本发明属于生物材料技术领域，涉及一种基于poss的星型多重靶向功能性基因载体及应用。
背景技术：
近年来，由于基因治疗在多发性疾病如恶性肿瘤、心血管疾病等所潜在的应用而吸引了人们越来越多的关注。这种技术需要将外源正常基因和治疗基因导入靶细胞，以弥补由基因缺陷引起的疾病，从而治疗疾病。然而，裸dna并不能穿过细胞膜，而且复杂的体内环境，使得基因传递效率很低，因此，人们一直在探索研究安全高效的基因递送系统。
星型阳离子聚合物作为非病毒性基因载体，它的分子结构紧密，而且末端可以带有多个官能团，表现出可观的转染效率。例如多面体低聚倍半硅氧烷(poss)、环糊精、葡萄糖等，经常用作具有生物相容性的核心，制备出星形阳离子聚合物，它们显示出优异的基因递送能力。但是，由于星形阳离子聚合物特殊结构，导致其电荷密度较高，所以其细胞毒性也较高，限制了它们的应用。
基因递送过程还需要克服多重障碍，如特异性识别并有效地递送基因进入靶细胞、基因复合物必须能够快速内涵体逃逸，基因需要高效的进入细胞核，只有这样才能实现高转染率。文献报道将细胞靶向功能性肽连接到聚合物上提高基因递送系统的特异性，但是它们缺乏核定位能力，从而影响到它的递送效果。因此，有必要探索和发展一种有效的基因递送系统，能够同时实现高效压缩负载基因、靶向目的细胞、内涵体的逃逸以及高效的进入细胞核并表达。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有很好的生物相容性、高效低毒、对内皮细胞多重靶向性的基于poss的星型多重靶向功能性基因载体。
本发明的第二个目的是提供一种基于poss的星型多重靶向功能性基因载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种基于poss的星型多重靶向功能性基因载体在制备基因递送药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
基于poss的星型多重靶向功能性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将八氨基poss溶解于高纯水中，第一次加入naoh水溶液，得到溶液一，所述八氨基poss与第一次加入的naoh水溶液中naoh的摩尔比为1:(4-9)；将2-溴异丁酰溴溶解于二氯甲烷或三氯甲烷中，得到2-溴异丁酰溴溶液；向溶液一中加入2-溴异丁酰溴溶液的同时，第二次加入naoh水溶液，在0-5℃，在搅拌下反应10-18小时，得到大分子引发剂poss-(br)n，n为4-8的粗品，精制，得到大分子引发剂poss-(br)n，n为4-8；所述八氨基poss、2-溴异丁酰溴和第二次加入naoh水溶液的naoh的摩尔比为1:(8-24):(8-48)；
所述八氨基poss为八氨基笼状聚倍半硅氧烷的简称；
(2)将步骤(1)获得的产物和dmaema加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta，密封后在液氮冷却下，将聚合管抽真空通氮气的操作重复3-5次，然后在氮气氛围下加入cubr，在50-70℃下反应16-28小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀2-3次，再用真空干燥箱在20-37℃下干燥至恒重；
步骤(1)获得的产物、dmaema、hmteta和cubr的摩尔比为1:(200-400):(8-16)：(4-8)；
dmaema是甲基丙烯酸二甲氨基乙酯简称；
hmteta是1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺简称；
(3)将步骤(2)获得的产物和分子量为360-600kda的pegma加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta；密封后在液氮冷却下,将聚合管抽真空通氮气的操作重复3-5次，然后在氮气氛围下加入cubr，在50-70℃下反应16-28小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀2-3次，再用真空干燥箱在20-37℃下干燥至恒重，得到聚合物poss-pdmaema-ppegma，简称ppp；
步骤(2)获得的产物、所述pegma、hmteta和cubr的摩尔比为1:(56-80):(8-16):(4-8)；
pegma为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的简称；
(4)将ppp溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为3-5mg/ml的溶液为溶液二，将三乙胺和溶液二加入到干燥的反应容器中；在0-5℃，再滴入体积浓度为7％-10％的丙烯酰氯二甲基亚砜溶液，反应10-18小时，过滤，用截留分子量为3000-10000的透析袋透析提纯，冻干，得到末端双键化的聚合物poss-pdmaema-ppegma-das，简称ppp-das；
三乙胺、溶液二和所述丙烯酰氯二甲基亚砜溶液的体积比为1:(10-15):(10-15)；
(5)将ppp-das与多肽的摩尔比为1：(8-32)的比例，将ppp-das与多肽溶于高纯水中，并使多肽的浓度3-5mg/ml的溶液为溶液三，超声处理10-20分钟；加入溶液三体积0.2-0.4倍的浓度为2-4mg/ml的dmpa的二甲亚砜溶液，在通氮气的条件下，用紫外灯连续照射10-15分钟；收集反应物并通过截留分子量为3000-5000的透析袋透析提纯，冷冻干燥得到基于poss的星型多重靶向功能性基因载体即聚合物poss-pdmaema-ppegma-pep简称为ppp-pep，所述pep为多肽的简称；
dmpa为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的简称。
多肽优选cagw或cag-tat-nls；所述cagw的氨基酸序列用seqidno.1所示；所述cag-tat-nls的氨基酸序列用seqidno.2所示。
上述方法制备的基于poss的星型多重靶向功能性基因载体。
上述基于poss的星型多重靶向功能性基因载体在制备基因递送药物的应用。
本发明的优点是：
(1)本发明的基于poss的星型多重靶向功能性基因载体，相比较于线型的基因载体，星型结构可以使得正电荷更加集中，从而增强聚合物负载基因的能力；同时以无机poss为核心的星型结构更容易形成稳定的、粒径更小的胶束，从而更利于细胞的摄取。
(2)基于poss的星型多重靶向功能性基因载体以pdmaema链段作为负载压缩基因的主要链段，同时还可以增强内涵体逃逸能力。
(3)基于poss的星型多重靶向功能性基因载体通过atrp反应接枝了具有梳状结构的ppegma，屏蔽过多的正电荷，降低了聚合物毒性，同时大大增强了聚合物的亲水性，增强了聚合物在体内循环的稳定性，从而可以有效的进行基因递送。
(4)基于poss的星型多重靶向功能性基因载体中，将多重靶向功能性多肽内皮细胞靶向肽cagw、细胞穿膜肽tat和核定位信号nls连接到星型聚合物末端，从而同时具备内皮细胞靶向性、高效穿膜性能和核定位能力。
(5)本发明的基于poss的星型多重靶向功能性基因载体同时具有内皮细胞靶向性、穿膜肽和核定位信号的功能，有利于携带基因靶向性地进入目的细胞、提高细胞摄取率，高效内涵体逃逸并靶向进入细胞核，从而显著提高基因递送效果，达到基因治疗的目的。
附图说明
图1为细胞相对活性图。
图2为细胞转染图。
图3为体外血管形成图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解，本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改,该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
所述八氨基笼状聚倍半硅氧烷，简称为八氨基poss，购于美国hybridplastics公司，其货号为am0285；
pegma为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的简称，购于美国sigma-aldrich公司；
cagw的氨基酸序列用seqidno.1所示，其序列为：cys-ala-gly-trp。
cag-tat-nls的氨基酸序列用seqidno.2所示，其序列为：cys-ala-gly-tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val。
znf580基因的核苷酸序列用seqidno.3所示。
ea.hy926细胞购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
huvecs为人脐静脉内皮细胞，购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
本发明的内皮细胞靶向肽cag源于iv型胶原蛋白的一段多肽序列，具有对内皮细胞特异选择性功能。
序列ygrkkrrqrrr(tat)源于人免疫缺陷病毒(hiv-1)的一段多肽序列，具有跨膜功能。
序列pkkkrkv(nls)源于猿猴病毒40(sv40)的大t抗原中，可以靶向性定位到细胞核，具有核定位的功能。
实施例1
基于poss的星型多重靶向功能性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将八氨基poss溶解于高纯水中，第一次加入naoh水溶液，得到溶液一，所述八氨基poss与第一次加入的naoh水溶液中naoh的摩尔比为1:4；将2-溴异丁酰溴溶解于二氯甲烷中，得到2-溴异丁酰溴溶液；向溶液一中加入2-溴异丁酰溴溶液的同时，第二次加入naoh水溶液，在0℃，在搅拌下反应10小时，得到大分子引发剂poss-(br)4的粗品，精制，精制步骤为：先后用hcl水溶液和naoh水溶液萃取，分离得到有机层，然后用无水硫酸钠干燥18小时；过滤后通过旋转蒸发得到浓缩液，将浓缩液用二氯甲烷溶解，再用乙醚沉淀，反复溶解沉淀3次；将产物放在37℃的真空干燥箱内干燥至恒重；得到大分子引发剂poss-(br)4；所述八氨基poss、2-溴异丁酰溴和第二次加入naoh水溶液的naoh的摩尔比为1:8:8；
所述八氨基poss为八氨基笼状聚倍半硅氧烷的简称；
(2)将步骤(1)获得的产物和dmaema加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta，密封后在液氮冷却下，将聚合管抽真空通氮气的操作重复3次，然后在氮气氛围下加入cubr，在50℃下反应16小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀2次，再用真空干燥箱在20℃下干燥至恒重；
步骤(1)获得的产物、dmaema、hmteta和cubr的摩尔比为1:200:8:4；
dmaema是甲基丙烯酸二甲氨基乙酯简称；
hmteta是1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺简称；
(3)将步骤(2)获得的产物和分子量为360kda的pegma加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta；密封后在液氮冷却下，将聚合管抽真空通氮气的操作重复3次，然后在氮气氛围下加入cubr，在50℃下反应16小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀2次，再用真空干燥箱在20℃下干燥至恒重，得到聚合物poss-pdmaema-ppegma，简称ppp；
步骤(2)获得的产物、所述pegma、hmteta和cubr的摩尔比为1:56:8:4；
pegma为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的简称；
(4)将ppp溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为3mg/ml的溶液为溶液二，将三乙胺和溶液二加入到干燥的反应容器中；在0℃，再滴入体积浓度为7％的丙烯酰氯二甲基亚砜溶液，反应10小时，过滤，用截留分子量为3000的透析袋透析提纯，冻干，得到末端双键化的聚合物poss-pdmaema-ppegma-das，简称ppp-das；
三乙胺、溶液二和所述丙烯酰氯二甲基亚砜溶液的体积比为1:10:10；
(5)将ppp-das与多肽的摩尔比为1：8的比例，将ppp-das与cagw多肽溶于高纯水中，并使cagw多肽的浓度3mg/ml的溶液为溶液三，超声处理10分钟；加入溶液三体积0.2倍的浓度为2mg/ml的dmpa的二甲亚砜溶液，在通氮气的条件下，用紫外灯连续照射10分钟；收集反应物并通过截留分子量为3000的透析袋透析提纯，冷冻干燥得到聚合物poss-pdmaema-ppegma-pep简称为ppp-pep，所述pep为多肽cagw；
dmpa为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的简称。
基因递送系统，用下述方法制成：
将本实施例制备的聚合物ppp-pep溶解于高纯水，配制成浓度为0.2mg/ml的聚合物溶液，超声10分钟，按照聚合物ppp-pep与znf580基因的质量比为1：6的比例，将浓度为0.05mg/ml的znf580基因水溶液，在搅拌下，滴加到所述聚合物ppp-pep溶液中，搅拌1小时，得到ppp-pep/dna基因递送系统。
实施例2
基于poss的星型多重靶向功能性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将八氨基poss溶解于高纯水中，第一次加入naoh水溶液，得到溶液一，所述八氨基poss与第一次加入的naoh水溶液中naoh的摩尔比为1:9；将2-溴异丁酰溴溶解于三氯甲烷中，得到2-溴异丁酰溴溶液；向溶液一中加入2-溴异丁酰溴溶液的同时，第二次加入naoh水溶液，在5℃，在搅拌下反应18小时，得到大分子引发剂poss-(br)8的粗品，精制，精制的方法同实施例1，得到大分子引发剂poss-(br)8；所述八氨基poss、2-溴异丁酰溴和第二次加入naoh水溶液的naoh的摩尔比为1:24:48；
所述八氨基poss为八氨基笼状聚倍半硅氧烷的简称；
(2)将步骤(1)获得的产物和dmaema加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta，密封后在液氮冷却下，将聚合管抽真空通氮气的操作重复5次，然后在氮气氛围下加入cubr，在70℃下反应28小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀3次，再用真空干燥箱在37℃下干燥至恒重；
步骤(1)获得的产物、dmaema、hmteta和cubr的摩尔比为1:400:16:8；
dmaema是甲基丙烯酸二甲氨基乙酯简称；
hmteta是1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺简称；
(3)将步骤(2)获得的产物和分子量为600kda的pegma加入聚合管并溶解在甲醇中，再加入配体hmteta；密封后在液氮冷却下,将聚合管抽真空通氮气的操作重复5次，然后在氮气氛围下加入cubr，在70℃下反应28小时；将反应产物过中性氧化铝柱，然后旋转蒸发得到浓缩液：将浓缩液在正己烷中反复沉淀3次，再用真空干燥箱在37℃下干燥至恒重，得到聚合物poss-pdmaema-ppegma，简称ppp；
步骤(2)获得的产物、所述pegma、hmteta和cubr的摩尔比为1:80:16:8；
pegma为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的简称；
(4)将ppp溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为5mg/ml的溶液为溶液二，将三乙胺和溶液二加入到干燥的反应容器中；在5℃，再滴入体积浓度为10％的丙烯酰氯二甲基亚砜溶液，反应18小时，过滤，用截留分子量为10000的透析袋透析提纯，冻干，得到末端双键化的聚合物poss-pdmaema-ppegma-das，简称ppp-das；
三乙胺、溶液二和所述丙烯酰氯二甲基亚砜溶液的体积比为1:15:15；
(5)将ppp-das与多肽的摩尔比为1：32的比例，将ppp-das与cag-tat-nls多肽溶于高纯水中，并使多肽的浓度5mg/ml的溶液为溶液三，超声处理20分钟；加入溶液三体积0.4倍的浓度为4mg/ml的dmpa的二甲亚砜溶液，在通氮气的条件下，用紫外灯连续照射15分钟；收集反应物并通过截留分子量为5000的透析袋透析提纯，冷冻干燥得到聚合物poss-pdmaema-ppegma-pep简称为ppp-pep，所述pep为多肽cag-tat-nls；
dmpa为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的简称；
基因递送系统，用下述方法制成：
将本实施例制备的聚合物ppp-pep溶解于高纯水，配制成浓度为0.5mg/ml的聚合物溶液，超声15分钟，按照聚合物ppp-pep与znf580基因的质量比为1：8的比例，将浓度为0.2mg/ml的znf580基因水溶液，在搅拌下，滴加到所述聚合物ppp-pep溶液中，搅拌2小时，得到ppp-pep/dna基因递送系统。
实施例3
对照为聚乙烯亚胺/znf580基因复合物(pei25kda/dna复合物)，其中pei25kda与znf580基因的质量比为1：2；
聚乙烯亚胺(pei25kda)购于sigma-aldrich公司，商品；
pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统(znf580基因)的细胞毒性由mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价。
步骤如下：将ea.hy926细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板中并用完全培养基(10w％fbsdmem)培养过夜，当细胞达到80％汇合时，将完全培养基换为无血清培养基培养12小时。将pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的不同浓度的ppp-pep/dna基因递送系统分别加入到无血清培养基中，细胞孵育4小时后，替换培养基为完全培养基。48小时后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，在孵箱内孵育4小时形成甲瓒晶体。然后小心地弃去培养基，用二甲基亚砜(150μl/孔)溶解形成的甲瓒晶体。将96孔板在黑暗条件下低速振荡10分钟以充分溶解结晶。各孔的光密度(od)用酶联免疫检测仪(bio-rad，imarkt，usa)在490纳米波长下测量得到。使用以下公式计算相对细胞活性(％)：
其中，od：实验组的吸光度值，odc：空白组的的吸光度值，od0：调零组的吸光度值。
分析结果：图1为细胞活性，分别测定了pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统。适量的正电荷有利于负载基因，然而过多的正电荷会导致较高的细胞毒性，从而降低细胞活性。从图1中可以看出，相对于pei25kda来说，实施例1和2制备的ppp-pep/dna基因递送系统具有更高的细胞活性。
实施例4
利用体外细胞转染实验来评价实施例1及实施例2制备的基于poss的星型多重靶向功能性基因载体传递目的基因(znf580基因)到靶细胞的效率。
步骤如下：将ea.hy926细胞以1×104细胞/孔的密度接种在24孔板中，培养直至达到70％汇合，转染前的细胞在无血清培养基中饥饿12小时，孔内加入基因的含量为2μg的pei25kda/dna复合物和实施例1、实施例2的ppp-pep/dna基因递送系统。在孵箱37℃培养4小时后，将无血清培养基更换为完全培养基(10w％fbsdmem)。使用倒置荧光显微镜观察细胞转染48小时后的绿色荧光蛋白(gfp)的表达情况。同时使用流式细胞术定量测定gfp的表达。用0.01m的pbs缓冲液(ph＝7.4)清洗转染后48小时的细胞，胰蛋白酶消化细胞后离心三次洗涤细胞。加入300μl的pbs缓冲液(ph＝7.4)均匀分散细胞获得细胞悬浮液，通过流式细胞仪(beckmanmofloxdp)检测gfp的表达。
分析结果：图2(1)为细胞荧光转染图，图2(2)为细胞流式转染图，分别测定了pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统。从图中可以看出，实施例1的ppp-pep/dna基因递送系统相对转染水平接近于黄金标准pei25kda的转染水平，而实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统的相对转染水平甚至高于pei25kda的转染水平，说明实施例1和实施例2的ppp-pep可以有效地进行基因递送。其中：
a为实施例1；b为实施例2；c为pei25kda；
实施例5
利用体外血管形成实验来评价实施例1及实施例2的ppp-pep/dna基因递送系统转染后huvecs的血管化能力。
步骤如下：将corningmatrigel胶插入冰内置于4℃过夜使其充分融化，吸取融化后的corningmatrigel胶均匀的加入到96孔板的孔内，过程避免出现气泡，把96孔板置于37℃孵箱内保温1h。被pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统转染的细胞huvecs以4×104个细胞/孔的密度接种到固化的corningmatrigel胶表面上。6小时后，用光学显微镜拍摄血管形成结果。
所述huvecs为人脐静脉内皮细胞，购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
所述corningmatrigel胶购于康宁公司。
分析结果：图3为pei25kda/dna复合物和实施例1及实施例2制备的ppp-pep/dna基因递送系统体外血管形成结果。从图中可以看出，实施例1的ppp-pep/dna基因递送系统的体外形成血管能力接近于黄金标准pei25kda，而实施例2的ppp-pep/dna基因递送系统的体外形成血管能力高于pei25kda，说明实施例1和实施例2ppp-pep/dna基因递送系统可以促进新血管的形成。其中：
a为实施例1；b为实施例2；c为pei25kda；
seqidno.1：
cys-ala-gly-trp
seqidno.2cag-tat-nls：
cys-ala-gly-tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val
seqidno.3：人工合成znf580：
序列表
<110>天津大学
<120>基于poss的星型多重靶向功能性基因载体及应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cysalaglytrp
1
<210>2
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cysalaglytyrglyarglyslysargargglnargargargprolys
151015
lyslysarglysval
20
<210>3
<211>519
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
atgctgctgctgcctccgcgcccaccgcatccgcgttcttcttctccagaagcaatggac60
ccgccgcctccgaaagccccaccgttcccgaaagctgaaggcccgtcctctactccgtct120
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