本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体及其制备方法与应用。
背景技术：
在糖尿病的所有并发症中，糖尿病视网膜病变平均患病率高达50％。当糖尿病影响视网膜后即并发糖尿病性视网膜病，其中糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema，dme)则是糖尿病患者视力下降的首要原因，病程晚期可因牵引性视网膜全脱离导致患者完全失明。基因治疗成为目前较具潜力的dme的治疗对策，尤其是核糖核酸干扰技术，不但为研究生物体的基因表达和调控等功能提供了新方法，同时也为dme的研究、预防与治疗开辟了新途径。在基因治疗方面，rnai(rna干扰)是沉默特定基因的强有力工具，被广泛应用于各个研究领域。在dme的治疗研究方面，以vegf(血管内皮生长因子)及其受体vegfr为靶基因，对体外合成的sirna或dsrna进行导入，结果显示相应的sirna可明显降低vegf或vegfr的表达，有效减轻vegf对dme形成的诱导作用，抑制眼部dme形成，从而治疗dme。相比较传统的药物治疗模式，基因治疗具有不可比拟的优势：(1)通过基因递送技术可以利用载体的特性定向转染靶细胞；(2)基因治疗表达的产物均为内源性蛋白，其安全性和机体的耐受性相对外源性药物要好；(3)可在局部长时间稳定的表达抗血管生成目的因子，避免了反复局部注射可能导致的并发症[1-4]。
基因治疗的关键技术之一是选择安全高效的基因载体。基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒类基因载体是将病毒中的致病基因以治疗基因替代，由于控制病毒进入细胞、胞内运输以及编码进入细胞核部分的基因还在病毒载体上，所以病毒载体的优点是靶基因表达效率高，但同时也有免疫原性、可能激活原癌基因引发肿瘤及难以大量制备等缺点，从而限制了病毒载体的临床应用。非病毒基因载体的优势在于免疫原性弱，制备方便，对基因材料的要求限制少。目前非病毒基因递送载体多使用脂质体、聚乙烯亚胺(pei)、树枝状聚酰胺—胺(pamam)等，普遍存在载体毒性大、难降解或降解产物毒性大等缺点。制备一类安全高效且可降解代谢的基因递送载体，是基因治疗领域亟待解决的重要课题[5-7]。
超支化聚合物是一类高度支化的具有三维球状或类球状结构的大分子，这类大分子具有许多独特的优点：分子链间无缠结、良好的溶解性能、内部空腔大、大量活性反应基团[8]。基于超支化聚合物的结构优点，将其应用于基因载体领域有突出优越性：超支化聚合物阳离子在表面及内部均含有大量的各级胺，加上其三维的立体结构和良好的分子韧性使得其作为基因载体可以与dna或sirna形成结构紧密的球形，转染效率大大提高。如近期报道的树枝状聚赖氨酸改性两亲性的超支化聚缩水甘油醚衍生物用于药物和基因共传递治疗肿瘤的研究[9]和氧化还原响应性超支化聚酰胺胺衍生物用于肿瘤的基因治疗研究等，均取得了良好治疗效果，但从目前报道来看，超支化聚阳离子载体所选合成单体多为人体外源分子，其安全性和细胞毒性都需进一步改善，并且其降解产物的安全性还有待长期考察。
精胺是人体精子内专职凝聚基因的多氨基分子；近年来，以精胺作为骨架构建单元的线性聚精胺阳离子载体(精胺作为骨架的聚氨基酸酯[10]、聚(二硫胺)[11]、spe-alt-peg聚精胺[12])都显示出了高于pei数个数量级的基因转染活性和低于pei十几个数量级的细胞毒性[13]。
如何得到具有生物相容性好，可生物降解以及无毒性代谢的超支化基因载体已成为当前生物医学工程材料领域亟待解决的重要课题。迄今为止，将超支化结构与内源性单体相结合，构建内源性超支化阳离子基因载体及其应用尚未报道。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。
本发明的再一目的在于提供所述内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将内源性单体溶于有机溶剂中，在无水无氧条件下加入保护剂，然后在20～30℃条件下搅拌反应，得到被保护的内源性单体i；
(2)将步骤(1)中得到的内源性单体i溶于水中，再加入可生物降解连接剂，在60～80℃条件下进行加成反应，待反应结束后加入乙醚使产物沉淀，得到聚合物ii；
(3)向步骤(2)得到的聚合物ii中加入脱保护剂，然后在30～50℃条件下搅拌反应，待反应结束后过滤，冷冻干燥，得到内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。
步骤(1)中所述的内源性单体为精胺、亚精胺和精氨酸中的至少一种。
步骤(1)中所述的有机溶剂为氯仿；优选为无水氯仿。
步骤(1)中所述的保护剂为三氟乙酸和2-乙酰-5，5-二甲基-1，3-环己胺二酮中的至少一种。
步骤(1)中所述的内源性单体与保护剂的摩尔比为1:2～4。
步骤(1)中所述的搅拌反应的条件为：300～700rpm搅拌24～36h；优选为：在25℃条件下、500～600rpm搅拌24h。
步骤(2)中所述的可生物降解连接剂为含酯键的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和三羟乙基丁烷三丙烯酸酯中的至少一种。
步骤(2)中所述的内源性单体i与可生物降解连接剂的摩尔比为3～5:1。
步骤(2)中所述的加成反应的条件为：400～700rpm搅拌5～7d(天)；优选为：500～600rpm搅拌6～6.5d(天)。
步骤(2)中所述的加成反应的温度优选为65℃。
步骤(3)中所述的脱保护剂为三乙胺、氨水、咪唑、n-甲基吡咯烷酮和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中的至少一种；优选为咪唑、n-甲基吡咯烷酮和dmf混合得到的脱保护液。
所述的咪唑的用量优选为按每克(g)咪唑配比5ml脱保护液计算。
所述的n-甲基吡咯烷酮和dmf的体积比优选为4:1。
步骤(3)中所述的脱保护剂的用量优选为按每毫升(ml)脱保护剂配比0.6mg聚合物ii计算。
步骤(3)中所述的搅拌反应的条件为：300～700rpm搅拌4～6h；优选为：500～600rpm搅拌4～5h。
步骤(3)中所述的搅拌反应的温度优选为40℃。
步骤(3)中所述的过滤为采用截留分子量为30000～60000的超滤管进行过滤，其离心速率为4000～6000rpm；优选为采用截留分子量为40000～60000的超滤管进行过滤，其离心速率为4000～5000rpm；
一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体在制备用于治疗dme(糖尿病性黄斑水肿)的纳米复合粒子中的应用。
一种用于治疗dme的纳米复合粒子，为将上述内源性超支化聚精胺阳离子基因载体与核酸药物混合均匀后，于室温下孵育20～30分钟获得。
所述的核酸药物为dna疫苗、dna、sirna和microrna中的至少一种。
所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体与核酸药物的质量比为1:1～30。
所述的用于治疗dme的纳米复合粒子(内源性超支化阳离子与核酸药物复合物)的粒径为100～300纳米。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以内源性单体为基本结构单元，先将其用保护剂保护，再与可生物降解连接剂进行迈克尔加成反应，再脱保护，最后超滤除杂，冷冻干燥，制备得到获得一种产物收率高，结构易控的内源性超支化阳离子基因载体。
(2)本发明将迈克尔加成合成内源性超支化基因载体通过与核酸药物的静电作用，制备得到治疗dme的纳米复合粒子，属于首次合成内源性超支化阳离子基因载体。
(3)本发明的基因载体能够凝聚、输送核酸药物，较高质量比复合后的粒径在100纳米左右，可通过质子海绵效应将治疗基因释放，从而达到治疗效果。
(4)本发明将内源性单体与超支化结构相结合，兼具可生物降解和无毒性代谢(在细胞毒性实验中没有表现出毒性)，构建内源性超支化基因载体，有望实现安全高效的基因治疗。
(5)本发明的基因载体自身可在体内完成无毒性代谢，因此可通静脉注射用于多种疾病的基因治疗。
(6)本发明材料成分简单、原料易得、生物相容性好为其在制备生物医药工程材料的应用提供支持，有望在生物医学工程材料领域得到广泛应用。
附图说明
图1是超支化聚精胺的合成路线图。
图2是实施例2中超支化聚精胺的核磁氢谱图。
图3是实施例4中超支化聚精胺与pdna复合物的粒径图。
图4是实施例4中超支化聚精胺与pdna复合物的电位图。
图5是实施例6中超支化聚精胺与pdna复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图6是实施例8中超支化聚精胺对视网膜内皮细胞毒性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：超支化聚精胺阳离子的制备
(1)称取2mg精胺溶于5ml无水氯仿中，在无水无氧条件下利用2-乙酰-5，5-二甲基-1，3-环己胺二酮(dde-oh)(5.4mg)对其两个伯胺基团进行保护。在转速为600rpm、温度为25℃的条件下反应24小时。待反应结束后除杂得到被保护的精胺单体；其中，精胺与dde-oh的摩尔比为1:3。
(2)称取(5mg)被保护的精胺单体溶于10ml水中，加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(0.96mg)，在转速为600rpm、温度为65℃的条件下搅拌反应6天。反应结束后通过加入无水乙醚使聚合物沉淀；再向沉淀的聚合物加入10ml脱保护液(2.01g的咪唑，8ml的n-甲基吡咯烷酮，2ml的dmf)搅拌反应4小时(40℃、600rpm)；反应后将产物超滤洗涤四次，再在转速4000rpm下通过截留分子量40000的超滤管除去未反应的精胺单体和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。冷冻干燥，得到超支化聚精胺；其中，被保护的精胺单体与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的摩尔比为3:1。
实施例2：超支化聚精胺阳离子的氢谱核磁表征
将实施例1得到的超支化聚精胺阳离子溶解于氘代水进行氢谱核磁表征。如图2，超支化聚精胺阳离子中的氢原子的化学位移已经被标注出来，图2结果证明该步反应成功的合成了超支化聚精胺阳离子。
实施例3：超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的制备
(1)称取实施例1中制得的超支化聚精胺阳离子溶于水中，得到超支化聚精胺阳离子溶液；
(2)将pdna(dna，苏州吉玛制药技术有限公司)配置成1mg/ml的备用液；
(3)制备超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物：按照设定的一系列质量比(1，5，10，15，20，30)，将超支化聚精胺阳离子溶液稀释1mg/ml，每个试管中加入1，5，10，15，20，30ml的聚精胺阳离子溶液，再快速加入1ml的pdna备用液，25℃下孵育30分钟，得到一系类表面电荷性质不同的纳米复合物。
实施例4：超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的粒径和zeta电位的测试
按照实施例3的超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的制备方法来配制不同质量比的纳米颗粒复合物溶液，所需超支化聚精胺阳离子与pdna的质量比分别为5，7，10，15，20，30。样品量为1ml。在室温条件下，首先预热纳米激光粒度仪20分钟，再吸取lml纳米颗粒溶液加入微量样品池，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为超纯水。对于纳米颗粒的粒径分布测试，每个样品测试3次，每次运行时间为2分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性。对于纳米颗粒的zeta电位测试，每个样品测试3次，每次自动运行12次，记录每个样品zeta电位的平均值及其迁移率。
结果：超支化聚精胺与pdna复合物的粒径分布如图3所示，zeta电位测试结果如图4所示，从图中可以看出质量比大于15的超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的粒径稳定在100～300纳米，纳米颗粒的zeta电位分布在20～30mv。
实施例5：超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的透射电镜观察
按照实施例3的超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的制备方法来配制质量比为30的纳米颗粒。先吸取10μl纳米颗粒溶液缓慢滴于400目的铜网上，晾干后使用透射电子显微镜来观察样品的形貌(方便直观地展示纳米颗粒的粒径)。实验结果与动态光散射测量的粒径结果相符。
实施例6：不同质量比的超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳
称取1g琼脂糖，加入到100ml1×tae缓冲液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至50～60℃时，加入溴化乙锭(eb)溶液，轻轻摇晃，混匀。待凝胶液冷至50℃左右时，倒入凝胶槽，凝胶厚度一般为5～8mm。在凝胶槽中放入梳子，待凝胶成形后，小心拔出梳子小心取出凝胶，放入盛有电泳缓冲液的电泳槽中。使电泳缓冲液液面高出凝胶2～3mm，等待上样。参照实施例3的方法，制备不同质量比的超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物，质量比分别为1，3，5，10，20，30，50。用移液枪取5μl待测样品，与上样缓冲液混合均匀，小心地加入到凝胶上样孔中。打开电泳仪，电压100v，电泳30min。电泳完成后，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果。
结果分析：图5电泳图表明当超支化聚精胺阳离子与pdna的质量比为5时，pdna分子在电场中的泳动受到部分阻滞，随着超支化聚精胺阳离子与pdna质量比的逐渐增加，当超支化聚精胺阳离子与pdna的质量比达到于20～30之间时，超支化聚精胺阳离子完全阻滞了pdna的迁移，甚至在更大的质量比条件下超支化聚精胺阳离子能够更加充分的包裹pdna，电泳图里完全观察不到pdna的移动，实验证明了超支化聚精胺阳离子具有比较理想的凝聚质粒pdna形成复合物颗粒的能力，从而发挥保护pdna的作用，以避免其在细胞吞噬前被降解。
实施例7：超支化聚精胺阳离子的降解和代谢过程
称取2mg的超支化聚精胺阳离子溶于10ml的pbs缓冲溶液(ph＝7.4)，每隔2天取一次样，连续取20天。所取样品放入-20℃的冰箱中保存，样品收集齐后采用凝胶渗透色谱(gpc)测定各个样品的分子量，以时间为横坐标，以重均分子量为纵坐标，绘制聚合物的降解曲线，研究其降解性。测试超支化聚精胺阳离子的降解能力。
实验结果：随着时间的增加，超支化聚精胺的分子量明显减小。在第10天时，其分子量只最初的40％。在第20天时其分子量只有最初的15％。实验结果表明超支化聚精胺有良好的生物降解性。
实施例8：超支化聚精胺阳离子的细胞毒性测定
采用cck-8法测定超支化聚精胺阳离子的细胞毒性。经过滤灭菌后将实施例1制备得到的超支化聚精胺阳离子和对比样品分子量25000的pei(聚醚酰亚胺)，用dmem培养基按照一定的浓度梯度(0.1、1、5、10、50、100μg/ml)稀释后，加入到融合度达80％的人视网膜内皮细胞(人视网膜内皮细胞，上海和序生物科技有限公司)中共同培养，每孔加入超支化聚精胺阳离子溶液的体积是100μl，每个浓度3个复孔。24小时后，采用cck-8法测定材料的细胞毒性。
超支化聚精胺的细胞毒性测试结果如图6所示。在超支化聚精胺达到100μg/ml时，细胞仍保持了80％以上的存活率；而对比pei则表现出明显的细胞毒性，细胞存活率有明显的浓度依赖关系。可以得出以下结论：超支化聚精胺在工作浓度范围内对人视网膜内皮细胞没有毒性，有良好的生物相容性。
实施例9：超支化聚精胺阳离子与pdna纳米复合物的细胞转染
选取对数期生长的人视网膜内皮细胞作为受体细胞，调整细胞浓度以每孔105个接种于24孔细胞培养板中，在37℃、5％co2条件下培养至细胞融合度为70％。接着换opti-mem无血清细胞培养基孵育2小时，同时将超支化聚精胺阳离子与pdna复合物的无血清培养液添加到培养皿中，确保每孔中dna的含量为1μg；超支化聚精胺阳离子与pdna纳米的质量比分别为5，10，20，30，50。以pei-25k/dna复合物作为阳性对照组，裸pdna作为阴性对照组。然后将24孔板置于培养箱中，在37℃、5％co2的环境下培养4小时后，将培养液换掉，加入含血清的培养液继续培养24小时。在荧光显微镜下定性研究绿色荧光蛋白的表达情况。然后吸出培养液，加入胰酶消化细胞并加入培养基终止胰酶作用，细胞样品经离心后重新悬浮于pbs中，采用流式细胞仪定量分析细胞转染个数，即样品的基因转染效率。
实验结果：随着质量比的增加，转染效率呈上升趋势。并且在质量比为30时，其转染效率比阳性对照(40％)还要高出5％。但在质量比为50时，转染效率略微有所下降。我们认为时由于载体过于紧密地包裹住pdna使其难以释放，因而转染效率降低。
实施例10：超支化聚精胺阳离子基因载体运输vegf-sirna对人视网膜内皮细胞中vegf蛋白的影响
选择vegf-sirna(苏州吉玛基因)作为核酸药物。将人视网膜内皮细胞与质量比为30的超支化聚精胺阳离子与vegf-sirna纳米复合物共培养24小时。之后将细胞用pbs洗涤三次，用sds裂解缓冲液在冰上裂解30分钟使细胞裂解充分，然后通过在4℃下13000rpm离心15分钟，收集上清液。使用bio-rad蛋白质测定法，测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。然后在300ma下将蛋白转移到pvdf膜，用5％脱脂牛奶将膜封闭1小时。之后将膜与vegf抗体一起在4℃下孵育过夜。然后将膜与二抗在25℃下孵育1小时，用tbst溶液洗涤三次。之后，使用化学发光显影仪检测样品，gapdh蛋白作为对照。实验结果表明，载有vegf-sirna的超支化聚精胺阳离子基因载体能很好地下调vegf蛋白的表达。这证明仿生纳米红细胞基因载体能安全高效地将治疗基因运输到病灶处。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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