本发明属于生物催化法制备手性化合物，特别涉及一种应用固定化南极酵母脂肪酶b立体选择性催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法。
背景技术：
2-(4-甲基苯基)丙酸（mppa）是合成具有抗炎和镇痛作用的洛索洛芬钠的关键中间体。洛索洛芬钠作为一种芳基丙酸类非甾体抗炎药(nsaid)，与临床上同类药物相比，其特点主要体现在：更强(临床效果好)、更快(口服30分钟血浆浓度即达峰值)、更安全(副作用小)；以及适应症广，临床上可广泛用于类风湿性关节炎、腰痛、肩周炎、颈肩腕综合症等的抗炎镇痛、手术、外伤后及拔牙后的镇痛消炎和急性上呼吸道炎症的解热镇痛等。据报道，洛索洛芬钠的单次剂量镇痛效果比布洛芬和酮洛芬强约10-20倍，由于在小剂量治疗疾病的过程中，功能强大，疗效显着，安全性强，在日本、美国、中国等国受到广泛应用并且销售量逐年上升。然而，这些手性药物大多是以外消旋体的形式出售，单一纯的对映异构体药物非常少。据文献报道，非甾体高效抗炎药一般是(s)型对映体具有抗炎活性，而(r)型对映体无药效或有毒副作用。为了减少给药量和对人体产生的毒副作用，有必要开发一种洛索洛芬单一对映体的制备方法，(s)-2-(4-甲基苯基)丙酸是合成(s)-洛索洛芬的重要中间体，故手性拆分2-(4-甲基苯基)丙酸具有重要意义。
目前，获得单一手性化合物的主要方法有化学合成法和外消旋体拆分法。相比于化学合成法，外消旋体拆分法具有拆分步骤简单、污染物少、纯度高、能耗低、产率高等优点，因此在工业应用中占据主导地位。常见的外消旋体拆分方法包括手性液-液萃取法、膜法、结晶法、色谱法以及酶或微生物法。其中，色谱法的拆分纯度高，但生产成本高，只适用于实验使用的小规模制备；手性液液萃取法容易实现连续生产、容易工业放大、操作简单、生产成本低、适用范围广等，目前在工业生产中受到广泛关注，但是在实际应用过程中存在手性萃取剂选择性低，产率较低的问题；膜法易于实现连续生产，但传质效率低、易污染、适用手性化合物分离的高选择性的膜材料较少。相比于上述拆分方法，酶催化反应不需要手性分离介质、手性试剂、手性溶剂等，可直接将化学合成的外消旋体转化为单一对映异构体。酶催化酯化拆分具有条件温和，选择性高，副反应少，杂质成分少，产率高，反应操作简单等优点，并且污染少，很大程度降低了化工生产对环境造成的影响，符合绿色化学理念，具有很好的发展前景。
本发明利用脂肪酶较高的催化活性和立体选择性，在有机溶剂体系中催化酯化外消旋体2-(4-甲基苯基)丙酸，制备高光学活性的(s)-2-(4-甲基苯基)丙酸。由于脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性，并且不同有机溶剂对酶的活性和立体选择性有影响，故本方法根据脂肪酶的催化活性和立体选择性，对其有机溶剂的种类进行了筛选。与水溶液体系比较，固定化酶与有机介质不相溶，易于回收和重复利用；可以更加方便从低沸点的有机溶剂中分离得到产物，显著降低生产成本。该技术解决了一般拆分技术所存在的低光学纯度和产率低的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。
技术实现要素：
本发明的目的主要是提出一种利用固定化南极假丝酵母脂肪酶b催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法。并针对脂肪酶在水相介质中热稳定性和立体选择性低，导致转化率较低的问题，通过改用有机介质体系，提高脂肪酶热稳定性和催化活性，从而提高转化率和光学活性。
本发明的技术方案：本发明以有机溶剂作为反应介质，以外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸和醇作为反应底物，将其底物溶解在有机溶剂中，2-(4-甲基苯基)丙酸对映体浓度为200-2000mmol/l，醇浓度为600-1000mmol/l；加入一定量的脂肪酶作为生物催化剂，脂肪酶的浓度为40-80mg/ml；在一定温度下，于25ml的封闭反应管体系中搅拌、加热反应一定时间，反应结束后，取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，并计算产物光学纯度和底物转化率。其反应方程式如式1：
式1脂肪酶催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体
其中，r表示r1=c2h5，r2=n-c4h9，r3=n-c5h11，r4=n-c6h13，r5=n-c7h15，r6=n-c8h13。
所述有机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、环己烷、异丙醚、甲基叔丁基醚。
所述脂肪酶选自褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶a、固定化南极假丝酵母脂肪酶b、荧光假单胞菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、固定化米曲霉、疏棉状嗜热胞菌脂肪酶、固定化米黑根毛脂肪酶。
所述醇选自乙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇的一种。
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用脂肪酶作为反应催化剂，可以提高底物立体选择性，减少副产物的生成，获得高产率和高纯度的(s)-2-(4-甲基苯基)丙酸。采用有机溶剂作为有机介质，可以改善脂肪酶的热稳定性和催化效率，从而提高产品的纯度和产率，并且脂肪酶不溶于有机溶剂，便于酶的回收和重复利用；有机溶剂沸点一般不是太高，可以方便分离产物，减少能耗。本发明采用固定化南极酵母脂肪酶b对2-(4-甲基苯基)丙酸对映体进行拆分，通过控制有机溶剂种类、醇种类、反应温度、对映体浓度、醇浓度、酶浓度、反应时间等条件，可提高(s)-2-(4-甲基苯基)丙酸的纯度和产率。本方法实施操作简便，绿色环保，易于分离产物，催化剂重复使用率高。
【具体实施方案】
本发明具体的方法步骤如下：
一、测试与分析
本发明所述实施例中产物的光学纯度和底物转化率采用美国waters1525高效液相色谱仪分析，inertsil®ods-3色谱(250mm×4.6mm，5μm)。流动相组成为v(甲醇)：v(水)=30：70，其中水相含0.5%（v）乙酸、25mmol/l的羟丙基-β-环糊精，ph=4.0（用三乙胺调节）。流速为0.8ml/min，uv检测波长为225nm，柱温为25.0℃，进样量10μl。
二、实施例
实施例1
将2.5mmol的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和2.5mmol正己醇加入至25ml容量瓶中，并加入正己烷定容。于25ml的反应管中，用移液管移取2ml反应液，并分别加入60mg不同商品化脂肪酶，在600rpm、50℃下加热反应5h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：利用固定化南极假丝酵母脂肪酶b作为催化剂时，优先识别(r)-2-(4-甲基苯基)丙酸，其底物转化率为47.79%，底物的光学纯度为27.24%。
实施例2
在25ml反应管中，加入0.1mmol2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.1mmol正己醇作为反应底物，1ml不同的有机溶剂作为反应介质，加入50mg固定化南极假丝酵母脂肪酶b，在600rpm、50℃条件下反应1h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：利用正己烷作为反应介质时，其底物转化率为53.79%，底物的光学纯度为30.91%。
实施例3
在25ml反应管中，加入0.1mmol2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.1mmol不同种类的醇作为反应底物，1ml正己烷作为反应介质，加入50mg固定化南极假丝酵母脂肪酶b，在600rpm、50℃条件下反应10min。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：利用正己醇作为酰基供体时,其底物转化率为5.93%，底物的光学纯度为3.38%。
实施例4
在25ml反应管中，加入0.6mmol2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.6mmol正己醇作为反应底物，1ml正己烷作为反应介质，加入50mg固定化南极假丝酵母脂肪酶b，在600rpm、50℃条件下反应2h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：底物转化率为24.00%，底物的光学纯度为14.50%。
实施例5
在25ml反应管中，加入0.6mmol2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.6mmol正己醇作为反应底物，1ml正己烷作为反应介质，加入50mg固定化南极假丝酵母脂肪酶b，在600rpm、80℃条件下反应2h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：底物转化率为75.26%，底物的光学纯度为95.62%。
实施例5
在25ml反应管中，加入0.6mmol2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.8mmol正己醇作为反应底物，1ml正己烷作为反应介质，加入50mg固定化南极假丝酵母脂肪酶b，在600rpm、80℃条件下反应4.5h。反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明：底物转化率为89.34%，底物的光学纯度为97.84%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。