载体,能够在一定程度上克服这些弱点,具有更好的生物安全性,且易于大规模制备。脂质体型基因载体具有操作快速简便,结果可重复,转染效率高的优点。但是,一些细胞系对阳离子脂质体型基因载体较为敏感,从而需要进行条件优化,有的细胞系不容易转染,同时血清的存在也会干扰复合物的形成,导致转染效率降低,同时研究发现阳离子脂质体型基因载体仍然含有一定的细胞毒性,可能会干扰细胞代谢,临床应用研究会有一定的限制。

近年来,科学家们已经报导了多种阳离子型聚合物材料被应用于基因载体进行基因转染的工作,阳离子聚合物是一类新兴研究的基因载体,这种阳离子聚合物型基因载体转染能力更强,在血清中具有一定的稳定性,结果可重复,但是这类材料通常限制细胞系,对细胞膜的破坏作用较大,即细胞毒性较大,难以被生物降解,同时聚合物很容易被血浆排除,较难应用于生物体内,许多研究者对阳离子聚合物型基因载体进行结构修饰,来改善其毒性和应用前景。

本发明发现三维超分子多孔有机框架材料(3D SOF)作为纳米基因载体,具有低毒、高稳定性、较高负载量、强的相互作用以及溶液相中周期排列等优点。本发明通过溶液相自组装的手段,设计合成一系列以四苯甲烷为核心,端基为芳基吡啶盐基团或者异喹啉盐基团的四面体分子,利用葫芦[8]脲(CB[8])的疏水空腔包结两分子芳基吡啶盐基团或者异喹啉盐基团,构筑一系列自组装3D SOF材料。利用其前面提到的优势,特别是水溶性、低毒、阳离子型多孔的特点,发展其成为新型的均相超分子自组装基因载体材料,从而实现其在基因治疗手段中基因转染或传递方面的应用。



技术实现要素:

本发明的目的在于克服阳离子脂质体型基因载体和阳离子聚合物型基因载体细胞毒性较大,并只对限制细胞系以及较大质粒DNA具有较高转染效率的问题,提供一种能对多种细胞进行小片段核酸高效基因转染的纳米基因载体及其制备方法和应用。

本发明提供的对多种细胞进行基因转染的纳米基因载体,是以四苯甲烷为核心,端基为芳基吡啶盐基团或者异喹啉盐基团的四面体单体分子与葫芦[8]脲(CB[8])在水相中通过自组装获得SOF纳米粒子,记为Nano-SOF-GD。粒径在10-300nm之间,粒径大小可调。该SOF材料具有介孔孔道,作为装载基因(如短链DNA分子、siRNA分子)的储纳空间。

本发明中,所述SOF纳米粒子的平均粒径在200nm以下,优选100nm以下。SOF纳米粒子水溶液的浓度在10 μM以下,优选3.33μM(即四面体单体浓度3.33μM,CB[8]浓度6.67μM)。

本发明中,所述的基因为随机合成的基因序列,可以应用于任意特定基因。

本发明中,所述的基因包括但不限于DNA中的任意一种,或其中几种的组合,小干扰RNA(siRNA)不限于任意一种,或其中几种的组合。

本发明提供的对多种细胞进行基因转染的纳米基因载体的制备方法,具体步骤如下:

(1)制备具有不同取代基的四苯甲烷衍生物作为四面体结构支点;

(2)通过四面体单体分子与CB[8]在水相中按照1:2的摩尔比进行自组装,通过超声加热等方式助溶,制备得到水溶性纳米SOF基因载体;粒径为10-300nm,记为Nano-SOF-GD。

以四面体单体分子E3和CB[8]组装为例,分别称取E3(12.5 mg)和CB[8](30 mg),加入10 mL纯水,超声,加热至80℃完全溶解,得到SOF浓度为1 mM的纳米基因载体溶液(四面体单体E3浓度1 mM,CB[8]浓度2 mM)。

步骤(1)中,所述的四苯甲烷衍生化的四面体单体分子可参考文献Nat. Commun.2014,5,5574.来制备。

本发明提供的对多种细胞进行基因转染的纳米基因载体,可用于装载DNA分子、siRNA分子等一种或多种,得到纳米载运系统。可装载不同碱基数(21-58 bp)的DNA或者siRNA,得到装载核酸的纳米载运系统。具体操作如下:

(1)将上述制备的SOF纳米粒子与不同碱基数的DNA或siRNA在水相中混合,置入DMEM培养液中,制备得到负载有DNA或siRNA的纳米基因颗粒;

DNA、siRNA负载量相对于SOF基因载体来说为150-400mg/g;

制备条件为:在含有3D SOF框架的水溶液中,加入一定量DNA,例如:取20μL浓度为250μM的3D SOF溶液,加入10μL浓度为100μM的DNA溶液,搅拌均匀,置入DMEM培养液中(最终体积为1.5 mL),制备得到运载核酸的纳米载运系统,此培养液中SOF最终浓度为3.33μM,DNA浓度为0.667μM;

(2)将步骤(1)得到载核酸的纳米载运系统,与不同细胞敷育2h后进行转染效果检测。

本发明中,SOF为阳离子多孔型材料,核酸含有磷酸负离子为阴离子型物质,利用静电作用、疏水作用等多种相互作用,并根据软硬酸碱原理实现对DNA分子、siRNA分子的包覆。

本发明通过自组装策略,在常温下构筑了一系列具有水溶性和有序性的超分子有机框架材料SOF。SOF材料本身对生物体无毒,但可以作为纳米基因载体,通过其框架的多孔性质在水相实现对DNA、siRNA的高效负载。为了达到本发明的目的,对系统组合物进行了体外荧光吸附试验、量热滴定试验、细胞毒性试验、流式细胞试验、激光共聚焦试验、western blot试验。体外荧光吸附试验用于说明本发明组合物可以吸附不同碱基数的DNA,具有明显的结合效果,量热滴定试验证实本发明组合物与DNA之间具有很强的结合作用能力以及多种结合模式,流式细胞试验用于说明本发明组合物对多种细胞都具有较高的转染量,激光共聚焦试验说明本发明组合物可以在短时间内将DNA转染进入细胞核,Western blot试验说明本发明组合物可以将siRNA转染进入细胞进行表达。通过SOF材料对Cy5标记的DNA以及siRNA的转染研究,我们发现单独Cy5标记的DNA无法进入细胞,载有Cy5标记的DNA的SOF材料有效的将DNA转染进入细胞,转染时间短,转染效果与同等DNA浓度同等时间下的Lipo2000转染的效果相比,在293A、Hela、H1299、Capan-1、PANC-1、HPDE、SiHA、Caco-2、U2OS等多种细胞中可以达到比Lipo2000高或者与之相当的转染效果。

实验说明,SOF作为一种对生物体毒性较低的可溶性多孔材料,具有良好的修饰性和温和的合成条件。这类SOF材料可作为一种新型的纳米基因载体应用在基因转染领域,将在DNA药物以及基因治疗领域具有广泛的应用前景。更重要的是,这类新型的溶液相SOF纳米基因载体,可以利用静电、疏水、氢键等多种作用,非常快速的实现对多种核酸的负载,以及不同细胞的转染,同时材料的后修饰非常方便。

本发明的纳米基因载体,可用于对多种细胞进行基因转染。本发明的SOF纳米基因载体合成简便,基因转染方法简便,转染所需浓度仅为2-10 μM,转染效果非常优越。

附图说明

图1为四面体单体分子以及葫芦[8]脲结构。Com-1~5包含于图1所描述的结构中。

图2为组装体SOF材料Com-1负载不同量的DNA后的荧光光谱。其中,(a)激发波长为405nm,(b)在最大发射波长λmax=500nm处的荧光发射强度。

图3为组装体SOF材料Com-2负载不同量的DNA后的荧光光谱。其中,(a)激发波长为335nm,(b)在最大发射波长λmax=453nm处的荧光发射强度。

图4为组装体SOF材料Com-3负载不同量的DNA后的荧光光谱。其中,(a)激发波长为405nm,(b)在最大发射波长λmax=503nm处的荧光发射强度。

图5为组装体SOF材料Com-4负载不同量的DNA后的荧光光谱。其中,(a)激发波长为310nm,(b)在最大发射波长λmax=470nm处的荧光发射强度。

图6为组装体SOF材料Com-5负载不同量的DNA后的荧光光谱。其中,(a)激发波长为300nm,(b)在最大发射波长λmax=475nm处的荧光发射强度。

图7为组装体SOF结构Com-1在水溶液中分别与单链21bp DNA作用的等温量热滴定图(a),焓变拟合曲线(b)。

图8为组装体SOF结构Com-2在水溶液中分别与单链21bp DNA作用的等温量热滴定图(a),焓变拟合曲线(b)。

图9为组装体SOF结构Com-1在水溶液中分别与双链21bp DNA作用的等温量热滴定图(a),焓变拟合曲线(b)。

图10为组装体SOF结构Com-2在水溶液中分别与双链21bp DNA作用的等温量热滴定图(a),焓变拟合曲线(b)。

图11为组装体SOF结构Com-1在DMEM培养液、293A细胞中对Cy5标记的单链21碱基DNA进行转染的激光共聚焦试验结果图。

图12为组装体SOF结构Com-1、Lipo2000在含有5%牛血清培养基、293A细胞中对Cy5标记的单链21bp DNA进行转染的激光共聚焦试验结果图;细胞敷育时间为15 min。

图13为组装体SOF结构Com-1、Lipo2000在含有5%牛血清培养基、293A细胞中对Cy5标记的单链21bp DNA进行转染的激光共聚焦试验结果图;细胞敷育时间为1h。

图14为组装体SOF结构Com-1、Lipo2000在含有5%牛血清培养基、293A细胞中对Cy5标记的单链21bp DNA进行转染的激光共聚焦试验结果图;细胞敷育时间为2h。

图15为组装体SOF结构Com-1、Com-2、Com-3、Com-4、Com-5在293A细胞中对Cy5标记的双链21bp DNA进行转染的流式细胞试验结果。细胞敷育时间为15 min。

图16为组装体SOF结构Com-1、Com-2、Com-3、Com-4、Com-5在293A细胞中对Cy5标记的双链21bp DNA进行转染的流式细胞试验结果。细胞敷育时间为1h。

图17为组装体SOF结构Com-1、Com-2、Com-3、Com-4、Com-5在293A细胞中对Cy5标记的双链21bp DNA进行转染的流式细胞试验结果。细胞敷育时间为2h。

图18-图23为组装体SOF结构Com-1、Com-2、Com-3、Com-4、Com-5对Cy5标记的单链21bp DNA进行转染的流式细胞试验结果。其中,图18:293A,图19:PANC-1,图20:SiHA,图21:HPDE,图22:Capan,图23:H1299。

图24为组装体SOF结构Com-1在293A细胞中对siRNA转染的Westernblot结果。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明,而不应理解为对本发明的限制。

实施例1:单体四面体型四苯甲烷衍生物的制备。

四面体单体分子与CB[8]的结构示意图见图1,其中以D1分子为例说明四面体四苯甲烷衍生物制备过程,Com-1~5包含于图1所描述的结构中。合成过程可以参照文献Nat. Commun.2014, 5, 5574。分别称取四(4-溴甲基苯基)甲烷(140 mg, 0.2 mmol)和异喹啉(130 mg, 1 mmol)溶于乙腈(30 mL)中,加热回流24小时后,自然冷却至室温,薄板层析检测至反应不再变化。抽滤得固体,用乙腈/甲醇(5:1)重结晶,过滤干燥后得淡黄色固体,将固体溶于20 mL水,再加入六氟磷酸铵饱和溶液(1 mL)析出固体,抽滤,将固体溶于乙腈,加入四丁基氯化铵(556 mg)析出固体,抽滤真空干燥得淡黄色固体(110 mg,51%). M.p. 267-269℃ (decomp). 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 9.74 (s, 4H), 8.51 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 8.37 (d, J = 7.6 Hz, 8H), 8.23-8.17 (m, 8H), 8.03-8.00 (m, 4H), 7.50 (s, 16H), 5.92 (s, 8H). 13C NMR (100 MHz, D2O): 149.1, 147.6, 137.3, 133.8, 131.4, 131.3, 131.2, 130.1, 128.7, 127.6, 127.1, 126.5, 64.2, 42.9。

实施例2:SOF纳米基因载体的制备。

根据我们的前序研究工作的报道(Nat. Commun.2014, 5, 5574和Chinese Chem. Lett.2017, 28, 798),端基具有芳基吡啶盐基团的四面体分子可以在水溶液中形成有序的3D超分子有机框架(SOF),将四苯甲烷衍生物与CB[8]分子以化学计量比1:2在水中混合,加热超声使样品分散溶解冷却至室温,即在水中组装得到相应的组装体,即可得到相应SOF纳米基因载体。

实施例3:SOF纳米基因载体与不同碱基数的DNA在水溶液中结合表征。

以四面体单体分子浓度为标准,配置溶度为5μM的SOF纳米基因载体溶液(四面体分子=5μM,CB[8]=10μM),保持SOF不变,加入不同比例DNA,进行荧光测试,同时将SOF纳米基因载体浓度降低一半(四面体分子=2.5μM,CB[8]=5μM),加入不同比例DNA,进行荧光测试。通过荧光测试可以确定SOF纳米基因载体与DNA有良好的相互作用,同时根据其比例关系可以确定其负载量可以达到150-400mg/g,将浓度降低后依然具有很好的负载量150-400mg/g。同时配置浓度为0.05mM的SOF纳米基因载体溶液(四面体分子=0.05mM,CB[8]=0.1mM),通过量热滴定实验,将短链核酸滴加入SOF纳米基因载体溶液,可以确定DNA与SOF之间具有很强的结合作用,且DNA与SOF之间作用模式多样。

实施例4:利用激光共聚焦实验对SOF纳米颗粒在293A细胞中的转染行为进行研究。

我们对SOF纳米基因载体在细胞中的转染行为进行了激光共聚焦实验研究,选取293A细胞系(人胚肾细胞),Cy5标记的单链核酸分子Cy5-sDNA(21bp),框架材料Com-1进行实验,在盖玻片上铺60%左右的293A细胞。分别在对应孔中加入6.67μM SOF + 0.067μM DNA,H2O+0.067μM DNA,分别敷育4h,进行无血清转染实验。实验表明,在水中很难实现DNA的自动入膜,而框架材料Com-1可以在4h内实现DNA的高效转染,转染均匀,且4h后可以明显看出DNA已经入核。同时采用相同的方法在含有血清的培养基中,选取293A细胞系,Cy5标记的单链核酸分子Cy5-sDNA(21bp),框架材料Com-1和市售Lipo2000进行实验,在盖玻片上铺60%左右的293A细胞。分别在对应孔中加入3.33μM SOF + 0.067μM DNA,空白+0.067μM DNA,Lipo2000 + 0.067μM DNA以及5%血清,分别敷育15 min、1h和2h,进行激光共聚焦检测,实验表明,在水中很难实现DNA的自动入膜,Lipo2000在1h内很少观察到,仅在2h后观察到了一定的转染现象,转染不均匀,而框架材料Com-1可以在短时间1h内实现DNA的高效转染,且2h后可以明显看出DNA已经入核,其效果要好于Lipo2000。

实施例5:SOF纳米基因载体对Cy5标记的DNA在不同细胞中进行基因转染。

为了研究SOF材料作为纳米基因载体对DNA的转染效果,我们选取多种SOF材料Com-1~5对多种细胞:293A、Hela、H1299、Capan-1、PANC-1、HPDE、SiHA、Caco-2、U2OS等进行了细胞流式研究。首先,我们用293A细胞进行框架的筛选,参考激光共聚焦实验方法,选取Cy5标记的DNA(单链21bpDNA,双链21bpDNA以及双链58bpDNA)进行了不同时间的转染实验对比,所选框架在2h后对单链21bp DNA的转染效果要明显高于Lipo2000或者与其相当,取代基为硫醚的框架在1h后即可达到95%以上。对双链21bp DNA的转染效果依然要高于或与Lipo2000相当,而对双链58bp DNA的转染效果要整体略小于Lipo2000。根据SOF框架材料的空穴大小可能其更适合于短链核酸的转染。根据293A的情况,我们对Hela、H1299、Capan-1、PANC-1、HPDE、SiHA、Caco-2、U2OS等细胞进行了单链21bp DNA转染实验发现,除了Caco-2细胞系,对于其它细胞,2h后框架的转染效果整体呈现高于或者相当于Lipo2000的效果,证实SOF纳米基因载体具有非常好的转染效果。

实施例6:SOF材料转运siRNA的Western blot实验。

转录共激活因子YAP/TAZ是器官大小和组织稳态的关键调节因子,它们的失调或者异常化往往会伴随着人类癌症的出现,YAP/TAZ持续的过表达会引起细胞增殖最终会引起肿瘤的发生。研究发现,小干扰RNA可以有效的抑制YAP/TAZ的过表达。根据DNA转运实验证实SOF材料可以作为一种良好的载体转运小片段的核酸,siRNA一般采取Western blot实验进行研究,我们选取Com-1对siRNA((YAP/TAZ) RNAi mix)进行了细胞转染实验。选取293A细胞系,并与目前市售转染试剂Lipo2000作为对照,以GAPDH(或G3PDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase))为标准化的内参进行Western blot实验:按照50%的比例准备293A细胞,对293细胞换成无血清DMEM培养液(由于RNase会破坏siRNA,整个过程中要求无RNase,包括所用的枪头,超净台等用酒精擦拭),然后按照Lipo2000的比例计算所转染的siRNA的量,方法同激光共聚焦实验,将转染4个小时的细胞,换成有血清的DMEM培养基连续培养细胞72小时,收集培养72小时后的细胞,加入150μL缓冲溶液,在100℃煮沸10min,进行Western blot试验。研究结果表明,Com-1能够将siRNA(RNAi mix)转运进入细胞后,通过siRNA可以达到抑制YAP/TAZ过表达的效果,成功实现了siRNA的转染。

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