本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人mhc(hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko)转基因小鼠模型的构建方法与应用。
背景技术：
人类主要组织相容性复合体(mhc)分子具有重要的免疫生物学和遗传生物学意义。mhc分子在人体免疫反应中是调节和作用于细胞免疫反应和体液免疫反应的关键分子。mhc呈现高度多态性，不同种族不同地域均表现出一定的差异性，而不同多态性的mhc介导的免疫学和遗传学生物作用具有特异性的差别。mhcⅱ分子通过增强人体细胞免疫和调节体液免疫反应在感染免疫中发挥重要作用。该类分子在病原感染、人类疾病易感性和异体移植排斥反应等方面发挥着十分重要的作用。人类mhc分子多态性及其介导的免疫学和遗传学生物作用在不同人群的免疫防护研究中具有重要的意义。
中国人群mhcⅱ分子限制性与欧美、中东、非洲等国家人群有根本差别。欧洲和北美人群中hla-dr01、hla-dr03和hla-dr04三种多态型分布约占人群中的80％，中东地区人群以hla-dr03、hla-dr04和hla-dr07为主；而中国人群中占优势的多态型是hla-dr09、hla-dr15和hla-dr12，其中hla-dr1约占中国总人口的10-15％，hla-dr09和hla-dr15表型频率分别为31.2％和27％。不同种族mhcⅱ类分子限制性介导的免疫学和遗传学生物作用具有的一定的差别。
技术实现要素：
本发明一个目的是提供一种制备转基因小鼠的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
将人源hla-dr15β基因和人源hla-a2基因整合到小鼠，且失活所述小鼠基因组中的β2m基因和h-2iaβ基因，得到转基因小鼠。
小鼠为野生型小鼠c57bl/6。
上述将人源hla-dr15β基因和hla-a2整合到野生型小鼠，且失活所述小鼠基因组中的β2m基因和h-2iaβ基因为将所述人源hla-dr15β基因整合到hla-a2/dr1小鼠。
所述hla-a2/dr1小鼠为在所述野生型小鼠中表达人源hla-a2基因和人源hla-dr1基因，且失活所述野生型小鼠基因组中的β2m基因和h-2iaβ基因的表达，得到转基因小鼠。
上述方法中，所述人源hla-dr15β基因的核苷酸序列为序列表中序列1第2032-2832位。
上述方法中，所述将人源hla-dr15β基因整合到小鼠是通过将所述人源hla-dr15β基因同源重组片段导入所述小鼠；
所述人源hla-dr15β基因同源重组片段包括小鼠h-2iaβ基因的5’非编码区、驱动hla-dr15β基因表达的启动子、所述人源hla-dr15β基因，终止hla-dr15β基因表达终止子和小鼠h-2iaβ基因的3’非编码区序列。
上述方法中，所述人源hla-dr15β基因同源重组片段的核苷酸序列为序列1。
所述将人源hla-dr15β基因同源重组片段导入所述hla-a2/dr1小鼠中为将所述人源hla-dr15β基因同源重组片段导入所述小鼠(hla-a2/dr1小鼠)的受精卵中。
上述的方法构建的转基因小鼠在制备评价和/或筛选能引起人hla-dr15限制性免疫反应的物质的动物模型中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备小鼠模型(评价和/或筛选能引起人免疫反应但是避免引起dr15限制性的物质)的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)按照上述的方法制备得到转基因小鼠，命名为首建鼠；
2)将所述首建鼠中的雌性和雄性杂交，得到杂交子代；
3)选择所述杂交子代或者所述杂交子代的后代中表达人源hla-a2和人源hla-dr15β基因且不表达小鼠β2m基因和不表达小鼠h-2iaβ基因的转基因小鼠，得到小鼠模型。
所述选择的方法为转基因小鼠用hla-a2基因的pcr鉴定得到570bp，且hla-dr15β基因的pcr鉴定得到481bp，β2m基因的pcr鉴定得到600bp，且h-2iaβ基因pcr鉴定得到730bp的小鼠，为目的小鼠模型；
所述pcr鉴定所需的引物和体系如下：
上述pcr鉴定所需引物如下：
a2–f：5’-ctgggtttcatccatccg-3’
a2-r:5’-gatcggtctggctctgagc-3’
dr15β-f：5’-catgccgcgcatagagagcctt-3’
dr15β-r：5’-tgagagttccagtattctgcgtc-3’
b2m-f:5’-gagctctgttttcgtctg-3’
b2m-r:5’-cttaactctgcaggcgtatg-3’
iaβ-f:5’-ttcgtgtaccagttcatggg-3’
iaβ-r:5’-tagttgtgtctgcacaccgt-3’
neo55a:5’-cctgccgagaaagtatcca-3’
上述pcr鉴定的体系具体如下：
1、鉴定hla-a2基因和dr15β的pcr反应体系为：待确定基因型的转基因小鼠的鼠尾基因组dna1μl，浓度为250nmol的引物a2-f和a2-r或dr15β-f和dr15β-r各1μl，2×taqmastermix10μl，ddh2o7μl，总体积20μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸7min。
2、鉴定b2m基因和iaβ基因的pcr反应体系为：待确定基因型的转基因小鼠的鼠尾基因组dna1μl，浓度为250nmol的引物b2m-f、b2m-r和neo55a或iaβ-f、iaβ-r和neo55a各1μl，2×taqmastermix10μl，ddh2o6μl，总体积20μl。pcr反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec，57℃复性30sec，72℃延伸30sec，共42个循环；72℃延伸7min。
上述的方法构建的转基因小鼠或上述的小鼠模型在制备和/或筛选能引起人hla-dr15限制性免疫反应的物质或产品中的应用也是本发明保护的范围；
上述的方法构建的转基因小鼠或小鼠模型在制备和/或筛选hla-dr15分子限制性产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述中，所述产品为疫苗或蛋白或多肽；
所述物质为药物或蛋白；
或所述人为中国人。
dr15分子限制性为：t细胞受体在识别抗原呈递细胞或靶细胞上的mhc分子所呈递的抗原肽时，不仅识别抗原肽，还要识别与抗原肽结合的mhc分子类型，该mhc分子为dr15分子，此现象即为dr15限制性。
t细胞表位分为mhc-i类和mhc-ⅱ限制性表位。由mhc-i限制性表位介导的cd8+t细胞应答，无论在ctl效应的应答机制及免疫保护机制方面，或是在ctl表位筛选及临床应用方面都已经开展了系统的研究。而mhc-ⅱ表位相关研究相对滞后，随着对辅助性t细胞研究的不断深入，其生物学功能及作用机制不断被挖掘出来，发现其在免疫保护中发挥着重要的作用，能有效增强和提高保护性细胞免疫和体液免疫反应，在多肽疫苗、多表位重组疫苗、治疗性疫苗等的研发中具有重要的应用价值，因此确定新的mhc-ⅱ分子及筛选新的th表位便具有重要意义。该模型可用于鉴定、分析和评价新型病原蛋白th表位或疫苗；评价研究th表位诱导的免疫反应对病原感染中的作用等。
本发明将人mhc转基因小鼠模型通过转入hlai类及ii类分子，同时敲除小鼠h-2-i/ii基因的重要组分，排除小鼠内源性h-2分子对免疫应答的竞争性抑制作用。该模型体内的免疫反应完全受人hla(humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原)分子的调节，hla分子所呈递的表位与人体基本相同，能够有效反应人体免疫反应特征，可以部分替代以人体为基础的实验，弥补了缺乏预测和评价人体免疫反应的小动物模型的不足。因此，该模型有望发展成为一种可替代传统动物模型的新型实验动物模型。
附图说明
图1为hla-dr15β转基因载体的模式图。
图2为hla-dr15β转基因载体(pet32a-hla-dr15β)的酶切鉴定结果。
图3为pet32a-hla-dr15β转基因载体pcr鉴定结果。
图4为hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型纯合子基因型的鉴定结果。
图5为hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型hla转基因分子在细胞表达的检测结果。
图6为hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型外周血t淋巴细胞的检测结果。
图7为利用ad5-ebov-np免疫hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠体液免疫的检测。
图8为利用ad5-ebov-np免疫hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠细胞免疫的检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
hla-a2/dr1(hla-a2.1-/hla-dr1-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko)转基因小鼠在文献“anthonypajot,marie-louisemichel,etal.amousemodelofhumanadaptiveimmunefunctions:hla-a2.1-/hla-dr1-transgenich-2classi-/classii-knockoutmice.eur.j.immunol,2004.34:3060–3069.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；该小鼠的制备方法如下：
hla-a2/dr1为将小鼠β2m基因和小鼠h-2iaβ基因敲除，将hla-a2基因和hla-dr1基因整合入小鼠c57bl/6基因组，得到首建鼠；再将该首建鼠与c57bl/6小鼠杂交，得到f1代杂合子小鼠，再将f1代杂合子小鼠自交得到hla-a2和hla-dr1双转基因且小鼠β2m基因和小鼠h-2iaβ基因敲除的转基因小鼠。
下述实施例中的hla-dr15首建鼠是通过外源基因的受精卵雄原核注射获得，供体受精卵取自hla-a2/dr1小鼠(雌原核和雄原核均来自hla-a2/dr1小鼠)。
抗体试剂来源：peanti-humanhla-a2抗体和fitcanti-humanhla-dr抗体均为biolegend公司产品，产品目录号分别为343306、b150108。抗peanti-mousecd3antibody抗体、fitcantipeanti-mousecd4antibody抗体和apcanti-mousepeanti-mousecd8a抗体均为biolegend公司产品。产品目录号分别为100205,100405，100711。小鼠ifn－γ抗体为bd公司产品，产品目录号为51-2525kc。生物素标记的鼠抗ifn－γ的检测抗体为bd公司产品，产品目录号为51-18118kz。aecsubstrate为bd公司产品。trans2kplusdnamarker为北京全式金生物技术有限公司产品。hla-dr15限制性表位肽纯度为95％以上，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
下述实施例中的重组腺病毒ad5-ebov-np按照如下方法制备：
序列2(包括埃博拉核蛋白2014-makona株序列(genbank:ky401672.1序列中从452位到2671位)前加入限制性内切酶ecori酶切位点，在序列2的终止密码子后加入限制性内切酶bamhi酶切位点，连接到pet32a载体上，由南京金斯瑞科技有限公司合成，即pet32a-ebov-np。padtrack重组腺病毒载体(stratagene,usa货号：240010)与目的基因pet32a-ebov-np利用限制性内切酶ecorv和sali分别进行酶切，将ebov-np基因插入padtrack重组腺病毒载体中构建成功padtrack-ebov-np。线性化的重组穿梭质粒与骨架质粒重组导入bj5183-ad-1感受态细胞(stratagene,usa，货号：240010)，筛选鉴定获得pad-ebov-np，然后转染ad-293细胞包装成功ad5-ebov-np。
实施例1、中国人群优势基因分布的hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型的建立
一、转基因载体pet32a-hla-dr15β的制备
(一)pet32a-hla-dr15β转基因载体
pet32a-hla-dr15β转基因载体模式图如图1所示，其为将序列表中序列1所示的dna分子插入pet32a载体(emdbiosciences(novagen)，目录号：69015-3)的hindiii酶切位点间得到的载体。
其中序列1所示的dna分子为hla-dr15β同源重组片段，大小为3141bp，命名为hla-dr15β，该dna分子依次包括小鼠h-2iaβ(h-2iaβ)基因的5’调控序列(2031bp)(序列1第1-2031位)、优化的hla-dr15β编码区序列(801bp)(序列1第2032-2832位)，终止hla-dr15β基因表达终止密码子序列(3bp)(序列1第2833-2835位)和小鼠h-2iaβ基因的3’非编码区序列(序列1第2836-3136位)(301bp)，在该序列两端分别加上hindiii酶切位点。
(二)pet32a-hla-dr15β转基因载体的鉴定
1、限制性内切酶hindiii酶切上述(一)制备的pet32a-hla-dr15β，得到5901bp的pet32a载体条带和3141bp的hla-dr15β同源重组片段，该酶切产物和pet32a-hla-dr15β的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。图2中，m为trans2kplusdnamarker；泳道1为pet32a-hla-dr15β；泳道2为hindiii双酶切pet32a-hla-dr15β的酶切产物。
2、设计并合成如下引物:
hla-dr15β-f：5’-catgccgcgcatagagagcctt-3’
hla-dr15β-r：5’-tgagagttccagtattctgcgtc-3’
实验组、空白对照组、阴性对照组：分别以不同浓度的pet32a-hla-dr15β、去离子水、野生型c57bl/6j小鼠基因组dna为模板，以hla-dr15β-f和hla-dr15β-r为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
pcr反应体系均为：模板1ul,浓度为250nmol的引物hla-dr15β-f和hla-dr15β-r各2μl，2×taqmastermix(北京康为世纪生物科技有限公司产品)10μl，ddh2o7μl，总体积20μl。pcr反应条件均为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃复性30sec，72℃延伸30sec，共34个循环；72℃延伸7min。
将各组的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。图3中，m为trans2kplusdnamarker；泳道1-3为以不同稀释度的pet32a-hla-dr15β为模板的实验组；泳道4为阴性对照组；a为hla-a2基因鉴定,b为hla-dr15β基因鉴定。图3表明，实验组均可以扩增出481bp的目的条带，阴性对照组没有目的条带，说明pet32a-hla-dr15β转基因载体构建正确。
二、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠构建及鉴定
hindiii酶切上述一制备的pet32a-hla-dr15β，回收3141bp的hla-dr15β同源重组片段(序列1)，按常规进行hla-a2/dr1小鼠受精卵细胞原核dna显微注射，获得hla-a2/hla-dr15首建鼠；再将其子代小鼠兄弟姊妹之间不断的相互杂交，得到转基因小鼠。
同时用pcr鉴定上述转基因小鼠，
hla-a2基因的pcr鉴定得到570bp，且hla-dr15β基因的pcr鉴定得到481bp，β2m基因的pcr鉴定得到600bp，且h-2iaβ基因pcr鉴定得到730bp，符合上述各种条件的转基因小鼠，为能够同时稳定遗传的hla-a2和hla-dr15双转基因且小鼠内源性classⅰ和classⅱ双基因敲除的转基因小鼠，命名为hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠(基因型为hla-a2+/+/hla-dr15+/+/β2m-/-/iaβ-/-)。
上述pcr鉴定所需引物如下：
a2–f：5’-ctgggtttcatccatccg-3’
a2-r:5’-gatcggtctggctctgagc-3’
dr15β-f：5’-catgccgcgcatagagagcctt-3’
dr15β-r：5’-tgagagttccagtattctgcgtc-3’
b2m-f:5’-gagctctgttttcgtctg-3’
b2m-r:5’-cttaactctgcaggcgtatg-3’
iaβ-f:5’-ttcgtgtaccagttcatggg-3’
iaβ-r:5’-tagttgtgtctgcacaccgt-3’
neo55a:5’-cctgccgagaaagtatcca-3’
上述pcr鉴定的体系具体如下：
1、鉴定hla-a2基因和dr15β的pcr反应体系为：待确定基因型的转基因小鼠的鼠尾基因组dna1μl，浓度为250nmol的引物a2-f和a2-r或dr15β-f和dr15β-r各1μl，2×taqmastermix10μl，ddh2o7μl，总体积20μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃复性30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸7min。
2、鉴定b2m基因和iaβ基因的pcr反应体系为：待确定基因型的转基因小鼠的鼠尾基因组dna1μl，浓度为250nmol的引物b2m-f、b2m-r和neo55a或iaβ-f、iaβ-r和neo55a各1μl，2×taqmastermix10μl，ddh2o6μl，总体积20μl。pcr反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30sec，57℃复性30sec，72℃延伸30sec，共42个循环；72℃延伸7min。
同时以野生型c57bl/6j小鼠的鼠尾基因组dna为模板进行上述pcr作为阴性对照、以ddh2o为模板进行上述pcr作为空白对照。鉴定hla-a2基因时以hla-a2/dr1小鼠基因组为模板的扩增hla-a2基因的pcr为阳性对照，鉴定hla-dr15β基因时以pet32a-hla-dr15β转基因载体为模板扩增hla-dr15基因的pcr为阳性对照，
各组hla-a2基因的鉴定结果如图3a所示(570bp为阳性)；各组hla-dr15β基因的鉴定结果如图3b所示(481bp为阳性)。
图3中，泳道1-5为待确定基因型的转基因小鼠；泳道6为阳性对照；泳道7为阴性对照；泳道8为空白对照；m为trans2kplusdnamarker。
图3表明，待确定基因型的转基因小鼠以及阳性对照组均有目的条带，其余组均没有目的条带。证明目的基因hla-a2和hla-dr15已整合入待确定基因型的转基因小鼠基因组中。
各组小鼠β2m基因在基因组中敲除的鉴定结果如图4a所示(600bp为阳性)；各组h-2iaβ基因在基因组中敲除的鉴定结果如图4b所示(730bp为阳性)。
图4中，泳道1-5为待鉴定基因型的转基因小鼠；泳道6为阴性对照；泳道7为阳性对照；泳道8为空白对照；m为trans2kplusdnamarker。
图4表明，待鉴定基因型的转基因小鼠以及阳性对照有单一目的条带产生，此条带是小鼠内源性β2m基因和h-2iaβ基因敲除后在相应位置插入的600bp(小鼠β2m)或730bp(h-2iaβ)的假基因片段。阴性小鼠(野生型c57bl/6j小鼠)仅出现一条260bp(小鼠β2m)或230bp(h-2iaβ)的条带。待鉴定基因型的转基因小鼠的β2m和小鼠h-2iaβ成功敲除。
三、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠的hla转基因在细胞表达的检测
取上述二得到的hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠及对照组c57bl/6j小鼠脾脏，制备成脾单细胞悬液，利用peanti-humanhla-a2antibody和fitcanti-humanhla-drantibody进行孵育标记淋巴细胞，利用流式细胞仪检测hla-a2及hla-dr15在细胞表面的表达。hla-a2在hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠(以下也称为hla-a2/dr15)脾细胞表达的检测结果如图5a所示。hla-dr51在hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko小鼠(hla-a2/dr15)脾细胞表达的检测结果如图5b所示。
图5表明，hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠hla-ⅰ及ⅱ转基因分子(即hla-a2和hla-dr15)的表达高于野生型c57bl/6j小鼠，表明该转基因小鼠表达hla-a2及hla-dr15。
四、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型外周血t淋巴细胞的测定
将上述二得到的hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠处死并取其脾脏，经组织碾磨后获得脾细胞，分别用peanti-mousecd3antibody、apcanti-mousecd8antibody、fitcanti-mousecd4antibody进行淋巴细胞标记。利用流式细胞术检测，得到的结果用flowjo软件分析，在fsc-ssc伪色图中将淋巴细胞圈门所得细胞分别在cd8-cd3和cd4-cd3伪色图中圈门获得cd8+t和cd4+t细胞进行分析。结果如图6所示。
图6中，a和b分别代表hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠(基因型为hla-a2+/+/hla-dr15+/+/β2m-/-/iaβ-/-)和野生型c57bl/6j小鼠中cd8+t细胞占总cd3+t淋巴细胞的百分比。c和d分别代表hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠(基因型为hla-a2+/+/hla-dr15+/+/β2m-/-/iaβ-/-)和野生型c57bl/6j小鼠中cd4+t细胞占总cd3+t淋巴细胞的百分比。
图6所示，a和b代表hla-a2/dr15双转基因小鼠和野生型c57bl/6j小鼠中mcd8+细胞占外周总淋巴细胞的百分比：图a所示，hla-a2/dr15小鼠外周mcd8+t淋巴细胞中约占外周总淋巴细胞的2.52％；图b所示，c57bl/6j小鼠外周mcd8+t淋巴细胞中约占外周总淋巴细胞的约占12.9％。c和d分别代表hla-a2/dr15双转基因小鼠和野生型c57bl/6j小鼠中cd4+t细胞占总cd3+t淋巴细胞的百分比：图c所示，hla-a2/dr15小鼠外周mcd4+t淋巴细胞中约占外周总淋巴细胞的13.2％，图d所示，c57bl/6j小鼠约占19.3％。该结果表明，在外源hla-a2和hla-dr15分子的调控下，hla-a2/dr15双转基因小鼠体内可产生数量相对正常的cd4+t和cd8+t淋巴细胞。mcd8+t淋巴细胞相对于野生型c57bl/6j小鼠较少，但符合已知文献报道中hla-ⅰ类转基因小鼠中mcd8+t淋巴细胞约占总淋巴细胞2％的基本规律(参见文献“anthonypajot,marie-louisemichel,etal.amousemodelofhumanadaptiveimmunefunctions:hla-a2.1-/hla-dr1-transgenich-2classi-/classii-knockoutmice.eur.j.immunol,2004；34:3060–3069.”“zhitaoru,wenjunxiao,etal.developmentofahumanizedhla-a2.1/dp4transgenicmousemodelandtheuseofthismodeltomaphladp4-restrictedepitopesofhbvenvelopeprotein.plosone,2012；7(3):32247.”)。
实施例2、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型体液免疫和细胞免疫功能的验证
(一)、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型体液免疫功能验证
hla-a2/dr1小鼠、hla-a2/dr15双转基因小鼠与对照组野生c57bl/6j小鼠(每组5只)，分别于后腿肌肉注射(股四头肌)无热源的pbs稀释后的重组腺病毒ad5-ebov-np，共免疫3次，每次免疫的间隔为三周。免疫剂量为108ifu，免疫的体积为50μl。免疫前及每次加强免疫前分别进行小鼠尾静脉采血，收集血清，存于-20℃中。
hla-a2/dr15双转基因小鼠和对照组c57bl/6j小鼠在免疫ad5-ebov-np后，在免疫前和每次免疫后10天采集小鼠血液，分离血清，并检测血清中的抗体水平，方法如下：
elisa法检测上述各组小鼠免疫后体液免疫情况及血清特异性抗体产生。elisa检测方法如下：(1)将his-ebov-np蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)用包被液稀释成4μg/ml，加到96孔板中，每孔100μl，4℃过夜包被；(2)第二日，用pbst洗液洗板3次，最后将96孔板放在干净的厨房用纸上，拍净孔中的液体；(3)封闭：每孔加入100μl封闭液(3％fbs的pbs溶液)，37℃封闭1h，弃封闭液，pbst洗液洗96孔板3次；(4)一抗：将免疫后收集的小鼠血清与封闭液按体积比1：10稀释，每孔50μl加入到相应的孔中，37℃孵育1h，弃掉一抗，用pbst洗液洗板3次；(5)二抗：hrp标记的山羊抗鼠igg二抗与封闭液按体积比1：5000进行稀释，每孔100μl加入到相应的孔中，37℃孵育1h，弃掉一抗，用pbst洗液洗板3次；(6)显色：每孔加入100μltmb显色液，避光显色5min后，加入100μlelisa终止液；(7)将96孔板置于酶标仪中读取od450nm值。通过上述方法检测hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型体液免疫反应。
各组小鼠三次免疫后血清中特异性igg抗体结果如图7所示，hla-a2/dr15双转基因小鼠血清中特异性抗ebov-np蛋白igg抗体，在一免和二免后，抗体水平变化并不大，但在免疫三次后有显著升高，而对照组c57bl/6j小鼠免疫ad5-ebov-np后，对照组c57bl/6j小鼠在初免后，血清中产生相对较高的抗体每次加强免疫后，比前一次免疫后的抗体水平有所升高。三免后，实验组与对照组的igg抗体水平相差不大。图7结果表明构建的hla-a2/dr15具有正常的体液免疫反应功能。
实施例3、hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠模型细胞免疫功能验证
根据生物信息学综合分析合成hla-dr15限制性表位肽，交由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成纯度大于95％。所合成的多肽如表1所示。
表1综合分析ebov-np蛋白9个hla-a15限制性th表位肽
用ad5-ebov-np分别免疫hla-a2/dr1小鼠、hla-a2/dr15转基因小鼠和对照c57bl/6j小鼠(免疫方法同前)(每组5只小鼠)，利用合成的9个hla-dr15限制性th表位肽，分别刺激免疫后的转基因小鼠或对照c57bl/6j小鼠脾细胞。末次免疫10天后，用elispot实验法检测t细胞反应情况。具体步骤如下：(1)包被：利用无热源pbs将purifiedanti-mouseifn-γ抗体稀释到5μg/ml，加入到96孔elispot板上，每孔100μl，置于4℃，包被过夜；(2)封闭：甩干包被液。用含10％fbs的rpmi1640培养基封闭液将96孔板清洗一次，每孔200μl，加入再加入200μl的封闭液，室温孵育2h；(3)脾细胞分离：将各组小鼠颈椎脱臼致死后，浸泡于70％左右的酒精中，置于生物安全柜中，在无菌环境下分离各组小鼠的脾脏，并于6孔板中加入5ml含有10％fbs的rpmi1640培养液，将70μm细胞筛网置于六孔板中，将取下的脾细胞置于细胞筛网中进行研磨，直至筛网上无脾组织，弃掉筛网，将脾单细胞悬液转移到15ml离心管中，4℃，1500rpm离心5min；(4)裂解红细胞：弃掉上清，沉淀细胞用acklysisbuffer重悬，37℃裂解4min，加入6ml含2％fbs的rpmi1640培养基终止裂解，4℃，1500rpm离心5min；(5)淋巴细胞计数：弃掉上清，加入5ml含2％fbs的rpmi1640培养基重悬细胞沉淀并进行计数；(6)4℃，1500rpm离心5min，弃掉上清后，再次离心；(7)制备淋巴细胞悬液：每次清洗细胞按照损失10％计算，因此，总细胞数＝细胞数/4*104*稀释倍数*0.9*0.9*5，按着细胞浓度加入含有10％fbs的rpmi1640培养液，将细胞浓度调整至107cells/ml，备用；(8)细胞激活：将步骤(7)中的细胞悬液加入到96孔板中，每孔50μl，即5*105cells/孔，每组设置2个复孔，针对埃博拉np蛋白的限制性多肽稀释到刺激浓度为10μg/ml，阳性刺激剂cona的浓度为5μg/ml，同时设置阴性对照孔，即只加入相同体积的pbs缓冲溶液和无细胞的空白孔；(9)96孔板置于37℃5％co2的培养箱中培养48h；(10)弃去细胞，每孔加入200μl蒸馏水洗板2次，每次静置3min，每孔再用200μlpbst洗液洗板3次，每次孵育3min，拍干孔内液体；(11)加入检测抗体：用含有10％fbs的pbs稀释biotinylatedanti-mouseifn-γ抗体至2μg/ml，每孔加入100μl，室温孵育2h；(12)弃掉检测抗体，每孔加入200μlpbst洗液洗板3次，每次静置3min，拍干孔内液体；(13)加入酶联抗体：enzymeconjugate(streptavidin-horseradishperoxidase)抗体与含有10％fbs的pbs按比例1∶100稀释，每孔加入100μl的稀释液，置于室温孵育1h；(14)弃液体，pbst洗液洗涤elispot板4次，每次静置2min，再用pbs洗液洗板2次；(15)显色：每孔100μl加入aec底物，室温避光显色，约5min；(16)待孔内斑点明显，用流水终止显色，去掉底部的盖子，置于室温进行风干；(17)用elispot计数仪计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌ifn－γ的细胞，各组结果以均数和组内每只小鼠检测结果表示。
结果如图8所示，在hla-dr15限制性肽al-15、ka-15、fv-15、ks-15、yn-15和ha-15的刺激下，hla-a2/dr15双转基因小鼠可产生强于c57bl/6j小鼠的ifn-γ，分别为18、40、24、25、11和15个斑点/5*105splenocytes，其显著高于对照组4、9、3、5、3、2、1个斑点/5*105splenocytes。其中多肽ka-15和ha-15产生的特异性hla-dr15限制性细胞免疫反应显著高于对照组c57bl/6j小鼠产生的。
上述结果表明，hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠和c57bl/6j小鼠经重组腺病毒ad5-ebov-np三次免疫后，能特异性地刺激hla-a2-/hla-dr15-transgenich-2classⅰ-/classⅱ-ko转基因小鼠cd8+t淋巴细胞分泌较野生型c57bl/6j小鼠更多的干扰素ifn-γ，即产生更强烈的特异性的细胞免疫反应。而c57bl/6j小鼠经重组腺病毒ad5-ebov-np三次免疫后，很少或未检测到t淋巴细胞分泌干扰素ifn-γ的情况(p<0.01)。
序列表
<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120>人mhc转基因小鼠模型a2/dr15的构建方法与应用
<160>2
<170>patentinversion3.5
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