Pon基因簇在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的用途的制作方法

专利名称：：Pon基因簇在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对氧磷酶基因簇在制备用于促进动脉粥样硬化癍块稳定性药物中的用途。本发明还涉及PON基因簇转基因小鼠模型的培育方法及PON基因簇在培育的PON基因簇阳性的动脉粥样硬化转基因小鼠模型中的用途。
背景技术：
：1.动脉粥样硬化及其癍块破裂心血管疾病是我国以及发达国家的最主要的致死和致病因素，而动脉粥样硬化是导致心血管疾病的首要因素(Libby，2002)(Glass和Witztum，2001)。现在认为导致动脉粥样硬化相关的缺血综合症(特别是心肌梗死和中风)的主要原因是动脉粥样硬化癍快的破裂和继发血栓形成，而不是癍块本身导致的血管腔狭窄(Lee和Libby，1997)。临床治疗动脉粥样硬化及其并发症迫切需要有效的针对导致癍块破裂的因素的治疗手段。氧化性低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein,oxLDL)在引发癍块形成和恶化的炎症中起着至关重要的作用(Libby，2002；Steinberg，1997)，它可以刺激内皮细胞等表达粘附分子、趋化因子及其他细胞因子，进而介导单核/巨噬细胞的粘附和招募致内皮下层，并分化为巨噬细胞(Lusis，2000)。招募来的巨噬细胞吞噬并进一步氧化LDL，过多地吞噬使其自身凋亡坏死，并转化为泡沫细胞。转化后的巨噬细胞不但形成早期的脂质条纹和坏死核心，而且因为可以分泌大量的炎症分子及基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)而成为活跃的炎症中心。活跃的炎症反应进一步推动癍块的发展，并最终导致破裂，引起并发症(Galis,2004；Schwartz等人，2007)。2.对氧磷酶(PON)和oxLDL以及动脉粥样硬化的关系2.1对氧磷酶(PON)家族介绍对氧磷酶(paraoxonases)家族又称PON家族，是一类控制酯类水解的蛋白酶家族。截至目前，研究发现该家族有3个成员PONl，P0N2和P0N3(Primo-Parmo等人，1996)，而大多数研究主要集中在PONl和P0N2上。人类PONl基因含有9个外显子和8个内含子，编码355个氨基酸组成的蛋白质，相对分子量约为43kDa(Mackness等人，1998)。对于PONl蛋白结构的研究表明，它是由6片层beta-螺旋和唯一的活性位点及一个基于His-His结构的异化中心组成(Harel等人，2004)。人类PONl基因有3个半胱氨酸残基，其中第42位和第352位形成分子内的二硫键，而第284位半胱氨酸处于游离的自由状态，是优化对氧磷酶及芳基酯酶活性所必需的。PONl在肝脏内合成进而被分泌进入血液，并专一的结合于HDL上。PONl可以水解芳香族酯类底物，例如乙酸苯酯，硫代乙酸苯酯和2-乙酸萘酯。除此之外，一些芳香内酯和脂肪内酯以及环化碳酸酯也可以被PONl水解。PONl还可以催化酯化反应的逆反应-水解反应(Mackness等人，2002；Ng等人，2001)。P0N2是对氧磷酶基因家族在染色体上的第二个成员，和PONl—样有9个外显子和8个内含子，与PONl同源性达7990%，但P0N2不存在HDL上，而是位于膜脂蛋白上。P0N2在人体肝、脑、肾等组织中广泛表达，P0N2的芳基脂酶及对氧磷酶的活性比PONl要差(Ng等人，2001)。P0N3含有5个外显子和3个内含子，编码353个氨基酸组成的蛋白质，蛋白约为40kDa，在人体内主要存在于HDL颗粒上，但是其浓度要比PONl低50倍左右(Draganov等人，2000)。P0N2和P0N3与PONl有着相当的结构和功能上的相似性。在哺乳动物的组织中，P0N2的表达很广泛，并被认为是细胞内延缓LDL氧化程度的抗氧化剂。而P0N3则是和PONl很相似，在肝脏内合成并与HDL结合发挥其抗氧化的功能(Ng等人，2005)。2.2P0N家族成员和OXLDL的关系PON是对氧磷酶，具有催化水解反应的活性，可以降解由酯化反应形成的各种酯类。而oxLDL的形成正是酯化反应，也就是说PON可以对抗oxLDL的形成。而PON家族的3个成员在机体内有着不同的分布位置，功能上却十分相似，都是具有对氧磷酶的活性，可以催化酯化反应的逆反应水解反应。因此，可以说PON正是对抗oxLDL形成的重要因素之一(Aviram禾口Rosenblat,2004)。2.3P0N家族成员在动脉粥样硬化中起的作用2.3.1P0N1和动脉粥样硬化的关系PONl存在于HDL颗粒上，可以对抗LDL的氧化，降低oxLDL的水平，达到对抗动脉粥样硬化的作用(Watson等人，1995)。PONl对抗动脉粥样硬化的作用已经由动物水平PONl的转基因和敲除实验证明。实验证明纯化的POm可以对抗LDL的氧化损伤，还可以加速氢过氧化磷脂的降解(Watson等人，1995)。而PONl可以水解人体内冠状动脉粥样癍块中的氧化性脂类也已经被证实(Hedrick等人，2000)。同时关于PONl的过表达和敲除动物实验也提示了PONl对抗动脉粥样硬化的保护性作用。PONl基因敲除小鼠，饲喂高脂饮食就会引起比对照小鼠更严重的AS的发生，而其体内的HDL也丧失了保护LDL不被氧化的作用(Shih等人，1998)。而人PONl基因过表达的小鼠在同等条件下则会对抗AS的发生(Tward等人，2002)。同时临床试验也提供了关于PONl功能的证据，PONl的SNP相关研究证明PONl体内活性低会增加罹患动脉粥样硬化的机率(Watzinger等人，2002)。2·3·2P0N2与动脉粥样硬化的关系P0N2在哺乳动物体内的表达很广范，并且被认为具有在细胞内对抗LDL氧化的作用(Ng等人，2001)。过表达P0N2的细胞可以降低细胞内LDL氧化的程度并且可以更为有效的对抗H2O2和氧化性脂类引起的细胞内氧化应激(Ng等人，2001)。同时有P0N2的动物水平的敲除研究证明其敲除鼠较同窝的野生型小鼠更易产生动脉粥样硬化癍块(Ng等人，2006)，这也有力的证明了P0N2也是具有对抗动脉粥样硬化的作用。同时，有关P0N2的SNP研究也提示了P0N2和血浆内总胆固醇浓度，甘油三酯的调控，肾病和II型糖尿病都有着密切的关系(Hegele等人，1997)。而P0N2和动脉粥样硬化发展的关系还可以通过其与患有家族遗传性的高胆固醇血症的高加索人的动脉内膜增生的关系得到解释(Leus等人，2001)。2.3.3P0N3和动脉粥样硬化的关系P0N3是一个由肝脏合成的40kDa的蛋白，在人和兔的血清中会结合在HDL上而不与LDL结合。而在HDL上，P0N3的浓度比PCMl要低50倍(Draganov等人，2000)。有研究表明，用P0N3预处理过的人动脉内皮细胞具有对抗轻微oxLDL产生并使已经形成的oxLDL失活的特性。但是P0N3的水解活性不如PONl，不能水解对氧磷脂，在HepG2细胞和高脂饮食刺激的小鼠肝脏中，P0N3的表达不受氧化性磷脂的调控。这些表明P0N3在对抗动脉粥样硬化上发挥的作用没有POm强大，但是仍有一定的功能(Reddy等人，2001)。有研究表明在动脉粥样硬化易感模型的ApoE敲除鼠中，腺病毒介导的P0N3的表达会对抗动脉粥样硬化的发生(Ng等人，2007)。而P0N3的转基因小鼠也表现出对抗动脉粥样硬化的能力(Shih等人，2007)。综上所述，PON家族的3个成员虽然在功能上效果强弱不一，但是总体上效应却是一致的，都有着对抗动脉粥样硬化发生、发展的作用，然而，已公开的数据均只是侧重于单个PON家族成员在减小动脉粥样硬化癍块面积中的作用，截止目前，尚未有关于PON家族作为一个基因簇是否能够在抑制癍块发展的基础上进一步稳定动脉粥样硬化癍块的进一步研究。
发明内容如前所述，已有的针对P0N1、P0N2和P0N3单个基因的研究表明它们能够通过抑制LDL的氧化而抑制动脉粥样硬化。本发明则涉及PON作为基因簇对动脉粥样硬化癍块的作用。因此，本发明的第一方面涉及PON基因簇在制备用于治疗哺乳动物动脉粥样硬化的药物中的用途，优选地，所述哺乳动物为小鼠或人，更优选地，所述哺乳动物为人。本发明的第二方面涉及一种PON基因簇转基因动物模型的培育方法，其包含下述步骤a)将包含人PON基因簇的载体用适当限制酶切线性化取出载体DNA，并常规处理用于显微注射；b)将上述DNA用显微注射缓冲液稀释为约l_2ng/μL，显微注射到代孕动物的受精卵；c)将注射过的受精卵置于M16培养基中，CO2孵箱37°C培养1_2天；d)将步骤c)的受精卵移卵假孕的代孕动物，娩出小动物后，通过使用PCR和SouthernBlot筛选PON基因簇阳性转基因动物。优选地，载体为BAC载体RP11-104H16，限制酶为NotI。优选地，所述动物为小鼠。优选地，所述受精卵为C57BL/6J受精卵。本发明的第三方面涉及PON基因簇在培育PON基因簇阳性的动脉粥样硬化转基因小鼠模型中的用途。优选地，在于所述转基因小鼠模型通过下述步骤获得a)将根据权利要求7获得的小鼠与动脉粥样硬化模型apoE+鼠杂交，得到PON基因簇阳性和apoE+基因型的小鼠；b)将步骤a)获得的小鼠与apoE+鼠再杂交一代，得到PON基因簇阳性和apoE+基因型的小鼠，即PON基因簇阳性的动脉粥样硬化转基因小鼠模型；及可选的c)将步骤b)获得的小鼠与apoE+鼠继续杂交以获得大量的PON基因簇阳性的动脉粥样硬化转基因小鼠。换言之，本发明选用了含全部3个PON基因序列及其相应调控序列的PON基因簇构建转基因小鼠，并将其与研究动脉粥样硬化的经典模型apoE基因敲除小鼠杂交，获得PON基因簇转基因阳性而apoE基因纯合缺失的小鼠模型进行了动脉粥样硬化相关研究，通过提取转基因小鼠的腹腔巨噬细胞研究PON基因簇在巨噬细胞系统内作用于动脉粥样硬化的机制，发现与单个PON基因，即P0N1、P0N2和P0N3的作用机理不同，PON基因簇通过促进动脉粥样硬化癍块的稳定性而实现治疗动脉粥样硬化的目的。PON基因簇的这种独特的作用机制为开发通过提高动脉粥样硬化癍块的稳定性而实现治疗动脉粥样硬化的药物提供了依据。图1显示了本发明的整体实验设计思路。图2:显示了包含有PON基因簇的基因组片段结构。显微注射的片段是一个包含有P0N1、P0N2和P0N3结构基因(阴影部分)和旁侧序列(空白部分)的长170kb的人基因组DNA。图3显示了用4对引物来通过PCR的方法鉴定BAC克隆04H16。图4显示了BAC-RPl1-104H16的PFGE图，分子量标准是来源于NEB的小片段Pi7G分子量标准N0350。图5显示了通过PCR来鉴定转基因鼠。P1-P5转基因鼠，WT:野生型，BAC:RPll-104hl6,DL2000分子量标准。图6显示了通过SouthernBlot来鉴定转基因鼠。Southernblot分析的DNA是按照如下所示分离所得的第1泳道，人基因组DNA；第2泳道，Pl株PC转基因鼠；第3泳道，P2株PC转基因鼠；第4泳道，P3株PC转基因鼠；第5泳道，P4株PC转基因鼠；第6泳道，P5株PC转基因鼠；第7泳道，野生型小鼠。所有的DNA用EcoRI消化，分别与3对引物杂交较低的引物针对人PONl基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的10090-10515位)；中间的引物是针对人的P0N3基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的96169-96727位)；更高的引物针对人的P0N2基因序列(人基因组的165366-165663位)。图7显示了人(H)P0N1、P0N2和P0N3基于在转基因鼠的组织中的表达情况，包括心脏(Ht)、肾脏(Kd)、肝脏(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小肠(In)、脾脏(Sp)、胃(St)、主动脉(Ao)、卵巢(Ov)以及脑(Br)，小鼠内源性的(M)P0N1、P0N2、P0N3和肌动蛋白作为对照。图8显示了野生型鼠的各器官中没有HPON基因的表达。图9显示了5株转基因鼠中，P2株转基因鼠在肝脏中的人PONl基因表达最高。图10显示了人P0N1、P0N2和P0N3蛋白在P2株转基因鼠的肝脏和主动脉中的表达情况。图11显示了人PONl基因在PC转基因鼠的HDL中的表达情况。图12显示了通过对氧磷酶活性试剂盒，对禁食的野生型(浅色柱)和PC转基因鼠(深色柱)地HDL进行相对的对氧磷酶活性检测。显示的数值是每种基因型各10只小鼠的平均值。*代表P<0.05。图13显示了PC转基因/ApoE+的小鼠和对照的ApoE+的小鼠相比，癍块面积更小、脂质面积更小。ApoE+小鼠AS癍块HE染色结果。PC转基因/ApoE+的小鼠⑶的癍块面积比对照组的ApoE+小鼠(A)要低30.8%(C)0PC转基因/ApoE+小鼠(B)的癍块脂质核心(图中癍块内的黑色区域)面积比对照ApoE+小鼠㈧要低13.1%(D)0*代表ρ<0.05，**代表ρ<0.01。各组中η=10。图14显示了PC转基因/ApoE+小鼠的癍块比对照ApoE+小鼠的更加稳定。分离出来的主动脉窦用油红0对脂质进行染色(Α&Β)，苦味酸和Sirius染胶原(C&D)，SMA染SMC(E&F)，Moma-2染巨噬细胞(G&H)。I:PC转基因/ApoE+小鼠的癍块与对照的ApoE+鼠相比，胶原百分比(76.9%增加)，SMC(15.8%增加)，巨噬细胞(22.3%)和脂质面积(9.5%)降低。*代表ρ<0.05，#代表ρ<0.01。各组中η=10。J:PC转基因/ApoEv-小鼠的癍块稳定性得分比ApoE+小鼠的高70%。具体实施方式通过参考下述的一些具体实施例可进一步理解本发明，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明做出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。实施例实施例1研究方法和材料转基因用细菌人工染饩体(BAC)包含人PON基因簇的BAC载体(RP11-104H16)购自ChoriBacPac公司，这个克隆包含人P0N1，P0N2和P0N3结构基因及他们相应的旁侧序列，全长170kb。如图2所示。BAC经PCR、PFGE及网上检索，确认无误。实验用小鼠及饲料C57BL/6小鼠，C57BL/6与FVB杂交Fl代雄鼠和小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。小鼠饲养于二级动物房，清洁饮水，除说明的情况外自由取食。环境采用十二小时明暗循环，早七点到晚七点照明，晚七点到次日早七点无照明。所有动物实验都按照中国医学科学院实验动物管理条例进行。用于诱导动脉粥样硬化的高脂饮食由中国医学科学院动物研究所提供，成分为每10千克含有基础食物8875g、甘油三酯lOOOg、胆固醇125g。PON基因簇转基因小鼠的构建将BACDNA用NotI酶切线性化取出载体DNA序列，并常规处理用于显微注射(Gao等人，2005)。完整DNA稀释为1.2ng/μL浓度显微注射到C57BL/6J受精卵构建PON基因簇转基因小鼠。癍块组织形杰学分析及其稳定件判断高脂饮食诱导16周后，处死小鼠。经左心室行冷PBS和4%多聚甲醛溶液相继体循环灌注。收集保留升主动脉的心脏(10只/组)以OTC包埋，之后进行主动脉根部连续冰冻切片，厚度10μm,以主动脉瓣为切片的位置标记(Ni等人，2001)。每个染色指标以5张连续的相隔80μm的切片进行分析。获得的切片先行H&E进行形态学分析。然后分别以油红0和苦味酸-天狼星红染色脂质核心和胶原；分别用抗-α-平滑肌细胞(SMC)-Actin(Abcam，ab5694抗体和抗M0MA-2(Serotec,MCA519G)抗体免疫组化染色SMC和巨噬细胞。相应的染色区域结果扫描成像后以Imag印roPlus5软件进行定量分析。癍块稳定性的比较通过分别比较癍块主要成分及脂质核心、胶原组织、平滑肌细胞和巨噬细胞的百分比进行。总体的稳定性以癍块稳定分数来反映，癍块稳定分数=(SMC面积+胶原面积)/(巨噬细胞面积+脂质核心面积)(Ni等人，2001)。统计学分析所有的值均计算为均值士标准差。两组之间的数值以Student'sttest进行检验分析。当P<0.05认为有统计学意义。实施例2研究结果BACRP11-104H16包含人完整PON基因簇元件显微注射用BACRP11-104H16经针对不同位点PCR鉴定，证明其克隆的正确性及完整性(参见图3)。BACRP11-104H16经PFGE鉴定，大小约为170kb，与预期一致(参见图4)。显微沣射用DNA的制备得到高质量和高纯度的DNA可以用于显微注射。测定DNA浓度，约为25-30ng/μ1，再用显微注射缓冲液将其稀释为l-2ng/y1，每管20μ1分装，存放于_20°C，用于显微注射。显微注射后将注射过的受精卵置于M16培养基中，CO2孵箱37°C培养1_2天，观察到受精卵二分裂率大于90%，三分裂率大于40%，显示该DNA的质量适合用于显微注射受精卵制备转基因小鼠。人PON基因簇转基因鼠系的建立将纯化好的PON基因簇线状DNA显微注射C57BL/6小鼠受精卵雄性原核，移卵假孕鼠，怀孕共娩出58只新生小鼠。剪取鼠耳，消化后用PCR的方法鉴定阳性转基因鼠。设计的引物能与转基因人源PON基因簇的PONl序列配对，但不会与小鼠内源基因配对。因此该引物在转基因鼠基因组作为模板时可以扩增出阳性条带，但在野生型小鼠基因组作为模板时不会扩增出产物。使用该引物能初步鉴定阳性转基因鼠，先后在5只新生小鼠中检测到阳性扩增片段，分别命名为PI、P2、P3、P4和P5(参见图5)。应用SouthernBlot方法对5株转基因阳性小鼠进一步确认。剪取鼠尾提取基因组DNA，选取EcoRI消化基因组，转膜，杂交。探针模板P1、P3和P2分别对应于转基因片段上的人P0N1、P0N3和P0N2基因序列。序列在网上经BLAST比对显示与小鼠内源基因组无明显同源性。完整的转基因经探针杂交分别产生约2kb、5kb和7kb大小的条带，而正常的小鼠基因组不会有杂交条带产生。实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实所得5株小鼠均为阳性转基因小鼠(参见图6)。转基因在小鼠体内ιΗ确的表达在建立转基因小鼠之后，进一步检测转入的PON基因簇的3个基因成员是否在小鼠体内能实现正确的组织特异性表达，以RT-PCR检测转入基因在小鼠体内的表达产物。分别取转基因和阴性同窝小鼠的心(Ht)、肾(Kd)Jf(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小肠(In)、脾(Sp)、胃(St)、卵巢(Ov)、动脉(Ao)、脑(Br)组织，提取组织总RNA，进行反转录合成cDNA第一链。cDNA产物各取1μ1作为模板，所用引物见表1:以上引物退火温度均为60°C，PCR反应除β-肌动蛋白为24个循环外，均为30个循环。PCR产物经电泳显示转入的3个PON基因成员的组织表达分布与相应的小鼠内源的3个PON基因基本一致，即Ρ0Ν1主要在肝脏高表达，而Ρ0Ν2和Ρ0Ν3则表达相对广泛(参见图7)。而阴性同窝鼠样品中检测不到转入的人PON基因的表达(参见图8)。再分别取5株转基因小鼠和阴性同窝小鼠的肝脏勻浆提取蛋白质，用Westernblot检测人POm蛋白的表达。结果显示，在5株阳性转基因小鼠肝脏中，P2株小鼠肝脏人PONl表达最高(参见图9)。提取P2株转基因鼠的肝脏和主动脉蛋白分别进行Western-Blot检测，发现P2转基因鼠肝脏可以表达人P0N1、P0N2、和P0N3，而其主动脉则主要表达人P0N2，同时在主动脉上还检测到少量人POm及微量人P0N3，可能是主动脉中有HDL存在的结果(参见图10)。分别取10只P2株转基因小鼠和10只同窝对照小鼠的禁食血清，超速离心分离出HDL,两组分别等量混合后，部分进行脱脂处理后行Western-Blot检测人PON的蛋白表达，结果发现只在P2转基因小鼠的HDL上检测到人PONl蛋白(参见图11)。另一部分分离的HDL以苯酸乙酯作为底物测量其对氧磷酶活性，结果发现P2-HDL的对氧磷酶活性比对照非转基因小鼠HDL高约1.7倍(参见图12)。综上所述，转基因实现了在小鼠体内的正确高水平表达，并具有相应的活性。依据以上实验结果，我们选择拷贝数较高的Pl和P2株转基因小鼠进行后续的研究。主要出示P2株系的结果，Pl株系的相应结果只有与P2株系不同时单独列出。转基因鼠在ιΗ常条件无明显表型各株系转基因小鼠后代中外源基因的出现频率接近50%，符合孟德尔遗传规律，说明转入的基因没有胚胎致死效应。转基因小鼠外观行为上无明显异常。当给予正常饮食时，雌性及雄性转基因小鼠的体重、血浆总胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-CHO)、低密度及极低密度脂蛋白胆固醇(LDL/VLDL-CH0)、甘油三酯(TG)、血糖水平均与同窝对照小鼠相近，见表2。hPCVapoEzzz鼠系的津立选择Pl和P2两株转基因鼠与动脉粥样硬化模型apoE+鼠杂交，用来研究转入人PON基因簇对动脉粥样硬化发生的影响。阳性鼠与apoE+鼠杂交第一代得到的hPC+/ap0E"_基因型的鼠，再与apoE+鼠杂交一代，可鉴定得到hPC7apoE+基因型的鼠，用这种基因型的鼠继续与apoE+鼠继续杂交，即可得到足够数量的hPC+/apoE+基因型鼠和同窝的非转基因apoE+基因型鼠，喂食高脂饮食诱导发生动脉粥样硬化，用于观察转入人PON基因簇对动脉粥样硬化发生的影响。在此过程中用基因型为apoE+的同性别的同窝小鼠作为对照。两株转基因鼠在杂交中产生的后代各种基因型出现的频率符合孟德尔规律。两株转基因鼠在所有的实验结果中都没有差异，表明所得出的结果不是株系特异性的，而是具有普遍规律。PON基因簇转基因促进动脉粥样硬化癍块的稳定性为了研究PON基因簇转基因促进动脉粥样硬化癍块的稳定性，高脂饮食诱导16周后的雌性PCTg/ApoE缺失和ApoE缺失小鼠的心脏被收集并进行切片染色分析。H&E染色表明PCTg/ApoE缺失小鼠的癍块面积比对照鼠小30.8%(参见图13C)，而其无染色区面积(指示坏死核心)占癍块总面积的百分比也比对照鼠少13.(参见图13D)。这样的结果，一方面说明PON基因簇转基因抑制了动脉粥样硬化的形成；另一方面也提示PON基因簇转基因鼠的癍块可能具有更厚的纤维帽以及更小的坏死核心。进一步通过比较癍块的组成进行稳定性分析表明，PCTg/ApoE缺失小鼠的板块具有更多的胶原(76.9%，参见图14C、图14D和图141)和平滑肌细胞(15.8%，参见图14G、图14H和图141)，更少的巨噬细胞浸润(22.3%，参见图14E、图14T和图141)和脂质核心(9.5%，参见图14A、图14B和图141)。以上癍块组成性方面的系列变化说明PON基因簇转基因促进了动脉粥样硬化癍块的稳定性。相应的，癍块稳定分数也因为PON基因簇转基因而增加(参见图14J)。stress，andmacrophagefoamcellformationduringatherosclerosisdevelopment.FreeRadicBiolMed37，1304-1316.Draganov，D.I.，Stetson，P.L.，Watson，C.E.，Billecke，S.S.，andLaDu,B.N.(2000).Rabbitserumparaoxonase3(P0N3)isahighdensitylipoprotein-associatedlactonaseandprotectslowdensitylipoproteinagainstoxidation.JBiolChem275,33435-33442.Galis，Z.S.(2004).Vulnerableplaque:thedevilisinthedetails.Circulation110，244-246.Gao,J.，Wei，Y.，Huang，Y.，Liu,D.，Liu,G.，Wu,Μ.，Wu,L.，Zhang，Q.，Zhang，Ζ.,Zhang,R.，etal.(2005).TheexpressionofintactandmutanthumanapoAI/CIII/AIV/AVgeneclusterintransgenicmice.JBiolChem280，12559-12566.Glass，C.K.，andWitztum,J.L.(2001).Atherosclerosis,theroadahead.Celll04，503-516.Harel，M.，Aharoni，A.，Gaidukov，L，Brumshtein，B.，Khersonsky，0.，Meged，R.，Dvir，Η·,Ravel1i,R.B.，McCarthy，Α·，Toker，L，etal.(2004).Structureandevolutionoftheserumparaoxonasefamilyofdetoxifyingandanti-atheroscleroticenzymes.NatStructMolBiol11,412-419.Hedrick，C.C.，Hassan，K.，Hough，G.P.，Yoo,J.H.，Simzar,S.，Quinto，C.R.，Kim,S.Μ.，Dooley，Α.，Langi，S.，Hama,S.Y.，etal.(2000).Short-termfeedingofatherogenicdiettomiceresultsinreductionofHDLandparaoxonasethatmaybemediatedbyanimmunemechanism.ArteriosclerThrombVascBiol20，1946—1952.HegeleiR.A.,ConnellyiP.W.,SchereriS.W.,HanleyiA.J.,HarrisiS.B.，Tsui，LC·，andZinman，B.(1997).Paraoxonase~2gene(P0N2)G148variantassociatedwithelevatedfastingplasmaglucoseinnoninsulin-dependentdiabetesmellitus.JClinEndocrinolMetab82，3373-3377.Jiang，Z.Y.，Hunt，J.V.，andWolffiS.P.(1992).Ferrousionoxidationinthepresenceofxylenolorangefordetectionoflipidhydroperoxideinlowdensitylipoprotein.AnalBiochem202，384-389.Lee,R.Τ.,andLibby,P.(1997).Theunstableatheroma.ArteriosclerThrombVascBiol17，1859-1867.Leus,F.R.，Zwart,Μ.，Kastelein,J.J.，andVoorbij,H.A.(2001).P0N2genevariantsareassociatedwithclinicalmanifestationsofcardiovasculardiseaseinfamilialhypercholesterolemiapatients.Atherosclerosis154，641—649·Libby,P.(2002).Inflammationinatherosclerosis.Nature420,868-874.LusisiA.J.(2000).Atherosclerosis.Nature407，233—241.Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，andDurrington，P.N.(2002).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.AtherosclerSuppl3，49—55·Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，Durrington，P.N.，FogeIman,A.M.，Berliner，J.，Lusis，A.J.，Navab,Μ.，Shih，D.，andFonarow,G.C.(1998).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.CurrOpinLipidol9,319-324.Ng,C.J.，Bourquard，N.,Grijalva,V.,Hama,S.,Shih,D.Μ.,Navab,Μ.,FogeIman,A.M.，Lusis，A.J.，Young，S.，andReddy,S.T.(2006).Paraoxonase~2deficiencyaggravatesatherosclerosisinmicedespitelowerapolipoprotein-B-containinglipoproteins:anti-atherogenicroleforparaoxonase-2.JBiolChem281,29491-29500.Ng,C.J.，Bourquard，N.，Hama,S.Y.，Shih，D.，Grijalva，V.R.，Navab,Μ.，FogeIman,Α.Μ.，andReddy,S.Τ.(2007).Adenovirus-mediatedexpressionofhumanparaoxonase3protectsagainsttheprogressionofatherosclerosisinapolipoproteinE—deficientmice.ArteriosclerThrombVascBiol27，1368—1374.Ng，C.J.，Shih,D.Μ.，Hama,S.Y.，Villa，N.，Navab,Μ.，andReddy，S.Τ.(2005).Theparaoxonasegenefamilyandatherosclerosis.FreeRadicBiolMed38，153—163.Ng，C.J.，Wadleigh,D.J.，Gangopadhyay,Α.，Hama,S.，Grijalva,V.R.，Navab,Μ.,Fogelman,A.Μ.,andReddy,S.Τ.(2001).Paraoxonase-2isaubiquitouslyexpressedproteinwithantioxidantpropertiesandiscapableofpreventingcell-mediatedoxidativemodificationoflowdensitylipoprotein.JBiolChem276，44444—44449.Ni，W.，Egashira，K.，Kitamoto，S.，Kataoka，C.，Koyanagi,Μ.，Inoue，S.，Imaizumi,K.，Akiyama，C.,Nishida,K.I.，andTakeshita,Α.(2001).Newanti-monocytechemoattractantprotein—1genetherapyattenuatesatherosclerosisinapolipoproteinΕ-knockoutmice.Circulation103,2096-2101.Primo-Parmo，S.L，Sorenson，R.C.，Teiber,J.，andLaDu,B.N.(1996).Thehumanserumparaoxonase/arylesterasegene(P0N1)isonememberofamultigenefamily.Genomics33,498-507.Reddy,S.T.，Wadleigh,D.J.，Grijalva,V.，Ng，C.，Hama,S.，Gangopadhyay,Α.，Shih,D.Μ.，L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