本发明涉及一种木聚糖酶表达、纯化方法，属于基因工程、蛋白质工程技术领域。
背景技术：
木聚糖是半纤维素的骨架成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多聚糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。木聚糖的降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成，其中木聚糖酶是最关键的水解酶。本发明中使用的是里氏木霉分泌的第11家族β-D-1，4-内切木聚糖酶。木聚糖酶在造纸、生物能源、食品、饲料工业等行业中具有广阔的应用前景。
迄今为止发现的大多数木聚糖酶的表达要在LB培养基中，LB培养基的原料的价格较高，造成木聚糖酶表达成本较高。并且目前的木聚糖酶的纯化方法复杂，纯化时间长，还存在木聚糖酶得率低，纯度低等问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种可以有效地降低木聚糖酶的生产成本，缩短木聚糖酶纯化时间，有利于木聚糖酶在科研和工业领域的进一步发展的木聚糖酶表达、纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S01，表达步骤：含有目的基因的大肠杆菌在基本培养基中生长，使目的蛋白大量表达；
S02，纯化步骤：含有目的蛋白的融合蛋白通过两步镍亲和层析和酶切，得到高纯度木聚糖酶。
所述基本培养基包括碳源、氮源、水、无机盐和微量元素。
所述目的蛋白的前段含有6×His标签和促溶蛋白NusA。
大肠杆菌中目的蛋白的大量表达，需要加入异丙基-β-D-硫代半乳糖进行诱导表达。
所述诱导表达的时间是12～16h，温度是20～22℃。
纯化步骤的具体操作为：
步骤一：第一次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：柱平衡、上样、清洗、低浓度咪唑清洗液梯度洗脱、高浓度咪唑清洗液洗脱，第一次镍亲和层析柱与融合蛋白中的6×His标签之间具有特异性的吸附作用，吸附后高浓度咪唑与6×His标签竞争吸附，从而将融合蛋白洗脱下来；
步骤二：酶切步骤：在步骤一洗脱下来的融合蛋白溶液中加入TEV酶，TEV酶可将融合蛋白中的6×His标签和促溶蛋白NusA切割下来，使木聚糖酶呈游离状态；然后透析以降低溶液中咪唑的浓度；
步骤三：第二次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：柱平衡、上样、清洗、高浓度咪唑清洗液洗脱，上样溶液为酶切并透析后的溶液；收集上样流出液和清洗液，得木聚糖酶溶液；高浓度咪唑将吸附在镍亲和层析柱上的含有6×His标签和促溶蛋白NusA的蛋白清洗下来。
所述镍亲和层析柱的工作酸碱度是pH8.0～8.5。
低浓度咪唑清洗液梯度洗脱中的咪唑浓度为20～50mM；高浓度咪唑清洗液的浓度为1～1.2M。
第一次镍亲和层析柱纯化步骤中的柱平衡步骤的溶液为第一平衡液，第一平衡液的配制方法为：25-50mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0-8.5)、400-500mM氯化钠、5-10％甘油、10-20mM咪唑。第一平衡液体积为柱体积的10倍，即50-100毫升。
第一次镍亲和层析柱纯化步骤中的洗脱液配制方法为：25-50mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0-8.5)、400-500mM氯化钠、5-10％甘油、500-800mM咪唑，体积为50毫升。
第二次镍亲和层析柱纯化步骤中的柱平衡步骤和清洗步骤的溶液均为第二平衡液，第二平衡液的配制方法为：25-50mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0-8.5)、400-500mM氯化钠、5-10％甘油、10-20mM咪唑。第二平衡液体积为柱体积的10倍，即50-100毫升。
本发明通过基因改造，在木聚糖酶的前段加上6×His标签和促溶蛋白，构建重组质粒，导入大肠杆菌中，接种于基本培养基，加入诱导剂IPTG诱导表达，细胞破碎获得含有目的蛋白的融合蛋白，通过两次镍亲和层析柱，最终获得纯度达96％以上的木聚糖酶。
本发明的方法使用基本培养基代替LB培养基表达蛋白质，基本培养基只包含微生物生长所需的有机盐、营养物质以及微量元素。
本发明使用的基本培养基中的基本营养物质以及微量元素可以用价格便宜的有机盐试剂来配置，而且用量较少，因此可大幅度降低木聚糖酶的表达成本。
大肠杆菌在基本培养基中生长OD值达到0.6左右时加入诱导剂为最佳。
诱导表达的条件为，20～22℃诱导表达12～16小时。
本发明使用高压细胞破碎仪破碎细胞释放胞内蛋白，破碎压力为600～1000Pa。
本发明提供的木聚糖酶纯化方法包括两次镍亲和层析纯化。
第一次镍亲和层析纯化，包括柱平衡、上样、清洗、梯度洗脱、高浓度咪唑清洗五个步骤。第一次镍亲和层析能将含有6×His标签的融合蛋白吸附在柱子上，而其他杂蛋白可以通过清洗以及梯度洗脱去除。在梯度洗脱过程中，合适浓度的咪唑会与6×His标签竞争与镍亲和层析柱的吸附，从而将目的蛋白从柱子上洗脱下来。
第二次镍亲和层析，包括平衡、上样、清洗、高浓度咪唑清洗四个步骤。第二次过柱之前必须用烟草蚀纹病毒水解酶(Tobacco Etch Virus Protease，TEV protease)将6×His标签和促溶蛋白从融合蛋白中水解分开。在上样过程中，木聚糖酶不再含有His标签，因此不会与亲和柱结合而流出，并被收集。带6×His标签的促溶蛋白则会结合在柱子上，可以被高浓度的咪唑洗脱去除。
本发明提供的纯化方式，第一次过柱与第二次过柱之间需要经过一晚上的酶切和透析。该过程有两个目的：(1)换缓冲液，第一次过柱洗脱出来的目的蛋白含有高浓度的咪唑会影响第二次过柱时6×His标签与镍亲和层析柱的结合。因此透析过程中可以大幅度降低咪唑的浓度。(2)将目的蛋白与6×His标签和促溶蛋白酶切分离，因此在此过程中需要加入TEV水解酶。
上述TEV酶能特异性的切割连接木聚糖酶与融合蛋白之间的特定氨基酸序列。
本发明提供的镍亲和层析柱，每10mL容积可吸附目的蛋白15mg。
本发明提供的镍亲和层析柱随着使用次数的增多，会出现吸附效率降低的现象。此现象可以通过镍亲和层析柱的重生来解决。
纯化过程中严禁空气进入柱子，否则会极大的降低柱子的吸附效率，影响紫外吸收曲线的走向。
本发明提供的镍亲和柱的工作环境为碱性环境，在PH8～8.5之间吸附效果最好。
本发明所有流过柱子的溶液都要用0.45μm的滤头过滤除去溶液中的颗粒杂质。
本发明具有如下有益效果：本发明利用基本培养基表达木聚糖酶，只需提供大肠杆菌生长所需的基本营养物质以及微量元素，大幅度降低了表达成本。本发明用两次镍亲和层析柱纯化代替以前的离子交换和分子筛层析等纯化方式，可有效地缩短纯化时间(1天)，并且采用本发明的木聚糖酶的纯化方法所得木聚糖酶得率高，纯度高，木聚糖酶的纯度大于96％。
附图说明
图1为本发明的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一、实验材料和试剂
重组质粒：重组质粒(含有卡那霉素抗性)，购自苏州金唯智公司。
感受态细胞：受体细胞为大肠杆菌Rosetta细胞株。
TEV水解酶：本实验室纯化。
1升基本培养基：7克硫酸铵、5.25克磷酸氢二钠、1.6克磷酸二氢钾、0.5克柠檬酸铵、3.9毫升甘油、0.12克硫酸镁、1毫升微量元素溶液，溶解后用蒸馏水定容和高温灭菌。
1升微量元素溶液：0.377克氯化钙、0.179克六水氯化钴、0.16克五水硫酸铜、16.7克六水氯化铁、0.114克一水硫酸锰、22.3克二水乙二胺四乙酸钠、0.18克七水硫酸锌，溶解后用蒸馏水定容和过滤。
100mL试剂溶液：1M Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)pH8.0、5M NaCl、50％甘油、1M MgCl2、0.1M PMSF(苯基甲基磺酰氟)、3M imidazole(咪唑)。
抗生素及诱导剂：50mg/mL卡那霉素、1M IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)。
所有培养基中均加入50微克/毫升浓度的卡那霉素防止杂菌生长。
二、木聚糖酶的表达
根据公共基因库中的序列，设计木聚糖酶的基因序列(含有编码6×His标签和促溶蛋白的序列)，将序列交给公司构造重组质粒。
制备感受态Rosetta细胞，将重组质粒导入并进行筛选培养。
将筛选好的细菌加入甘油在-80℃的冰箱中保藏(甘油的最终浓度为20％(v/v))。
从-80℃取出将保藏的甘油菌在25℃、200r/min过夜培养，获得少量活性菌液。
将过夜培养的菌液接种于基本培养基中进行大量培养：37℃、200r/min条件下培养，当OD值达到0.6～1.0之间时，降温至22℃，加入诱导剂IPTG，22℃、200r/min诱导表达12h。
三、木聚糖酶的纯化
50mL裂解液的配置：50mM Tris-base、400mM NaCl、5％甘油、0.1mM PMSF，pH8.0。
100mL第一次平衡镍亲和层析柱：50mM Tris-base、400mM NaCl、5％甘油、10mM imidazole，pH8.0。
50mL第一次清洗镍亲和层析柱：50mM Tris-base、400mM NaCl、5％甘油、20mM imidazole，pH8.0。
50mL第一次洗脱镍亲和层析柱：50mM Tris-base、400mM NacL、5％甘油、500mM imidazole，pH8.0。
1000mL透析液的配制：50mM Tris-base、400mM NaCl，5％甘油，pH8.0。
50mL第二次平衡镍亲和层析柱：50mM Tris-base、400mM NaCl、5％甘油、10mM咪唑，pH8.0。第二次平衡的时候所用溶液和第一次平衡时是一样的，在这样低浓度的咪唑条件下，木聚糖酶不会和亲和柱产生非特异性的吸附从而造成损失。留在亲和柱上的标签和NusA蛋白质可以在下一步骤中用含高浓度咪唑的洗脱液去除，并循环使用亲和柱，该步骤中所用的洗脱液和第一步所用的清洗液的成分也是一样的。
50mL高浓度咪唑清洗液的配制：50mM Tris-base、400mM NaCl、1M imidazole，pH8.0。
收集细胞：将诱导表达完毕的菌液在4℃，6500rpm冷冻离心20分钟，弃上清，收集沉淀、称重。
细胞破碎：细胞质量与裂解液体积按1g∶1mL比例混合、溶解。用高压细胞破碎仪600～1000bar进行细胞破碎。破碎完毕后立即在4℃，16000rpm离心1小时，收集上清液，并上样。
第一次亲和层析：包括平衡、上样、清洗、梯度洗脱、高浓度咪唑洗脱五个步骤。
平衡：用平衡液平衡5个柱体积，流速为2mL/min。
上样：将离心得到的上清液过镍亲和层析柱，流速为1mL/min，目的蛋白吸附到柱上，其他杂蛋白流出。
清洗：清洗10个柱体积，流速为2mL/min，进一步洗出杂蛋白。
梯度洗脱：用含不同浓度的咪唑梯度洗脱(咪唑的浓度梯度为2～500mM)，流速为2mL/min，收集洗脱下来的目的蛋白。
高浓度的咪唑清洗：用5个柱体积的1M咪唑清洗液将镍亲和层析柱上的所有蛋白质清洗下来，流速为2mL/min。
透析：目的蛋白溶液加入TEV酶，TEV酶能特异性的切割木聚糖酶与促溶蛋白之间的氨基酸序列；每10mL目的蛋白溶液用1L透析液进行透析，可以降低溶液中咪唑的浓度，方便下一步纯化。
第二次镍亲和层析：包括平衡、上样、清洗、高浓度咪唑洗脱四个步骤。第二次与第一次过柱不同之处在于：第一次过柱将目的蛋白吸附在亲和层析柱上，从而将目的蛋白与杂蛋白分离；第二次过亲和层析柱时，缺乏亲和标签的木聚糖酶流出，带6×His标签的促溶蛋白则吸附在亲和层析上，可以通过高浓度咪唑溶液清除。
平衡：用第二次过Ni柱平衡液平衡5个柱体积，流速为2mL/min。
上样：收集透析12h的目的蛋白溶液过Ni柱，流速为1mL/min，His标签和融合蛋白吸附到柱上，木聚糖酶溶液流出、收集。
清洗：上样后，用平衡液清洗亲和层析柱，使木聚糖酶溶液流出，平衡流速为1mL/min。
高浓度的咪唑洗脱：用高浓度的咪唑清洗液将亲和柱上的所有蛋白质清洗下来，洗脱液用量为5个柱体积，流速为2mL/min。
每次高浓度咪唑清洗完后，再用蒸馏水清洗3～5倍柱体积，有利于亲和柱的多次使用。
四、木聚糖酶的检测
如图1所示，用SDS-PAGE分析木聚糖酶纯度，图中标记1为过第一次镍亲和层析柱得到的融合蛋白经酶切后的溶液的SDS-PAGE图；标记2为经第二次镍亲和层析柱纯化收集的木聚糖酶溶液的SDS-PAGE图；本发明获得的木聚糖酶的纯度大于96％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于：
木聚糖酶的表达步骤中：将过夜培养的菌液接种于基本培养基中进行大量培养：37℃、200r/min条件下培养，当OD值达到0.6～1.0之间时，降温至20℃，加入诱导剂IPTG，20℃、200r/min诱导表达16h。
镍亲和层析柱的工作酸碱度是pH8.5，即将实施例1中的pH8.0的溶液均配制成pH8.5的溶液。
50mL第一次平衡镍亲和层析柱：25mM Tris-base、500mM NaCl、10％甘油、20mM imidazole，pH8.5。
50mL第一次清洗镍亲和层析柱：25mM Tris-base、500mM NaCl、10％甘油、20mM imidazole，pH8.5。
50mL第一次洗脱镍亲和层析柱：25mM Tris-base、500mM NacL、10％甘油、800mM imidazole，pH8.5。
100mL第二次平衡镍亲和层析柱：25mM Tris-base、500mM NaCl、10％甘油、20mM咪唑，pH8.5。
50mL高浓度咪唑清洗液的配制：25mM Tris-base、500mM NaCl、1.2M imidazole，pH8.5。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。