抑制靶基因表达的组合物的制作方法

专利名称：：抑制靶基因表达的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于抑制靶基因表达的组合物等。
背景技术：
：作为抑制靶基因表达的方法，目前已知例如利用RNA干涉(RNAinterference,以下称为RNAi)的方法等，具体而言，有冲艮道指出通过在线虫中导入具有与靶基因相同的序列的双链RNA，可特异性地抑制该靶基因表达的现象[参见"自然(Nature)",1998年，第391巻、第6669号，p.806-811]。另外，发现通过在果蝇中导入2123石威基长度的双链RNA代替长双链RNA,可以抑制靶基因的表达，将其命名为短干扰RNA(shortinterferingRNA)(siRNA)(参见国际公开第01/75164号说明书)。哺乳动物细胞中导入长双链RNA时，由于病毒防御机制引起细胞程序死亡，不能抑制特定的基因表达，但发现只要为2029碱基的siRNA,则不会引起上述反应，可以抑制特定基因的表达。其中21~25个碱基的siRNA的表达抑制效果高["自然(Nature)",2001年，第411巻，第6836号，p.494-498，"遗传学自然评论(NatureReviewsGenetics)",2002年，第3巻，第10号，p.737國747,"分子细胞(MolecularCell)",(美国),2002年，第10巻，第3号，p.549-561，"自然生物技术(NatureBiotechnology)，，，(美国),2002年,第20巻，第5号，p.497-500]。另外，已有报道指出，不仅是双链RNA,具有通过分子内杂交形成的发夹(hairpin)结构的单链RNA也与siRNA相同地显示为RNAi[参见"美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)，，，2002年，第99巻，第9号，p.6047-6052]。关于RNAi,在体内试验中也经常得到验证，已经报道了对胎儿动物使用50个碱基对以下的siRNA的效果(参见专利文献l)及对成体小鼠的效果(参见专利文献2)。另外，静脉内给与小鼠胎鼠siRNA时，可确认在肾脏、脾脏、肺、胰脏及肝脏各脏器内具有抑制特定基因表达的效果(参见非专利文献l)。并且，还报道了在脑细胞中直接给与siRNA,也能抑制特定基因的表达(参见非专利文献2)。专利文献l、非专利文献1及2中，通过局部给药或采用称为流体动力法的一气注入大量siRNA溶液的方法进行的全身给药，进行体内给与siRNA。siRNA在血中不稳定，为了避免在血中分解，而选择了上述给药方法，但局部给药时由于只能将siRNA输送到给药区域附近，所以通常抑制表达的效率极低，另一方面，采用流体动力法，通常耙组织限定为肝脏。即，为了抑制靶基因的表达，人们正在谋求开发一种通过全身给药将抑制该靶基因表达的RNA高效地输送到靶组织的方法。另一方面，作为向细胞内输送核酸的方法，已知有使用阳离子脂质体或阳离子聚合物的方法。但是，该方法中，静脉内给与含有核酸的阳离子脂质体或阳离子聚合物后，核酸被迅速地从血中除去，靶组织为肝脏或肺以外的组织时，例如为肿瘤部位等时，不能将核酸输送到耙组织，不能够充分地发挥作用。因此，已有报道指出一种包封核酸的脂质体(在脂质体内包封核酸的脂质体)可以解决核酸在血中被迅速地除去的问题(参见专利文献35及非专利文献3)。作为含有核酸等的脂质体的制备方法，专利文献3中报道了如下方法，即，例如将阳离子性脂质预先溶解在氯仿中，然后加入寡脱氧核苷酸(ODN)的水溶液和曱醇，混合后，通过离.心使阳离子性脂质/ODN的复合体移至氯仿层中，再取出氯仿层，向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性的脂质和水，形成油包水型(W/0)乳剂，采用逆相蒸发法处理，制备ODN内包脂质体，专利文献4及非专利文献3中报道了如下方法，即，将ODN溶解于pH3.8的柠檬酸水溶液中，加入脂质(乙醇中)，使乙醇浓度降低至20v/v。/。，制备ODN内包脂质体，进行定型过滤，通过透析除去过量的乙醇后，再在pH7.5下透析试样，除去附着在脂质体表面的ODN,制备ODN内包脂质体。上述方法均可制备包封核酸等有效成分的脂质体。法，制备包封核酸等有效成分的脂质体。在该方法中，通过减少含有分散有微粒且溶解了脂质的极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的比例，使脂质膜被覆微粒，在液体中进行被覆，能够以优异的效率制备例如适于静脉注射用微粒等的大小的用脂质膜被覆的微粒(被覆微粒)。另外，专利文献5中，作为微粒的例子，例如举出了由水溶性药物和阳离子性脂质构成的通过静电相互作用形成的复合体。被覆复合粒子得到的被覆微粒的粒径，根据被覆的复合粒子的不同而不同，被覆ODN-脂质复合体得到的被覆粒子的粒径小，可以用作注射剂，静脉内给与该被覆微粒时，显示较高的血中滞留性，较多地集聚在肿瘤组织。专利文献l:国际7>开第02/132788号iJt明书专利文献2:国际公开第03/10180号"i兌明书专利文献3:特表2002-508765号7>报专利文献4:特表2002-501511号公报专利文献5:国际公开第02/28367号说明书非专利文献l:"自然'遗传学(NatureGenetics)"，2002年，第32巻，第l号，p.107-108非专利文献2:"自然生物技术(NatureBiotechnology)"，2002年，第20巻，第10号，p.1006-1010非专利文献3:"生物化学与生物物理学净艮(BiochimicaetBiophysicaActa)，，，2001年，第1510巻，p.152-16
发明内容本发明的目的在于提供用于抑制靶基因表达的组合物等。本发明涉及以下(1)~(37)项发明(1)一种组合物，含有包封RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。(2)如上述(1)所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给药的大小的脂质体。(3)如上述(1)或(2)所述的组合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。(4)如上述(1)(3)中任一项所述的组合物，其中，所述耙基因是与肺瘤或炎症相关的基因。(5)如上述(1)(4)中任一项所述的组合物，其中，所述耙基因是与血管新生(angiogenesis)相关的基因。(6)如上述(1)~(3)中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为KLF5mRNA。(7)如上述(1)(3)中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA是人或小鼠的KLF5mRNA。(8)如上述(6)或(7)所述的组合物，其中，所述RNA是由KLF5mRNA的连续1530个碱基的序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA，并在每条链的3'端相同或不同地附加总计16个的1种或多种核苦酸。(9)如上述(6)或(7)所述的组合物，其中，所述RNA具有发夹结构，是由KLF5mRNA的连续1530个;烕基的序列构成的RNA及由与该序列互补的序列构成的RNA通过间隔寡核普酸(spaceroligonucleotide)连接而成,并在3'端附加总计1~6的个1种或多种核香酸。(10)如上述(6)或(7)所述的组合物，其中，RNA是选自以下(a)(c)的RNA,(a)由序列号216中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条4连的3'端相同或不同地附加总计2~4个的尿苦酸及脱氧胸苷酸中的任1种或2种；(b)由序列号2~16中任一个序列构成的RNA及由与该序列互补的序列构成的RNA通过5'端具有2个尿苦酸或脱氧胸普酸的间隔寡核苷酸连接而形成的RNA,具有发夹结构，并在3'端附加总计2-4个的尿苷酸及脱氧胸苦酸中的任1种或2种；(c)由序列号211中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双4连RNA,并在每条链的3'端附加2个尿苷酸。(11)如上述(1)(3)中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为bcl2mRNA。(12)如上述(1)(11)中任一项所述的组合物，其中，所述包封RNA的脂质体由构成成分为前导粒子和该RNA的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的极性有机溶剂的液体，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。(13)如上述(12)所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。(14)如上述(12)所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。(15)如上述(12)~(14)中任一项所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性脂质的前导粒子，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。(16)如上述(1)(11)中任一项所述的组合物，其中，所述包封RNA的脂质体由以含有阳离子性脂质的前导粒子和所述RNA为构成成分的复合粒子、及被覆该复合粒子的脂质膜构成，该脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。(17)如上述(15)或(16)所述的组合物，其中，所述阳离子性脂质为选自N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵、N_[1-(2,3-二油酰丙基)]-N，N-二甲基胺、N-[1-(2,3-二油基氧基丙基)]-N,N，N-三曱基氯化铵、N-[1-(2，3-双十四烷氧基丙基)]-N,N-二曱基-N-羟乙基溴化铵及3(3-[N-(N，，N，-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上脂质。(18)如上述(15)(17)中任一项所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。(19)如上述(15)(18)中任一项所述的组合物，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。(20)—种包封RNA的脂质体，所述脂质体由以前导粒子和RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述RNA含有靶基因mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的极性有机溶剂的液体，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。(21)如上述(20)所述的脂质体，其中，所述极性有机溶剂为醇。(22)如上述(20)所述的脂质体，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。(23)如上述(20)~(22)中任一项所述的脂质体，其中，所述前导粒子是含有阳离子性脂质的前导粒子，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。(24)—种包封RNA的脂质体，所述脂质体由以含有阳离子性脂质的前导粒子和RNA为构成成分的复合粒子、及被覆该复合粒子的脂质膜构成，其中，所述RNA含有靶基因mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，该脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪经衍生物为构成成分。(25)如上述(23)或(24)所述的脂质体，其中，所述阳离子性脂质为选自N-[1-(2,3-二油酰丙基)]-N,N，N-三曱基氯化铵、N_[1-(2,3-二油酰丙基)]-N，N-二曱基胺、N-[1-(2,3-二油基氧基丙基)]-N,N,N-三曱基氯化铵、N-[1-(2,3-双十四烷氧基丙基)]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵及3p-[N-(N，，N，-二曱基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上脂质。(26)如上述(20)~(25)中任一项所述的脂质体，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。(27)如上述(20)~(26)中任一项所述的脂质体，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。(28)如上述(20)(27)中任一项所述的脂质体，其中，所述RNA是具有利用RNA千涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。(29)如上述(20)~(28)中任一项所述的脂质体，其中，所述靶基因是与肿瘤或炎症相关的基因。(30)如上述(20)~(28)中任一项所述的脂质体，其中，所述靶基因是与血管新生相关的基因。(31)如上述(20)~(28)中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA为KLF5mRNA。(32)如上述(20)~(28)中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA是人或小鼠的KLF5mRNA。(33)如上述(31)或(32)所述的脂质体，其中，所述RNA是由KLF5mRNA的连续15~30个碱基的序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条^T连的3'端相同或不同地附加总计16个的1种或多种核苷酸。(34)如上述(31)或(32)所述的脂质体，其中，所述RNA具有发夹结构，是由KLF5mRNA的连续1530个碱基的序列构成的RNA及由与该序列互补的序列构成的RNA通过间隔寡核苷酸连接而成，并在3'端附加总计16个的1种或多种核苷酸。(35)如上述(31)或(32)所述的脂质体，其中，RNA是选自以下(a)~(c)的RNA,(a)由序列号216中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条链的3'端相同或不同地附加总计2~4个的尿苷酸及脱氧胸普酸中的任1种或2种；(b)由序列号2~16中任一个序列构成的RNA及由与该序列互补的序列构成的RNA通过5'端具有2个尿苦酸或脱氧胸苷酸的间隔寡核香酸连接而形成的RNA，具有发夹结构，并在3'端附加总计2-4个的尿苷酸及脱氧胸苦酸中的任1种或2种；(c)由序列号211中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条链的3'端附加2个尿苷酸。(36)如上述(20)(28)中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA为bcl2mRNA。(37)—种组合物，所述组合物含有上述(20)(36)中任一项所述的脂质体。本发明的组合物含有包封RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因的mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，通过将上述组合物给与哺乳动物等，能够抑制该靶基因的表达。表示植入小鼠的肺瘤的增殖的经时变化。横轴表示时间(小时)，纵轴表示肿瘤的大小(mm3)。》为未处理组、o为实施例l所得制剂的给药组。表示从荷瘤(tumor-bearing)小鼠的尾静脉，给与含有50jigsiRNA的制剂(实施例l:图中o,比较例l:图中)、含有50吗siRNA的siRNA溶液(比较例2:图中n,比较例3:图中躍)及生理盐水(图中A)时的肿瘤增殖曲线。为计数肿瘤组织切片中可观察到的CD31阳性结构的结果。Saline表示给与生理盐水时，Sc-saline表示给与比较例3时，sc-WL表示给与比较例l时，KLF5-saline表示给与比较例2时，KLF5-WL表示给与实施例1时小鼠胂瘤中CD31阳性结构的数量。为从肿瘤中萃取的mRNA的定量PCR的分析结果。Saline表示生理盐水，Sc-saline表示比较例3，sc-WL表示比较例l，KLF5-saline表示比4交例2，KLF5-WL表示实施例1。为从肺瘤中萃取的KLF5的定量结果。Saline表示生理盐水、Sc-saline表示比较例3，sc-WL表示比较例l,KLF5-saline表示比较例2，KLF5-WL表示实施例1。为在肿瘤附近直接给与siRNA时的肿瘤增殖曲线。A表示给与生理盐水，口表示给与杂混(scramble)-siRNA,o表示给与KLF5-siRNA。表示植入小鼠的DU145肿瘤的增殖的经时变化。；镜轴表示时间(天)，纵轴表示肿瘤的大小(mm3)。*表示未处理组、o表示实施例3所得制剂的给药组。表示植入小鼠的PC-3肿瘤的增殖的经时变化。横轴表示时间(天)，纵轴表示肿瘤的大小(mm3)。參表示未处理组、o表示实施例3所得制剂的给药组、n表示比较例4所得制剂的给药组、《表示比较例5(棵)所得制剂的给药组。具体实施例方式作为本发明的靶基因，只要为在哺乳动物中产生mRNA并进行表达的基因即可，没有特殊的限制。例如可以举出Kruppd样因子(Kruppel-likefactor、以下简称KLF)基因，优选举出KLF5基因。KLF家族是以C末端的锌指(zincfinger)基序为特征的转录因子家族，已知KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLH0、KLFll、KLF12、KLF13、KLF14、KLF5、KLF16等。有报道指出，在哺乳动物中，KLF家族对各种组织或细胞、例如红细胞、血管内皮细胞、平滑肌、皮肤、淋巴细胞等的分化十分重要，另外在癌症、心血管疾病、肝硬化、肾疾病、免疫疾病等各种疾病的病理条件的形成中也发挥重要的作用[生物化学杂志(TheJournalofBiologicalChemistry),2001年，第276巻，第37号，p.34355-34358,基因组生物学(GenomeBiology),2003年，第4巻，第2号，p.206]。transcriptionalelementbindingprotein2))或IKLF(肠冨集Kruppd样因子(intestinal-enrichedKruppel—likefactor))。血管平滑肌中KLF5的表达在发生阶段受到抑制，在胎儿的血管平滑肌中高度表达，而在正常成人的血管平滑肌中未见表达。另外，在用气嚢导管削剥后新生的血管内膜的平滑肌中，可见KLF5高度表达，在动脉硬化或再狭窄的病变部的平滑肌中也可见KLF5表达[循环(Circulation),2000年，第102巻，第20号，p.2528-2534]。另外，作为耙基因，例如可以举出B细胞淋巴瘤(B-CELLCLL/LYMPHOMA)(以下简称bcl)基因，优选举出bcl2基因。作为本发明中的RNA,可以举出含有上述靶基因的mRNA的连续1530个碱基、优选1725个碱基、更优选1923个碱基的序列及与该序列互补的序列的RNA,包括核酸结构中的磷酸部、酯部等中含有的氧原子等被例如硫原子等其他原子取代的衍生物。另外，作为本发明的RNA,优选举出具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA,此处，将抑制KLF5基因表达的RNA作为例子，对利用RNA干涉(RNAi)抑制靶基因表达的RNA进行说明。其他基因也具有相同结构，可按照相同的操作获得。抑制KLF5基因表达的RNA含有KLF5mRNA的连续的1530个i咸基、优选为1725个^咸基、更优选为1923个碱基的序列(以下称为序列X)及与该序列互补的序列(以下称为互补序列X')。作为RNA,可以举出(A)RNA,所述RNA是在由序列X的链(有意义链)及互补序列X'的链(反义链)构成的双链RNA的每条链的3'端，相同或不同地附加16个、优选24个核苷酸的双4连RNA(以下，将上述结构的RNA称为siRNA),可抑制KLF5基因的表达；(B)RNA，所述RNA接而成，在3'端附加16个、优选24个核苷酸，具有发夹结构(以下，称为shRNA)等。上述RNA上附加的核普酸的碱基可以为鸟噤呤、腺。票呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶中的任意一种或多种，另外也可以为RNA或DNA,优选尿苷酸(U)及脱氧胸苷酸(dT)中的1种或2种。另外，作为间隔寡核苷酸，优选612个石咸基的RNA,其5'端的序列优选是2个U。作为间隔寡核苷酸的例子，可以举出由UUCAAGAGA的序列构成的RNA。可以将通过间隔寡核苦酸连接的2个RNA中的任一个作为5'端。序列X只要是KLF5mRNA的连续的1530个碱基的序列，优选1725个碱基、更优选为1923个碱基的序列，就可以为任意序列，最优选采用以下(I)所述的方法设计的19个碱基的序列。同，也存在抑制较弱的情况，所以，可以通过如下操作获得本发明的RNA,即设计多个序列作为序列X(I),分别以序列X为基础制备RNA(II),将RNA导入KLF5基因表达的细胞中，测定KLF5基因的表达(111)，选择可较强地抑制KLF5基因表达的RNA。(I)序列X的设计从希望抑制基因表达的动物的KLF5cDNA的碱基序列中，取出以AA开始的21个碱基的部分序列。计算取出序列的GC含量，选择多个GC含量为2080。/。、优选3070%、更优选40~60%的序列。作为上述序列，优选是编码区域内的序列，即选择从起始密码子开始的75个碱基以上的下游序列。KLF5cDNA的碱基序列的信息，可以从基因库等碱基序列数居库中获得。例如小鼠KLF5cDNA的序列可以从基因库注册序号NM一009769(序列号41)中获得序列信息，人KLF5cDNA的序列可以从基因库注册序号AF287272(序列号42)中获得序列信息。将除去所选序列的5'末端的AA、将序列中的T变为U得到的19个碱基的序列作为序列X。(II)RNA的制备以(I)中选择的序列X作为基础，如下所述地制备RNA(siRNA，shRNA等)。以下记载了作为附加的寡核苷酸，使用U及dT中的任意l种或2种、总计为2个的情况，使用其他核苷酸时，也可以相同地制备。(i)为siRNA时制备2条RNA，即，由在序列X的3'端附加了总计2个、U及dT中的任意1种或2种的序列构成的RNA,及由在互补序列X'的3'端附加了总计2个、U及dT中的任意l种或2种的序列构成的RNA。上述2条RNA可以通过化学合成或体外转录进行制备。可以使用DNA合成机进行化学合成。另外，也可以委托Ambion公司、日本BioServices林式会社、QIAGEN^^司等制造商进行化学合成。通过将化学合成的含有相互互补的序列的2条RNA退火，可以制备双链RNA,该双链RNA在由序列X的链及互补序列X'的链构成的双链RNA的每条链的3'端，相同或不同地附加总计2个、U及dT中的任意l种或2种。退火如下进行，在适当的緩冲液中于9095。C下将2条RNA加热15分钟后，经4560分钟冷却至室温。通过体外转录的RNA的制备可以如下地进行。首先，分别制备下述DNA,即具有T7RNA聚合酶的启动子序列的DNA(T7引物)；具有将互补序列X'的U取代为T、且在其5'端附加2个A、在3'端附加与T7引物3'端的8个碱基互补的序列而得到的序列的DNA(DNA1);具有将序列X的U取代为T、且在其5'端附加2个A、在3'端附加与T7引物3'端的8个碱基互补的序列而得到的序列的DNA(DNA2)。使T7引物和DNA1退火后，通过DNA聚合酶反应，形成双链DNA。将得到的双链DNA作为模板，通过使用T7RNA聚合酶的体外转录反应，能够合成RNA,该RNA具有在序列X的3'端附力口2个U、在5'端附加前导序列的序列。同样地使用T7引物和DNA2通过相同的反应，能够合成RNA,该RNA具有在互补序列X'的3'端附力口2个U、'在5'端附-加前导序列的序列。通过混合2个反应液，进一步继续进行体外转录反应，可以使含有相互互补的序列的2条RNA退火。之后，在脱氧核糖核酸酶及单链RNA特异性的核糖核酸酶的作用下，分解除去用作模板的双链DNA及各RNA链的5'端的前导序列。各RNA链的3'端的2个U不分解，保持附加状态。以上的反应可以使用SilencerSiRNA合成试剂盒(SilencersiRNAConstructionKit,Ambion公司制)等试剂盒进行。与T7引物退火的DNA可以通过DNA合成机进行化学合成。另夕卜，也可以委托Ambion乂〉司、日本BioServices才朱式会牙土、北海道SystemScience才朱式会3土、QIAGEN公司等制造商进行化学合成。(ii)为shRNA时酸连接、在3'端附加16个、优选24个核苷酸(与上述定义相同)形成的具有发夹结构的RNA可以通过使用DNA合成机的化学合成进行制备。(111)KLF5基因的表达抑制在表达KLF5基因的细胞抹中导入(II)制备的siRNA或shRNA。作为细胞抹，使用与作为(I)的序列X的设计基础的KLF5cDNA相同的动物种的细胞。作为表达KLF5基因的细胞抹，可以举出来自平滑肌、成纤维细胞或血管内皮细胞的细胞抹，例如小鼠胎鼠成纤维细胞抹C3H/10T1/2(ATCC序号CCL-226),人脐带血管内皮细胞等。RNA的导入可以通过下述方式进行，使用动物细胞转染用试剂，例如Polyfect转染试剂(QIAGEN公司制)、TransMessenger转染试剂、Oligofectamine"i式剂(invitrogen,/^司制)、Lipofectamine2000(invitrogen公司制)等，使上述试剂与RNA混合形成复合体之后，添加到细胞中。导入RNA的细胞中的KLF5基因的表达可以通过RT-PCR进行解析。用导入RNA的细胞及未导入RNA的细胞制备总RNA,由该RNA合成cDNA。将合成的cDNA作为模板，使用KLF5基因的特异性引物，进行PCR,通过采用琼脂糖凝胶电泳定量来自KLF5cDNA的扩增产物的量，测定KLF5基因的表达量。选择如下所述的RNA,即，与未导入该RNA的细胞中KLF5基因的表达量相比较，导入了该RNA的细胞的KLF5基因的表达量减少。例如作为抑制KLF5基因的表达的RNA,可以举出在由序列号211中任一序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA的每条链的3'端附加了2个尿苷酸的双链RNA等。在由序列号211中任一序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA的每条链的3'端附加了2个尿苷酸的双链RNA,是以小鼠cDNA的序列为基础设计得到的RNA,可以抑制小鼠KLF5基因的表达。其中，序列号4、8及IO的序列分别是小鼠和人各自的KLF5mRNA共有的序列，因此在由序列号4、8及10中任一序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA的每条链的3'端附加了2个尿苷酸的双链RNA,不仅可以抑制小鼠KLF5基因表达，而且也可以抑制人KLF5基因的表达。通过将作为(I)的序列X的设计基础的动物种A的KLF5cDNA和不同动物种B的KLF5cDNA基于序列的同源性进行对比，可以得到与在动物种A中选择的序列X相对应的动物种B的序列Y。按照上述方法得到可以抑制动物种A的KLF5基因表达的RNA时，RNA的序列X及其互补序列X'的区域分别被取代成序列Y及其互补序列Y'所得的RNA,被认为可以抑制动物种B的KLF5基因。例如，在由以小鼠KLF5cDNA的序列为基础的序列号2、3、7、9及l1中任一序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA的每条链的3'端附加了2个尿苷酸的双链RNA,由于可以抑制d、鼠KLF5基因表达，所以在由作为与人KLF5cDNA对应的序列的序列号1216中任一序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA的每条链的3'端附加了2个尿苷酸的双链RNA,被认为能够抑制人KLF5基因表达。作为本发明的组合物中的脂质体(以下称为脂质体A),只要是包封了含有靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列及与该序列互补的序列的RNA,且能够到达含有靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体即可，没有特殊的限制。例如，可以举出由含有前导粒子和上述RNA的复合粒子及包封该复合粒子的脂质膜构成的脂质体等；优选举出下述脂质体，即，所述脂质体由以前导粒子和该RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的才及性有机溶剂的液体，此液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。另外，作为脂质体A,也优选举出下述脂质体，即，所述脂质体由复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，其中所述复合粒子以含有阳离子性脂质的前导粒子和上述RNA为构成成分，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分；优选举出下述脂质体，即，所述脂质体由含有前导粒子和上述RNA作为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述脂质膜的构成成分为中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，并且，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的极性有机溶剂的液体，此液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。本发明的前导粒子，例如可以举出以脂质集合体、脂质体、乳液微粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等为构成成分的微粒，优选以脂质体为构成成分的微粒。本发明的前导粒子可以将脂质集合体、脂质体、乳液微粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等中的2种以上组合形成的复合体作为构成成分，也可以将脂质集合体、脂质体、乳液微粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等和其他化合物(例如糖、脂质、无机化合物等)组合形成的复合体作为构成成分。作为前导粒子的构成成分的脂质集合体或脂质体(以下称为脂质体B),例如可以由脂质及/或表面活性剂等构成，作为脂质，可以为单纯脂质、复合脂质或衍生脂质中的任意一种，例如可以举出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘氨醇碱(sphingoid)、固醇等，优选磷脂。另外，作为脂质，例如也可以举出表面活性剂(与下述的表面活性剂的定义相同)、高分子(与下述的高分子的定义相同，具体而言为葡聚糖等)、聚氧乙烯衍生物(具体而言为聚乙二醇等)等脂质衍生物，优选举出聚乙二醇化磷脂。作为表面活性剂，例如可以举出非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂等。作为磷脂，例如可以举出卵磷脂(具体而言可以举出大豆卵磷脂、卵黄卵磷脂(EPC)、二硬脂酰卵磷脂、二椋榈酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二油酰卵磷脂等)、磷脂酰乙醇胺(具体而言可以举出二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具体而言可以举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂等)、鞘磷脂(sphingophospholipid)(具体而言可以举出革肖石粦月旨(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神经酰胺、磷酸甘油神经酰胺、神经酰胺磷酸甘油磷酸酯(ceramidephosphoglycerophosphate)等)、甘油膦月旨(glycerophosphonolipid)、孝肖膦月旨(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具体而言可以举出卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)、氢化磷脂(具体而言可以举出氲化卵磷脂等)等天然或合成的磷脂。作为甘油糖脂，例如可以举出磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosylglyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等。作为鞘糖脂，例如可以举出半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苦脂、神经节苷脂等。作为鞘'氨酉事石威，例如可以举出sphingan、icosasphingan、蒋氨西享、上述物质的衍生物等。作为衍生物，例如可以举出sphingan、icosasphingan、鞘氨醇等的-丽2变为-NHCO(CH2)XCH3(式中x表示018的整数，其中优选6、12或18)的衍生物等。作为固醇，例如可以举出胆固醇、脱氢胆固醇、羊毛固醇、|3-谷固醇、菜油甾醇(campesterol)、豆固醇、菜籽甾醇、麦角4丐化甾醇(ergocasterol)、岩藻甾醇、3(3-[N-(N，，N，-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Choi)等。除此之外，作为脂质，例如可以举出N-[1-(2,3-二油酰丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰丙基)]—N,N—二甲基胺(DODAP)、N—[1—(2,3-二油基氧基丙基)]-N，N,N-三曱基氯化铵(DOTMA)、三氟乙酸2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N—二甲基—1一丙胺鎗盐(DOSPA,2,3—dioleyloxy—N—[2_(sperminecarboxyamido)ethyl]-N,N_dimethyl-1—propanaminiumtrifluoroacetate)、N—[1—(2,3—双十四烷氧基丙基)]—N,N-二曱基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油基氧基丙基)]-N,N-二曱基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)等。作为非离子表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(具体而言有聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(具体而言有普鲁洛尼克(Pluronic)F68等)、脱水山梨糖醇脂肪酸(具体而言有脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具体而言有聚氧乙烯氢化茺麻油60、聚氧乙烯月桂醇等)、甘油脂肪酸酯等。作为阴离子表面活性剂，例如可以举出酰肌氨酸、烷基石克酸钠、烷基苯磺酸盐、碳原子数为722的脂肪酸钠等。具体而言可以举出十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酉臾#]。作为阳离子表面活性剂，例如可以举出烷基胺盐、酰基胺盐、季铵盐、胺衍生物等。具体而言可以举出苯扎氯铵、酰基氨基乙基二乙基胺盐、N-烷基聚烷基聚胺盐、脂肪酸聚乙烯聚酰胺、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三曱基溴化铵、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙基胺、三乙醇胺脂肪酸酯等。作为两性离子表面活性剂，例如可以举出3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸、N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸等。优选組合使用。作为组合使用时的组合，例如可以举出选自氲化大豆卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及胆固醇中的2种成分以上的组合，选自二硬脂酰卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及胆固醇中的2种成分以上的组合，EPC和DOTAP的组合，EPC、DOTAP及聚乙二醇化磷脂的组合，EPC、DOTAP、胆固醇以及聚乙二醇化磷脂的组合等。另外，脂质体B可以根据需要含有例如胆固醇等固醇等膜稳定化剂，例如生育酚等抗氧化剂等。作为脂质集合体，例如可以举出球状胶束、球状逆胶束、腊肠状胶束、腊肠状逆胶束、板状胶束、板状逆胶束、六角相I、六角相II及由2分子以上脂质构成的締合体等。作为乳液微粒，例如可以举出脂肪乳剂、由非离子表面活性剂和大豆油构成的乳剂、脂质乳剂(lipidemulsion)、脂质纳米球(lipidnanosphere)等水包油型(O/W)乳剂或水包油包水型(W/O/W)乳液微粒等。作为高分子，可以举出例如白蛋白、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、硫酸葡聚糖、DNA等天然高分子，例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙埽酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰的树枝状高分子(dendrimer)、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、聚乙二醇化聚乳酸等合成高分子，及上述物质的ii、菩jar可。此处，高分子的盐包含例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，例如可以举出锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土金属盐、铝盐、锌盐等。作为铵盐例如可以举出4妄、四甲基铵等的盐。作为酸加成盐，例如可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐，及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐。作为有机胺加成盐，例如可以举出吗啉、哌啶等的加成盐。作为氨基酸加成盐，例如可以举出甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等的加成盐。作为金属胶体，例如可以举出含有金、银、鉑、铜、铑、二氧化硅、钓、铝、铁、铟、镉、钡、铅等的金属胶体。作为微粒制剂，例如可以举出微球(micro-sphere)、微嚢、纳米晶体(Nano-Crystal)、脂质纳米颗粒(Nano-particle)、高分子月交束等。另外，本发明的前导粒子优选含有选自例如糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂等。选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂，可以作为前导粒子的构成成分使用，也可以添加到前导粒子的构成成分中加以-使用。作为选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂，优选举出糖脂质、或水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，较优选举出水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂，优选为具有两性的物质，即分子的一部分具有通过例如疏水性亲和力、静电相互作用等与前导粒子的其他构成成分键合的性质，另一部分具有通过例如亲水性亲和力、静电相互作用等与制备前导粒子时的溶剂键合的性质。作为糖、肽或核酸的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等糖，例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等核酸，和例如上述前导粒子定义中举出的脂质或例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸键合得到的物质等，优选举出例如聚乙二醇化脂质、聚甘油化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯等。作为糖的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的甘油糖脂、鞘糖脂等。作为水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙蜂基吡咯烷酮、聚天冬酰胺(polyaspartateamide)、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖(pullulan)、甘油低聚物(oligoglycerol)等或上述物质的衍生物与例如上述前导粒子的定义中举出的脂质、或例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸键合得到的衍生物等，较优选聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，更优选聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。作为聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚乙二醇化脂质(具体而言有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具体而言有1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[曱氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氩化蓖麻油60、聚氧乙烯蓖麻油(CREMOPHOREL)等)、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯类(具体而言有聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯等)、聚乙二醇脂肪酸酯类等，更优选聚乙二醇化脂质。作为聚甘油衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚甘油化脂质(具体而言，有聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)、聚甘油脂肪酸酯类等，更优选举出聚甘油化脂质。作为表面活性剂，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的表面活性剂、聚乙二醇烷基醚等，优选举出聚氧乙烯聚丙二醇聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。另外，优选前导粒子带有正电荷。此处所谓的正电荷包括对上述RNA内的电荷、分子内极化等产生静电引力的电荷、表面极化等。为了使前导粒子带有正电荷，优选前导粒子含有阳离子性物质，较优选前导粒子含有阳离子性脂质。前导粒子中含有的阳离子性物质为呈现阳离子性的物质，但即使是具有阳离子性基团和阴离子性基团的两性物质，由于相对电负性根据pH或与其他物质键合等而变化，所以根据不同情况，可分类为阳离子性物质。上述阳离子性物质可以作为前导粒子的构成成分使用，也可以添加到前导粒子的构成成分中加以^吏用。作为阳离子性物质，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的物质中的阳离子性物质[具体而言，有阳离子性脂质、阳离子型表面活性剂(与上述定义相同)、阳离子型高分子等]、可以在等电点以下的pH值下形成复合体的蛋白质或肽等。作为阳离子性脂质，例如可以举出DOTAP、DODAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE、DC-Chol等。作为阳离子性高分子，例如可以举出聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、PolyFect、脱乙酰壳多糖等。作为能够在等电点以下的pH值下形成复合体的蛋白质或肽，只要是能够在该物质的等电点以下的pH值下进行形成复合体的蛋白质或肽即可，没有特殊的限制。例如可以举出白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、血纤维蛋白原、胃蛋白酶、核糖核酸酶T1等。本发明中的前导粒子可以采用公知的制备方法或以其为基准进行制备，可以是使用任意制备方法制备得到的前导粒子。例如，前导粒子之一的以脂质体B为构成成分的前导粒子的制备，可以适用公知的脂质体的制备方法。作为公知的脂质体的制备方法，例如可以举出Bangham等的脂质体制备方法[参见"分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，，，1965年，第13巻，p.238-252]、乙醇注入法[参见"细月包生物学杂志(J.CellBiol.)"，1975年,第66巻，p.621-634]、法式压滤法(Frenchpressmethod)[参见"FEBSLett,"，1979年，第99巻，p.210-214]、冷冻融解法[参见"生物化学与生物物理学报(Arch.Biochem.Biophys.)，，，1981年，第212巻，p.l86-194]、逆相蒸发法[参见"美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，，，1978年，第75巻，p.4194-4198],pH梯度法(参见例如日本专利第2572554号公报，日本专利第2659136号公报等)等。制备脂质体B时，作为使脂质体B分散的溶液，例如可以使用水、酸、石威、各种緩冲液、生理食盐液、氨基酸输液等。另外，制备脂质体B时，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化剂，例如甘油、葡萄糖、氯化钠等等渗剂。另外，可以如下制备脂质体，将脂质等溶解于例如乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理盐水等，振动搅拌，形成脂质体B。另外，也可以任意地通过例如非离子表面活性剂(与上述定义相同)、阳离子表面活性剂(与上述定义相同)、阴离子表面活性剂(与上述定义相同)、高分子、聚氧乙烯衍生物等进行脂质体表面改质，上述表面改质脂质体也可以用作本发明的前导粒子的构成成分[参见D.D.Lasic、F.Martin编写的"StealthLiposomes"(美国)，CRCPressInc,1995年，p.93-102]。作为高分子，例如可以举出葡聚糖、茁霉多糖、甘露聚糖、支链淀粉(amylopectin)、羟乙基淀粉等。作为聚氧乙烯衍生物，例如可以举出聚山梨酸酯80、普鲁洛尼克F68、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇、PEG-DSPE等。脂质体表面改质也可以作为使前导粒子含有选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂的一种方法。脂质体B的平均粒径可以根据需要自由地选择。作为调节平均粒径的方法，例如可以举出4齐压延伸(extrusion)法、才几才成式粉石争(具体而言，使用蒙顿胶体磨、超微粒分散乳化机等)较大的多层脂质体(MLV)的方法[参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著的"EmulsionandNanosuspensionsfortheFormulationofPoorlySolubleDrugs",《老、国其斤图力口才争，ScientificPublishers,1998年，p.267—294]等。另外，将选自构成前导粒子的例如脂质集合体、脂质体B、乳液微粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等中的2种以上物质组合得到的复合体的制备方法，例如可以为只在水中混合例如脂质、高分子等的制备方法，此时，根据需要也可以进一步加入整粒工序或无菌化工序等。另外，也可以在例如丙酮、乙醚等各种溶剂中进行复合体的形成。本发明的前导粒子的大小，优选平均粒径为数iim数十pm，较优选为10nm1000nm,更优选为50nm300nm。作为构成本发明脂质膜的成分，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的脂质、表面活性剂等，优选举出脂质、表面活性剂中的中性脂质，较优选磷脂，更优选EPC。另外，脂质膜的构成成分优选可溶于冲及性有机溶剂，并优选存在含有该极性有才几溶剂的液体，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。此处，所谓中性脂质，是指下述物质之外的脂质，即脂质、表面活性剂中，上述前导粒子带有正电荷时阳离子性物质中列举的阳离子性脂质和阳离子型表面活性剂及下述的附着竟争剂中列举的阴离子性脂质和阴离子型表面活性剂之外的脂质，作为中性脂质，优选举出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂等。作为本发明中的极性有机溶剂，例如可以举出曱醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、氺又丁醇等醇，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇，聚乙二醇等聚亚烷基二醇，优选乙醇。另外，作为脂质膜中使用的脂质，例如也可以举出合成脂质等。作为合成脂质，例如可以举出氟化卵磷脂、氟化表面活性剂、溴化二烷基铵等，上述物质可以单独使用，也可以与其他脂质等组合使用。另外，脂质膜优选含有水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物、或者选自上述的糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂，较优选含有上述水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，更优选含有上述聚乙二醇化磷脂，最优选含有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。作为本发明中的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，例如可以举出上述的选自糖、蛋白质及肽、核酸及水溶性高分子中的l种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，或者选自糖、蛋白质及肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂肪烃衍生物，优选举出糖脂、或水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，较优选举出水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。作为水溶性物质的脂肪烃衍生物，可以举出水溶'f生物质和例如长链脂肪醇、聚氧丙蹄烷烃、甘油脂肪酸酯的醇性残基等键合形成的衍生物。作为糖、肽或核酸的脂肪烃衍生物，可以举出下述物质的脂肪烃衍生物，例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等糖，例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等核酸。作为水溶性高分子的脂肪烃衍生物，例如可以举出聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙婦醇、聚丙烯酸、聚丙歸酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油低聚物等或上述物质的衍生物的脂肪烃衍生物，较优选聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂肪烃衍生物，更优选聚乙二醇衍生物的脂肪烃衍生物。前导粒子是以脂质体B为构成成分的微粒时，由以脂质体B和上述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成的脂质体为脂质体A,根据其构成，分类为狭义的脂质体，即使前导粒子是以脂质体B为构成成分的微粒之外的微粒时，也由于被覆脂质膜，所以被分类为广义的脂质体。在本发明中，较优选前导粒子的构成成分也为脂质体。本发明中的以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子，可以在制备该前导粒子后或在制备该前导粒子的同时，在前导粒子中附着或包封该RNA，制备复合粒子，然后在制备该复合粒子后或制备该复合粒子的同时，用脂质膜被覆该复合粒子，制备脂质体A。脂质体A可以通过下述方法进行制备，例如可以根据特表2002-508765号公报、特表2002-50151l号公报、"BiochimicaetBiophysicaActa",2001年，第1510巻，p.152-166、国际公开第02/28367号说明书等中记载的公知制备方法或以其为基准进行制备，或者，例如采用包含下述工序的制备方法进行制备，所述工序为在前导粒子中附着或包封上述RNA制备复合粒子后，使该复合粒子及被覆层成分分散于液体中的工序，所述液体含有可溶解该被覆层成分的极性有机溶剂，其浓度为该复合粒子不溶解、该被覆层成分以分散状态存在的浓度；及用该被覆层成分纟皮覆该复合粒子的工序。作为本发明的组合物中的脂质体的优选制备方法，可以举出下述含有制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序(工序1)和用脂质膜被覆该复合粒子的工序(工序2或工序3)的制备方法。工序l)制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序使前导粒子分散在例如水等溶剂中，在前导粒子分散的溶液中，4吏上述RNA分散或溶解混合，使该RNA附着在前导粒子上。在工序l中，为了抑制前导粒子的凝集，优选前导粒子为含有凝集抑制物质的前导粒子，较优选含有上述选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的l种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂作为凝集抑制物质。另外，前导粒子为带有正电荷的粒子时，在前导粒子分散的溶液中，可以使该RNA和附着竟争剂共存，使附着竟争剂与该RNA一同附着在前导粒子上，进而前导粒子为含有凝集抑制物质的前导粒子时，为了进一步抑制前导粒子的凝集，也可以使用附着竟争剂。作为前导粒子和上述RNA的组合，优选复合粒子能够分散在含有极性有机溶剂的液体中的组合，较优选复合粒子在极性有机溶剂中的溶解度低于工序2或3中使用的脂质膜的构成成分的组合。另外，较优选存在下述含有极性有机溶剂的液体的组合，所述液体以该脂质膜构成成分能够分散、该复合粒子也能分散的浓度含有该极性有机溶剂。作为附着竟争剂，例如可以举出阴离子性物质等，该阴离子性物质包含通过分子内电荷、分子内极化等产生的静电引力而静电地附着在前导粒子的构成成分上的物质。用作附着竟争剂的阴离子性物质为呈阴离子性的物质，但即使是含有阴离子性基团和阳离子性基团的两性物质，由于通过pH或与其他物质结合等使相对电负性发生变化，所以根据情况，可被分类成阴离子性物质。作为阴离子性物质，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的物质中的阴离子性物质[具体而言，有阴离子性脂质、阴离子型表面活性剂(与上述定义相同)、阴离子型高分子等]、可以在等电点以上的pH值下形成复合体的蛋白质或肽、核酸等，优选选自硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、葡聚糖荧光素阴离子(dexstranfluoresceinanionic)等中的l种以上物质。作为阴离子性脂质，例如可以举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。作为阴离子型高分子，例如可以举出聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰的树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、葡聚糖荧光素阴离子等。作为可以在等电点以上的pH值下形成复合体的蛋白质或肽，只要是能够在该物质的等电点以上的pH值下形成复合体的蛋白质或肽即可，没有特殊的限制。例如，可以举出白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、血纤维蛋白原、组蛋白、鱼精蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等。作为阴离子性物质的核酸，例如可以举出DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等，只要为无生理活性的物质，就可以为任意长度的任意序列。优选附着竟争剂静电地附着在前导粒子的构成成分上，优选大小为即使附着在前导粒子的构成成分上也不形成使前导粒子构成成分凝集等的交联的物质，或者在分子内具有附着部分、和排斥附着、抑制前导粒子凝集的部分的物质。工序l，更具体而言可以采用例如下述的制备方法实施，所述制备方法包括如下步骤，即制备分散有舍有凝集抑制物质的前导粒子的液体的步骤、及在该前导粒子分散的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的步骤(例如，在该前导粒子分散的液体中，加入该RNA使其分散或溶解的步骤，在该前导粒子分散的溶液中，加入该RNA分散或溶解的液体的步骤等)。此处，通过在前导粒子分散的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的工序，获得复合粒子，作为该复合粒子，具体而言可以举出，该RNA附着在以含有该阳离子性脂质的脂质体B为构成成分的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在以含有阳离子性脂质的脂质集合体为构成成分的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在以含有聚-L-赖氨酸等阳离子性高分子的高分子为构成成分的微粒上而形成的复合粒子。另外，在前导粒子分散该RNA分散或溶解的液体中进一步混合附着竟争剂所得的液体加入该前导粒子分散的液体中的步骤。此时，该RNA和该附着竟争剂一同附着在该前导粒子上，制备复合粒子，该制备是通过抑制该复合粒子制备中前导粒子的凝集、及制备后的复合粒子的凝集而进行的。前导粒子在前导粒子分散的液体中所占的比例，只要上述RNA能够附着在前导粒子上即可，没有特殊的限制，优选为l吗/mLlg/mL,较优选为0.1500mg/mL。工序2)用脂质膜被覆复合粒子的工序(1)通过包含以下步骤的制备方法制备脂质体A,所述步骤包括制备含有极性有机溶剂的液体(液体A)的步骤，所述极性有机溶剂中分散有工序1所得的复合粒子且溶解了脂质膜的构成成分，以及通过减少液体A中极性有机溶剂'的比例，用脂质膜被覆复合粒子的步骤。此时，以分散液(液体B)的形态获得脂质体A。液体A中的溶剂是含有极性有机溶剂的溶剂，极性有机溶剂的浓度为该脂质膜构成成分可以溶解、该复合粒子可以分散的浓度，在降低液体A中极性有机溶剂的比例而得到的液体B中，该脂质膜的构成成分可以分散，该复合粒子也可以分散。液体A中的溶剂为极性有机溶剂与极性有机溶剂以外的溶剂的混合液时，通过加入例如含有能够与极性有机溶剂混合的极性有机溶剂以外的溶剂(液体C),及/或，通过蒸馏除去、半透膜分离、分馏等选择性地除去极性有机溶剂，能够减少极性有机溶剂的比例。此处，液体C含有极性有机溶剂以外的溶剂，也可以含有才及性有机溶可。作为工序2中的极性有机溶剂以外的溶剂，例如可以举出水、液体二氧化碳、液烃、卣化碳、卣化烃等，优选水。另外，液体A及液体C可以含有离子、緩冲成分等。极性有机溶剂和极性有机溶剂以夕卜的溶剂的组合优选为可以相中复合粒子和脂质膜的构成成分的溶解度等进行选择。另一方面，优选在极性有机溶剂及极性有机溶剂以外的溶剂中的溶解度也低。脂质液体A的溶剂中的溶解度高，并且优选在极性有机溶剂中的溶解度高，优选在极性有机溶剂以外的溶剂中的溶解度低。此处，复合粒子的溶解度低时，复合粒子中含有的前导粒子、RNA及附着竟争剂等各成分在溶剂中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，只要通过各成分间的键合等使得各成分的溶出性变小即可。例如，前导粒子中含有的任意成分在液体A的溶剂中的溶解度高时，在前导粒子带有正电荷的情况下，只要通过RNA内的电荷、分子内极化等静电键合，使上述成分在液体A中的溶剂中的溶解度降低，就可以抑制复合粒子中的成分溶出，从而降低复合粒子在液体A的溶剂中的溶解度。即，在脂质体A的制备中，前导粒子带正电荷能够抑制复合粒子的成分溶出，具有提高制备性和成品性的效果。液体A中极性有机溶剂的比例，只要脂质膜的构成成分可溶且复合粒子可以分散即可，没有特殊的限制，根据所用的溶剂或复合粒子、脂质膜的构成成分的种类等的不同而不同，优选为30v/vQ/。以上，较优选为6090v/v0/。。另夕卜，液体B中的极性有才几溶剂的比例，只要以比液体A低的浓度含有该极性有机溶剂，且脂质膜的构成成分及复合粒子都可分^:即可，没有特殊的限制，优选为50v/v。/。以下。作为制备液体A的工序，只要复合粒子不溶解，就可以是按任意顺序加入极性有机溶剂、复合粒子及脂质膜的构成成分、或者极性有机溶剂、复合粒子、脂质膜的构成成分及极性有机溶剂以外的溶剂，制备液体A的工序，优选举出下述工序，即制备含有该复合粒子分散的极性有机溶剂的液体(液体D)，制备使该脂质膜的构成成分溶解剂中的液体(液体E),再混合液体D和液体E制备液体A。混合液体D和液体E制备液体A时，优选緩緩地混合。工序3)用脂质膜被覆复合粒子的工序(2)通过含有如下步骤的制备方法，制备脂质体A,此时，脂质体A以分散液的状态获得，所述步骤为使工序l所得的复合粒子及脂质膜的构成成分分散于液体(液体F)中，所述液体F含有可以溶解该脂质膜的构成成分的极性有机溶剂，其浓度为该复合粒子不溶解、且该脂质膜的构成成分以分散状态存在的浓度。液体F中的溶剂含有可以溶解该脂质膜的构成成分的极性有机溶剂，在含有该极性有机溶剂的溶剂中存在以该脂质膜的构成成分可以分散且该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂的液体。液体F的制备方法可以采取任意方案。例如可以在制备复合粒子的分散液、和脂质膜的构成成分的溶解液或分散液之后，将两种液体混合，制备液体F;也可以制备复合粒子或脂质膜的构成成分任一个的分散液，在此分散液中加入固态的复合粒子或脂质膜的构成成分的另一个，使其分散，制备液体F。在将复合粒子的分散液和脂质膜构成成分的溶解液或分散液混合时，复合粒子的分散介质可以预先含有极性有机溶剂，再将脂质膜的构成成分溶解或分散在其中，脂质膜构成成分的溶剂或分散介质可以为含有才及性有机溶剂的液体或只由极性有机溶剂构成的液体。另一方面，制备复合粒子或脂质膜的构成成分任一个的分散液，在该分散液中加入固态的复合粒子或脂质膜的构成成分的另一个，在此情况下，该分散液为含有极性有机溶剂的液体。需要说明的是，制备液体F后复合粒子不溶解，脂质膜的构成成分分散时，可以在复合粒子不溶解、脂质膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，加入极性有机溶剂，也可以除去有机溶剂或减小浓度。另一方面，制备液体F后复合粒子不溶解，但脂质膜的构成成分溶解的情况下，可以在复合粒子不溶解、脂质膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，除去有机溶剂或减小浓度。另外，可以预先在极性有机溶剂以外的溶剂中混合复合粒子和脂质膜的构成成分，在复合粒子不溶解、脂质膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内向其中加入极性有机溶剂，此时，使复合粒子和脂质膜的构成成分分别分散于极性有机溶剂以外的溶剂中，混合两分散液后，加入极性有机溶剂，也可以使复合粒子和脂质膜的构成成分中的任一个分散在极性有机溶剂以外的溶剂中，在此分散液中加入固体状态的复合粒子和脂质膜的构成成分中的另一个，使其分散后，加入极性有机溶剂。另外，优选包括如下步骤，即使复合粒子和脂质膜的构成成分分散的含有极性有机溶剂的液体静置或混合充分时间使脂质膜被覆复合粒子的操作。使复合粒子和脂质膜的构成成分分散在含有极性有机溶剂的液体中后，静置或混合的时间，只要不在使复合粒子和脂质膜的构成成分分散在含有极性有机溶剂的溶液中后立刻结束即可，无特别限定，可以根据脂质膜的构成成分、或含有极性有机溶剂的液体的种类任意地i殳定，优选设定所得脂质体A的收率为定值的时间，例如3秒30分钟。作为液体F中极性有机溶剂以外的溶剂，例如可以举出工序2中的极性有才几溶剂以外的溶剂中例举的例子，优选水。液体F中极性有机溶剂的t匕例，只要满足复合粒子和脂质膜的构成成分都分散的条件即可，没有特殊的限制，根据所用溶剂或复合粒子、脂质膜的构成成分的种类等不同而不同，优选l80vo1。/。，较优选1060vol%,更优选20~50vol%，最优选3040vol%。本发明中，所谓脂质膜的构成成分在极性有机溶剂中可溶，包括质的情况，脂质膜的构成成分具有在可溶化剂的作用下溶解于极性有机溶剂中的性质的情况，脂质膜的构成成分具有能够在极性有机溶剂中形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的性质的情况等。另外，所谓脂质膜的构成成分分散，包括如下几种状态，即脂质膜的构成成分全部形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状态；脂质膜的构成成分的一部分形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分溶解的状态；脂质膜的构成成分的一部分形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。需要说明的是，所谓脂质膜的构成成分溶解，不包括脂质膜的构成成分全部形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状态。本发明中，所谓复合粒子分散，是指复合粒子悬浊或乳浊或者乳剂化的状态，包括如下几种状态，即复合粒子的一部分悬浊或乳浊或者乳剂化，剩余部分溶解的状态，复合粒子的一部分乳浊或者乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。所谓复合粒子不溶解，与上述复合粒子分散定义相同。在本发明的脂质体A的制备方法中使用的、含有极性有机溶剂的水溶液中的复合粒子的浓度，只要能够用脂质膜被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选为l(ig/mLlg/mL,较优选0.1500mg/mL。另外，所用的脂质膜的构成成分的浓度，只要能够被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选为l(ig/mLlg/mL,较优选0.1400mg/mL。脂质膜相对于本发明的脂质体A的比例，以重量比计优选l:0.11:1000,4支优选1:10。另外，本发明中脂质体A的大小，优选平均粒径为300nm以下，较优选为200nm以下，具体而言，优选例如可以注射的大小。并且，可以通过抗体等蛋白质、糖类、糖脂质、氨基酸、核酸、各种低分子化合物、高分子化合物等物质对上述得到的脂质体A进行修饰，通过上述修饰得到的被覆复合粒子也包括在脂质体A中。例如，为了用于导向，也可以进一步用抗体等蛋白质、肽、脂肪酸等对上述所得的脂质体A进行脂质膜的表面修饰[参见D.D.Lasic、F.Martin编写的"StealthLiposomes"(美国)，CRCPressInc,1995年,p.93-102]。另外，也可以用例如水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，对上述脂质体A任意地进行表面改质。用于上述表面改质的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，与上述作为脂质膜构成成分的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的定义相同。通过将本发明的组合物给与哺乳动物，能够将上述RNA送达到含有靶基因表达部位的组织或脏器中，例如，能够在体内向哺乳动物细胞中导入可抑制KLF5基因或通过KLF5使转录活化的基因的表达的RNA，抑制KLF5基因或通过KLF5使转录活化的基因的表达。通过本因的表达，从而抑制平滑肌的增殖或血管的新生，因此，本发明的组合物可以用作动脉硬化、冠动脉介入后的再狭窄、心肌肥大等心血管类疾病、癌症等的治疗剂或预防剂的有效成分。另外，上述RNA的輩巴以通过纟会与该组合物作为肿瘤治疗剂，进行肿瘤治疗、或纟会与该组合物作为炎症治疗剂进行炎症的治疗。另外，本发明的组合物也可以在体内的筛选体系中用作POC(Proofofconcept)获取的工具。本发明的组合物也可作为制剂使用，其目的是例如稳定血液成分等生物体成分(例如血液、消化液等)中的上述RNA，降低副作用、增加药剂在肿瘤等靶脏器的积累性，改善口服或经粘膜时的药物吸收等。本发明的组合物作为医药品的制剂使用时，作为给药途径，优选使用治疗时具有最佳效果的途径，可以举出口腔内、气管内、直肠内、皮下、月几肉内、静脉内等非口服给药或口服给药，优选静脉内给药或肌肉内给药，较优选静脉内给药。作为适于静脉内给药或肌肉内给药的制剂例如可以举出注射剂，通过上述方法制备的脂质体A的分散液也可以直接作为例如注射剂等形态使用，也可以通过例如过滤、离心等从该分散液中除去溶剂后进行使用，也可以冷冻干燥该分散液或加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘氨酸等赋形剂的分散剂，进行使用。的脂质体A的分散液或上述除去了溶剂或冷冻干燥后的脂质体A中，混合例如水、酸、碱、各种緩沖液、生理盐水、氨基酸输液等，制备注射剂。另外，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA等抗氧化剂、甘油、葡萄糖、氯化钠等等渗剂等，制备注射剂。另外，也可以加入例如甘油等冷冻保存剂进行冷冻保存。另外，也可以将脂质体A与适当的赋形剂等一同进行造粒、干燥等，加工成例如胶嚢剂、片剂、颗粒剂等口服制剂。本发明的脂质体，可以举出下述脂质体，即一种脂质体，由复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述复合粒子以前导粒子和上述RNA为构成成分，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的极性有机溶剂的液体，该液体以该脂质膜的构成成分可以分散、复合粒子及被覆该复合粒子^脂质膜构成，所述复合粒子以含有阳离子性脂质的前导粒子和上述RNA为构成成分，该脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。接下来，根据实施例及参考例，具体地说明本发明。但本发明并不限定于这些实施例及参考例。参考例lsiRNA的制备l作为能够抑制KLF5基因表达的siRNA序列，从小鼠KLF5cDNA的序列(基因库注册序号NM—009769、序列号41)中选择了ll个部分序列，该序列符合(a)以AA开始的21个碱基的序列、(b)GC含量为20~80%这样2个条件。但是，尽可能在起始密码子(序列号41的第167169的序列)下游75个碱基以上的编码区域(序列号41的第1671507的序列)内的序列中选择GC含量为4060。/。的序列。选择的序列在序列号41中序列的位置、GC含量如表1所示。将除去了所选序列5'端AA的19个碱基序列的T变为U得到的序列，分别如序列号111所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>如下所述制备由序列号111中任意序列及与该序列互补的序列构成、且在每个序列的3'端分别附力p2个U或dT的ll种双链RNA(以下，分别称为siRNANo.1No.ll)。siRNANo.1No.ll各自的有意义链及反义链的序列如表l所示(序列号1738)。委托林式会社日本BioServices化学合成由序列号17及18的序列所示的2条RNA,使得到的RNA退火，由此制备siRNANo.l。siRNANo.2~No.ll通过利用沉默siRNA制作试剂盒(SilencersiRNAConstructionKit,Ambion公司制)的体外转录进行制备。用于制作体外转录模版的DNA,委托北海道SystemScience抹式会社进行化学合成。参考例2siRNA的制备2关于参考例1所得的siRNANo.24及711,通过以序列的同源性为基础排列小鼠KLF5cDNA和人KLF5cDNA,得到与小鼠中选择的序列相对应的人的序列。作为设计基础的小鼠KLF5cDNA上的21个碱基的序列及其在序列号41中的位置、与该小鼠序列对应的人cDNA上的21个碱基的序列、其在序列号42中的位置、表示从该人序列中除去5'端AA得到的RNA序列的序列号，如表2所示。需要说明的是，siRNANo.5及6由于以非编码区域的序列为基础，所以无对应的人的序列。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>实施例l将DOTAP(Avantipolarlipids^〉司制)/PEG-DSPE(日本油脂制、以下相同)/蒸馏水按30mg/12mg/mL混合，用涡流混合器振动搅拌。在室温下将所得分散液通过0.4jam的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman制)4次,通过O.lnm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman制)IO次，再通过0.05pm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman制)24次，制备前导粒子。在0.5mL所得前导粒子的分散液中，添加0.25mL参考例l或2的8mg/mL的siRNANo.4水溶液，加入lmL乙醇，制备复合粒子。在所得复合粒子的分散液中，添加0.25mL将脂质膜构成成分EPC(日本油脂制)/PEG-DSPE以120mg/25mg/mL溶解于乙醇中所得的溶液，然后，緩緩地加入23mL蒸馏水，使乙醇的浓度为5vol。/o以下，制备脂质体。将所得脂质体的分散液进行超离心(l小时、110,000xg、25°C)，除去上清液，加入生理食盐水，使其再分散，得到脂质体分散液(PEG-DSPE乙醇溶液)。将相对于120重量份EPC为50重量份的PEG-DSPE溶解于少量(脂质体分散液的约l/25容量)的乙醇中。脂质体分散液和PEG-DSPE乙醇溶液分别在70。C下加热2分钟。然后，向PEG-DSPE乙醇溶液中加入脂质体分散液，混合后，在70。C下加热2分钟后，水浴冷却，得到制剂。制剂制备3批。采用动态光散乱法(A型ELS-800、大塚电子)测定脂质体的平均粒径，分别为102、103、95nm。实施例2在0.5mL与实施例1相同地得到的前导粒子的分散液中，分别加入0.25mL参考例1或2的8mg/mL的siRNANo.l~3及5~16的水溶液，加入lmL乙醇，分别得到该siRNANo.l~3及5~16的复合粒子。对所得复合粒子的分散液，进行与实施例1相同的操作，得到分别包封该siRNANo.l~3及5~16的脂质体。对所得脂质体进行与实施例1相同的才喿作，分别得到该siRNANo.1~3及5~16的制剂。比專交例1将实施例1中的siRNA变为杂混的KLF5-siRNA(有意义链，5，-GGUACACAUGUGCACACAC-dTdT-3，；反义4连，5，-GUGUGUGCACAUGUGUACC-dTdT-3，，北海道SystemScience社)，相同地获得制剂。制备3批以上制剂。需要说明的是，杂混的KLF5-siRNA是不含KLF5-mRNA的序列及与该序列互补的序列的RNA。采用动态光散射法(纳米粒度仪ZS(ZetasizernanoZS),Malvern制)测定脂质体的平均粒径，其中一例为88nm。比寿交例2将参考例l或2的siRNANo.4(KLF5siRNA)溶解于生理盐水中，制备0.5mg/mL水溶液。比專交例3与比较例1相同地将杂混的KLF5-siRNA溶解于生理盐水中，制备0.5mg/mL水溶液。试-验例1对小鼠(BL6J小鼠、雄性、5周龄)皮下给与lxl()6个鼠LL/2lewis肺癌细胞["生物化学杂志(TheJournalofBiologicalChemistry)，，，2003年，278巻，p.34598-34604]。由于LL/2的增殖较大地受到血管新生的影响，因此可以用于血管新生抑制剂的筛选。从细胞固定时(皮下投药后1~2日)开始，连续数日尾静脉给与实施例1所得的制剂。给与的制剂预先用磷酸緩冲食盐水稀释，使总脂质终浓度为5mg/mL,对小鼠的投药量设定为siRNA150ng/次/只/天。随着时间变化，测定植入小鼠内的肺瘤的大小，测定肝瘤的增殖。结果如图1所示。另外，给药10天后，从小鼠中摘出肿瘤，在观察癌细胞周围的血管新生的同时，采用如下方法对癌周围切片进行CD31免疫染色及苏木素伊—红染色(Hematoxylinandeosinstaining)，用显孩i镜进行7见察。CD31免疫染色将曱醇固定的肿瘤用石蜡包埋后，制成厚为5pm的切片，切片脱石蜡化后，在室温下加入0.5%山羊血清阻断IO分钟。吸出阻断液后，加入抗小鼠CD31抗体(100倍稀释)[Pharmingen社制]，在室温下静置2小时。用PBS清洗后，加入结合有生物素的抗大鼠Ig抗体(200倍稀释)(DAKO公司制)，将切片在室温下静置1小时。用PBS清洗后，加入ABC-AP试剂盒AK-5000[VectorLaboratories公司制],在室温下静置30分钟。用PBS清洗后，加入VectorRedSK-5100[VectorLaboratories公司制],在室温下静置30分钟，使其显色。水洗后，用苏木素染色液进行后染色，脱水，用显微镜观察。苏木素伊红染色将甲醇固定的胂瘤用石蜡包埋后，制成厚为5jam的切片。切片脱石蜡后，用流水清洗，通入蒸馏水。加入苏木素染色液静置5分钟。水洗，加入0.5%盐酸水溶液进行分离。用流水清洗5分钟进行显色，通入蒸馏水。加入伊红染色液，静置3分钟。用95%乙醇进行分离，脱水，用显微镜观察。.A/v图l可知，给与实施例1所得制剂的组与未处理组相比，可以抑制癌细胞增殖。另外，在给药10天后对癌细胞周围的观察中，发现给与实施例1所得制剂的组，与未处理组相比，肿瘤自身变小且肿瘤中心部分大部分坏死。并且，在对给与实施例1所得制剂的组的苏木素伊红染色及CD31免疫染色的肿瘤组织切片进行显微镜观察时，与未处理组相比，可观察到在胂瘤周围及肿瘤内的血管内皮细胞减少，由此可以明确给与实施例1所得制剂的组能够抑制血管新生。即，通过抗血管新生效果及癌细胞增殖抑制，例如在l争脉内给与哺乳动物KLF5-siRNA时，本发明的组合物能够高效地到达肿瘤附近，并抑制KLF5基因的表达。试—验例2在小鼠(C57BL/6jjcl小鼠、雄性、6周龄、日本Clea)腋部皮下给与1\106个鼠LL/21ewis肺癌细胞。从肿瘤细胞注射2天后到8天，分别连续数天尾静脉给与含有50|igsiRNA的制剂(实施例1、比较例1)、含有50昭siRNA的siRNA溶液(比较例2、3)及生理盐水。随着时间变化，测定植入小鼠的肺瘤的大小。用肺瘤长径x(短径fxl/2计算肿瘤体积，采用Tukey-kramer法检测显著性差异。结果如图2所示。另外，给药10天后从小鼠中摘除肿瘤，在观察癌细胞周围的血管新生的同时，采用如下方法对癌周围切片进行CD31免疫染色，计数在组织切片上可见的CD31结构。每个肺瘤分为2个视野，分別计数5个肿瘤，表示其平均值。采用Tukey-kramer法检测显著性差异。结果如图3所示。CD31免疫染色摘除肿瘤，用95%曱醇溶液固定后，包埋在石蜡中。将肝瘤切成5(am厚薄片后，脱石蜡，然后在室温下4吏其与稀释100倍的抗CD31多克隆抗体(Pharmingen公司制，美国)作用120分钟。清洗CD31抗体后，在室温下使其与稀释200倍的生物素化抗大鼠IgG(DAKO公司制，美国)作用60分钟。进一步清洗后，在室温下，使其与HRP化抗生物素蛋白(Vector公司制，美国)作用30分钟。清洗后，用二氨基联苯胺(diaminobenzine)(SIGMA公司制，美国)使其显色。从图2可知，只有给与实施例1所得制剂的组具有显著地抑制肿瘤增殖的效果。另外，从图3可知，给与实施例1所得制剂的组，显示新生血管的CD31的茶色结构少，能够抑制肺瘤血管的新生。试-验例3在小鼠(C57BL/6jjcl小鼠、雄性、6周龄、日本Clea)腋部皮下给与1><106个鼠LL/2lewis肺癌细胞。分别给与含有50昭siRNA的制剂(实施例1、比较例1)、含有50jigsiRNA的siRNA溶液(比较例2、3)及生理盐水，给药后36小时摘出胂瘤。采用如下方法测定mRNA表达量及KLF5的量。mRNA表达量的测定<吏用RNeasy纤维组织试剂盒(RNeasyFibroustissuekit)(QIAGEN公司制)，用氧化锆球和破碎机(MM300、QIAGEN)，将摘出的肺瘤细胞溶解后，进行精制，得到RNA。用Superscript第一链合成试剂盒(Invitrogen公司制，美国)，通过随机引物从ljagRNA逆转录得到cDNA。cDNA使用HotStarTaqTM(QIAGEN公司制)和特异性引物进行扩增。此时，将核糖体的18SRNA引物用作内标。扩增循环为95。C15分4(94。C30秒—53。C30秒—72。C30秒)x45次，引物序歹'J如下所示5'-GGTTGCACAAAAGTTTATAC-3',5'-GGCTTGGCGCCTGTGTGCTTCC-3'。使用ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems乂〉司制、美国)和QuantiTectSYBRGreenPCR试剂盒(QIAGEN公司制)定量mRNA的表达量。使用QuantumRNATM典型18S核糖体的RNA引物(QuantumRNAClassic18SribosomalRNAprimer)(Ambion司制、美国)作为内部标准物质进行标准化。采用Tukey-kramer法检测显著性差异。结果如图4所述。。KLF5量的测定将摘出的肿瘤细胞浸渍在适量的溶解用溶液(150mmol/LNaCl,20mmol/LTris、pH7.5,0.1%NonidetP-40,0.1%十二烷基硫酸钠，0.5%去氧胆酸钠，O.lmmol/LDTT,蛋白质分解酶抑制剂)中，<吏用氧化4告球和石皮碎才几(MM300、QIAGEN)溶解，经离心得到上清液。使用Dc蛋白质分析试剂(BIORAD、美国)测定蛋白质浓度。在95。C下将10昭的蛋白质加热处理15分钟，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后的蛋白质转移到硝基纤维素膜(Amersham公司制、美国)上，经阻断处理(在5。/。脱脂乳(skimmilk)中振荡)后，在稀释1000倍的抗KLF5单克隆抗体(协和发酵工业制)中振荡处理1小时。将膜清洗后，用稀释2000倍的HRP标记抗大鼠IgG(Amersham公司制)处理，清洗后，用荧光显色试剂(ECLplus、Amersham公司制)显色，使用图像解析專欠件(ImageQuant、Amersham公司制)对免疫印迹(WesternBlotting)的条带进行定量。每组3只，只有KLF5siRNA给药组一组5只，进行定量。用Tukey-kramer法检测显著性差异。结果如图5所示。从图4可以观察到，只有给与实施例1所得制剂的组中，能够观察到KLF5mRNA的生成被抑制。从图5可以观察到，只有给与实施例1所得制剂的组中，能够观察到KLF5的生成被抑制。参考试验例1在小鼠(C57BL/6jjd小鼠、雄性、56周龄)腋部皮下给与lx106个鼠LL/2lewis肺癌细胞。从注射肿瘤细胞后2天到8天，分别连续数天直4妄给与胂瘤含有lfigsiRNA的siRNA溶液(比较例2、比较例3)及生理食盐水。随着时间变化，测定植入小鼠的肿瘤的大小。用肿瘤长径x(短径)2><1/2计算肺瘤体积，采用Tukey-kramer法检测显著性差异。结果如图6所示。从图6可知，在给与比较例1所得的KLF5siRNA溶液的组中，可观察到抑制肿瘤生长的倾向，但无显著性差异。另外，在给药IO天后，从小鼠中摘出肿瘤，与试验例2相同地对癌周围切片进行CD31免疫染色，观察。对于显示新生血管的CD31,两组间无显著差异。实施例3将实施例1中的siRNA变为bcl2-siRNA(有意义链5，-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3，，反义链5，-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3'，Dharmaconz:司或北海道SystemScience社)，相同地得到制剂。制备3批以上制剂。采用动态光散射法(纳米粒度4义ZS,Malvern制)测定脂质体的平均粒径，其中一例为110nm。比寿交例4将实施例1中的siRNA变为GL3-siRNA(有意义链，5，-CUUACGCUGAGUACUUCGA-dTdT-3，；反义链，5,-UCGAAGUACUCAGCGUAAG-dTdT-3，，Dharmacon^>司或北海道SystemScience社)，相同地得到制剂。制备3批以上制剂。需要说明的是，GL3-siRNA是不含bcl2-mRNA序列及与该序列互补的序列的RNA。采用动态光散射法(纳米粒度仪ZS,Malvern制)测定的脂质体平均粒径，其中一例为99nm。比寿交例5与实施例3相同地将bcl2-siRNA溶解于生理盐水中，制备0.5mg/mL水溶液。试验例4从棵鼠(BALB/cAJcl-nu、雄性、5周龄、日本Clea)的皮下给与lx107个人前列腺癌细胞DU145(ATCCNo.HTB-81)。皮下给与17天后，测定肝瘤的大小，选择肿瘤达到150-350mm3的棵鼠，尾静脉注射给与实施例3所得制剂。连续给与5天后，停药2天，再连续给与5天。将给与的制剂预先用生理盐水稀释，使siRNA终浓度为0.75mg/mL,对小鼠的给药量为siRNA150(ig/次/只/天。随时间的变化，测定植入小鼠内的肿瘤的大小，测定肿瘤增殖。结果如图7所示。从图7可知，给与实施例3所得制剂的组，与未处理组相比，可以抑制癌细胞增殖。试验例5从棵鼠(BALB/cAJcl-nu、雄性、6周龄、日本Clea)的皮下给与lxl06个人前列腺癌细胞PC-3(ATCCNo.CRL-1435)。皮下给与6天后测定肿瘤的大小，选择肿瘤达到80-120mm3的棵鼠，尾静脉注射给与实施例3、比较例4、5所得制剂。连续给与5天后，停药2天，再连续给与5天。将给与的制剂预先用生理盐水稀释，使siRNA终浓度为0.75mg/mL,对小鼠的主合药量为siRNA150昭/次/只/天。随时间的变化，测定植入小鼠内的肿瘤的大小，测定胂瘤增殖。结果如图8所示。从图8可知，给与实施例3所得制剂的组，与未处理组、给与比较例4所得制剂及比较例5所得溶液的组相比，可以抑制癌细胞增殖。产业上的可利用性本发明的组合物含有包封RNA的脂质体，所述RNA含有耙基因mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，通过将本发明的组合物给与哺乳动物等，能够抑制该靶基因的表达。"序列表自由文本"序列号l-发明人山内雅博、鸟取恒彰、石原淳、八木信宏、加藤泰己序列号17-siRNANo.1有意义链序列号18-siRNANo.1反义链序列号19-siRNANo.2有意义链序列号20-siRNANo.2反义链序列号21-siRNANo.3有意义链序列号22-siRNANo.3反义链序列号23-siRNANo.4有意义链序列号24-siRNANo.4反义链序列号25-siRNANo.5有意义链序列号26-siRNANo.5反义链序列号27-siR里No.6有意义链序列号28-siRNANo.6反义链序列号29-siRNANo.7有意义链序列号30-siRNANo.7反义链序列号31-siRNANo.8有意义链序列号32-siRNANo.8反义链序列号33-siRNANo.9有意义链序列号34-siRNANo.9反义链序列号35-siRNANo.10有意义链序列号36-siRNANo.10反义链序列号37-siRNANo.11有意义链序列号38-siRNANo.11反义链序列号39-SEAP-siRNA有意义链序列号40-SEAP-siRNA反义链权利要求1、一种组合物，所述组合物含有包封RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列及与该序列互补的序列，该脂质体是可到达含有靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。2、如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给与的大小的脂质体。3、如^l利要求1或2所述的组合物，其中所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。4、如^L利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与肺瘤或炎症相关的基因。5、如^L利要求14中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与血管新生相关的基因。6、如斥又利要求13中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为KLF5mRNA。7、如4又利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA是人或小鼠的KLF5mRNA。8、如权利要求6或7所述的组合物，其中，所述RNA是由KLF5mRNA的连续1530个碱基的序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA，并在每条链的3'端以相同或不同的方式附加有总计1~6个的1种或多种核苷酸。9、如4又利要求6或7所述的组合物，其中，所述RNA具有发夹结构，是由KLF5mRNA的连续15~30个》咸基的序列构成的RNA和由与该序列互补的序列构成的RNA通过间隔寡核普酸连接而成的RNA,并在3'端附加有总计16个的1种或多种核苷酸。10、如^又利要求6或7所述的组合物，其中，所述RNA是选自以下(a)(c)的RNA,(a)由序列号216中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双《连RNA,并在每条链的3'端以相同或不同的方式附加有总计2~4个的尿普酸及脱氧胸苷酸中的任一种或2种；(b)由序列号216中的任一个序列构成的RNA和由与该序列互补的序列构成的RNA通过5'端具有2个尿苷酸或脱氧胸苷酸的间隔寡核苷酸连接而形成的RNA，具有发夹结构，并在3'端附加有总计24个的尿香酸及脱氧胸普酸中的任一种或2种；(c)由序列号211中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条链的3'端附加有2个尿苷酸。11、如权利要求13中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为bcl2mRNA。12、如权利要求111中任一项所述的组合物，其中，所述包封RNA的脂质体由以前导粒子和该RNA为构成成分的复合粒子及,皮覆该复合粒子的脂质膜构成，所述脂质体中存在含有该脂质膜构成成分可溶的极性有机溶剂的液体，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。13、如权利要求12所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。14、如权利要求12所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。15、如权利要求1214中任一项所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性脂质的前导粒子，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烂衍生物为构成成分。16、如权利要求111中任一项所述的组合物，其中，所述包封RNA的脂质体由以含有阳离子性脂质的前导粒子和所述RNA为构成成分的复合粒子、及被覆该复合粒子的脂质膜构成，该脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。17、如权利要求15或16所述的组合物，其中，所述阳离子性脂质为选自N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N,N-二曱基胺、N-[1-(2,3-二油基氧基丙基)]-N,N,N-三曱基氯化铵、N-[1-(2,3-双十四烷氧基丙基)]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵及3p-[N-(N，，N，-二曱基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上脂质。18、如权利要求1517中任一项所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。19、如权利要求1518中任一项所述的组合物，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。20、一种包封RNA的脂质体，所述脂质体由以前导粒子和RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述RNA含有耙基因mRNA的连续1530个碱基的序列及与该序列互补的序列，所述脂质体中存在含有该脂质膜构成成分可溶的极性有机溶剂的液体，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分^:的浓度含有该极性有机溶剂。21、如权利要求20所述的脂质体，其中，所述极性有机溶剂为醇。22、如权利要求20所述的脂质体，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。23、如权利要求20~22中任一项所述的脂质体，其中，所述前导粒子是含有阳离子性脂质的前导粒子，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。24、一种包封RNA的脂质体，所述脂质体由以含有阳离子性脂质的前导粒子和RNA为构成成分的复合粒子、及被覆该复合粒子的脂质膜构成，其中所述RNA含有靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列及与该序列互补的序列，所述脂质膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。25、如权利要求23或24所述的脂质体，其中，所述阳离子性脂质为选自N-[1-(2,3-二油酰丙基)]-N,N，N-三甲基氯化铵、N-[1_(2,3-二油酰丙基)]-N,N-二甲基胺、N-[1-(2,3-二油基氧基丙基)]-N，N,N-三曱基氯化铵、N-[1-(2,3-双十四烷氧基丙基)]-N,N-二曱基-N-羟乙基溴化铵及3(3_[N-(N，，N，-二曱基氨基乙基)氨基曱酰基]胆固醇中的一种以上脂质。26、如权利要求2025中任一项所述的脂质体，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃"f汙生物为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。27、如权利要求2026中任一项所述的脂质体，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。28、如权利要求20~27中任一项所述的脂质体，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。29、如权利要求20~28中任一项所述的脂质体，其中，所述耙基因是与肿瘤或炎症相关的基因。30、如权利要求20~28中任一项所述的脂质体，其中，所述靶基因是与血管新生相关的基因。31、如权利要求2028中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA为KLF5mRNA。32、如权利要求20~28中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA是人或小鼠的KLF5mRNA。33、如权利要求31或32所述的脂质体，其中，所述RNA是由KLF5mRNA的连续15~30个碱基的序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条链的3'端以相同或不同的方式附加总计16个的l种或多种核苦酸。34、如权利要求31或32所述的脂质体，其中，所述RNA具有发夹结构，是由KLF5mRNA的连续1530个石威基的序列构成的RNA和由与该序列互补的序列构成的RNA通过间隔寡核香酸连接而成的RNA,在3'端附加总计16个的1种或多种核苷酸。35、如权利要求31或32所述的脂质体，其中，所述RNA是选自以下(a)(c)的RNA,(a)由序列号216中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双链RNA,并在每条链的3'端以相同或不同的方式附加总计24个的尿苷酸及脱氧胸苷酸中的任1种或2种；(b)由序列号2~16中的任一个序列构成的RNA及由与该序列互补的序列构成的RNA通过5'端具有2个尿苷酸或脱氧胸苦酸的间隔寡核苷酸连接而形成的RNA,具有发夹结构，并在3'端附加总计2~4个的尿苷酸及脱氧胸苷酸中的任1种或2种；(c)由序列号211中任一个序列的链及与该序列互补的序列的链构成的双4连RNA,并在每条链的3'端附加2个尿苷酸。36、如权利要求2028中任一项所述的脂质体，其中，所述mRNA为bcl2mRNA。37、一种组合物，所述组合物含有权利要求2036中任一项所述的脂质体。全文摘要本发明的目的在于提供用于抑制靶基因表达的组合物等，所述组合物等含有包封RNA的脂质体，所述脂质体由以前导粒子和RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂质膜构成，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列及与该序列互补的序列，所述脂质体中存在含有可以溶解该脂质膜构成成分的极性有机溶剂的液体，其中，所述液体以该脂质膜的构成成分可以分散、该复合粒子也可以分散的浓度含有该极性有机溶剂。文档编号A61K9/127GK101111269SQ20058004736公开日2008年1月23日申请日期2005年10月24日优先权日2005年1月28日发明者八木信宏,加藤泰己,山内雅博,石原淳,鸟取恒彰申请人:协和发酵工业株式会社