一种木聚糖酶表达、纯化方法与流程

文档序号:15469490发布日期:2018-09-18 19:57阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:包括以下步骤:

S01,表达步骤:含有目的基因的大肠杆菌在基本培养基中生长,使目的蛋白大量表达;

S02,纯化步骤:含有目的蛋白的融合蛋白通过两步镍亲和层析和酶切,得到高纯度木聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:所述基本培养基包括碳源、氮源、水、无机盐和微量元素。

3.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:所述目的蛋白的前段含有6×His标签和促溶蛋白NusA。

4.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:大肠杆菌中目的蛋白的大量表达,需要加入异丙基-β-D-硫代半乳糖进行诱导表达。

5.根据权利要求4所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:所述诱导表达的时间是12~16h,温度是20~22℃。

6.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:纯化步骤的具体操作为:

步骤一:第一次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤:柱平衡、上样、清洗、低浓度咪唑清洗液梯度洗脱、高浓度咪唑清洗液洗脱,第一次镍亲和层析柱与融合蛋白中的6×His标签之间具有特异性的吸附作用,吸附后高浓度咪唑与6×His标签竞争吸附,从而将融合蛋白洗脱下来;

步骤二:酶切步骤:在步骤一洗脱下来的融合蛋白溶液中加入TEV酶,TEV酶可将融合蛋白中的6×His标签和促溶蛋白NusA切割下来,使木聚糖酶呈游离状态;然后透析以降低溶液中咪唑的浓度;

步骤三:第二次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤:柱平衡、上样、清洗、高浓度咪唑清洗液洗脱,上样溶液为酶切并透析后的溶液;收集上样流出液和清洗液,得木聚糖酶溶液;高浓度咪唑将吸附在镍亲和层析柱上的含有6×His标签和促溶蛋白NusA的蛋白清洗下来。

7.根据权利要求1或6所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:所述镍亲和层析柱的工作酸碱度是pH8.0~8.5。

8.根据权利要求6所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法,其特征在于:低浓度咪唑清洗液梯度洗脱中的咪唑浓度为20~500mM;高浓度咪唑清洗液的浓度为1~1.2M。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1