本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种l7d8单克隆抗体及其应用。
背景技术：
xi型胶原蛋白是关节软骨中的含量较少的蛋白，根据胶原软骨的成熟程度，其含量可介于3-10％。而ii型胶原则是关节软骨中的主要成分，占总量的80-85％左右。xi型和ii型胶原分子都是三螺旋结构。不同的是，xi型胶原蛋白是由三条不同的α链[α1(xi),α2(xi),α3(xi)]组成，而ii型胶原是由三条相同的α链[α1(ii)]组成的。其中α3(xi)与α1(ii)是由同一个基因编码产生，具备相同的氨基酸序列，但α3(xi)具有更复杂的糖基化修饰。
胶原纤维网络赋予软骨组织锁住蛋白聚糖的能力，从而为组织提供拉伸张力，是正常软骨发育的必要条件。软骨特异性胶原纤维由xi型、ii型和ix型胶原微纤维混合构成，正常的软骨中含有两种不同粗细的胶原纤维——细胶原纤维和粗胶原纤维，它们的直径分别为20nm和40nm。研究表明，xi型胶原蛋白纤维只存在细胶原纤维中，细胶原纤维具备“4+10”模式，即2个xi型和2个ii型胶原微纤维组成纤维中心部分，再被10个ii型胶原微纤维围绕成的环形所包绕。xi胶原微纤维不仅对胶原基质稳定性有很重要的贡献作用，还具有介导正常的细胶原纤维形成的作用。有研究表明，编码α1(xi)链的基因缺陷小鼠(cho/cho小鼠)，以及编码α1(ii)、α1(xi)或α2(xi)链的基因缺陷人群(人stickler/marshall综合征)均无法形成正常的细胶原纤维，表现出软骨发育异常的现象。
目前只有cii、ci等胶原抗体(或产生针对cii/ci抗体的杂交瘤细胞)，如专利us9005912b2、ep3050899a1、us8394378b2，还未见有抗cxi的抗体公开。另外，xi型与ii型胶原的结构和序列有一定的相似性，极有可能针对xi型胶原蛋白的抗体也会对ii型胶原有一定的交叉反应，造成假阳性。现有技术中暂时还未发现有针对xi型胶原蛋白的单克隆抗体。因此，开发出一种能够特异性结合xi型胶原蛋白的l7d8单克隆抗体，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种l7d8单克隆抗体及其应用。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种l7d8单克隆抗体，所述抗体包括重链和轻链，所述重链由氨基酸序列seqidno.1构成，所述轻链由氨基酸序列seqidno.2构成。
其中，重链(igg)的氨基酸序列seqidno.1如下所示：
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轻链(kappa)的氨基酸序列seqidno.2如下所示：
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优选地，所述l7d8单克隆抗体特异性结合xi型胶原蛋白。
优选地，所述xi型胶原蛋白为天然xi型胶原蛋白。
优选地，所述l7d8单克隆抗体是小鼠抗体。
所述的l7d8单克隆抗体应用于检测xi型胶原蛋白，能够特异性结合xi型胶原蛋白，避免假阳性的现象出现，特异性高。
l7d8单克隆抗体应用于检测xi型胶原蛋白的检测方法是常规的，如通过elisa或westernblot方法来检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的l7d8单克隆抗体是针对xi型胶原蛋白有特异性的抗体，能够特异性地结合xi型胶原蛋白，从而可用于检测xi型胶原蛋白，特异性高。
本发明的l7d8单克隆抗体可以结合天然的xi型胶原蛋白，可以通过免疫组织化学、elisa和wb等方法，去检测生物样本中(组织切片、尿液、血液)的天然xi型胶原蛋白。
附图说明
图1是实施例2中l7d8单克隆抗体与天然或变性的rcii、rcxi、bcxi的结合情况示意图；
图2是实施例3中l7d8单克隆抗体在体内或体外与软骨组织结合的示意图；
其中，a为l7d8单克隆抗体在体内与软骨组织结合的示意图，b为l7d8单克隆抗体在体外与软骨组织结合的示意图，软骨表面的阳性染色用白色箭头指示；
图3是实施例4中cii免疫小鼠的血清抗体反应示意图；
图4是实施例4中cxi免疫小鼠的血清抗体反应示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不对本发明要求保护范围的构成限制。
实施例1：l7d8单克隆抗体的获得
l7d8单克隆抗体是基于peg方法的b细胞杂交瘤技术制得的，具体步骤如下：
(1)将100μgxi型胶原蛋白(cxi)与等体积的cfa混合成乳剂，第0天，在8-10周龄雄性dba/1j小鼠尾根部皮内注射进行免疫。
(2)第21天采血，用elisa方法检测小鼠体内的cxi抗体。抗体滴度高的小鼠在第21天接受加强免疫，即50μgcxi与等体积的ifa混合成乳剂，在小鼠尾根部进行皮内注射。加强免疫三天后取淋巴结做细胞融合。
(3)高压10gpeg-1500，用无任何添加的dmem培养基趁热配制40％peg溶液，加入两滴nahco3调节ph至7.4左右。
(4)提前一周复苏nso-bcl2骨髓瘤细胞系，确保细胞状态健康良好。吹下细胞，重悬于20ml含10％fcs的完全培养基中，进行细胞计数。
(5)在无菌状态下取小鼠淋巴结和胸腺，分别充分研磨，用75μm尼龙滤网去掉多余的脂肪组织和其他杂质，用20ml含10％fcs的完全培养基重悬淋巴细胞和胸腺细胞，分别进行细胞计数。
(6)按照1:2的比例混合nso-bcl2骨髓瘤细胞和淋巴细胞，37℃水浴半小时后，1000rpm离心5分钟，用无任何添加的dmem培养基清洗细胞两次，离心，用手指弹细胞沉淀，使细胞团块变得稍微松散。
(7)按照3×108混合细胞加1.5mlpeg溶液的比例，往混合细胞中缓慢加入合适的peg量。这个过程必须在37℃水浴中进行，大概1分钟加1mlpeg溶液，再在前面三分钟内加入3ml预热的dmem，最后缓慢加入余下的36mldmem，边加液体边轻轻晃动管子。
(8)1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用含10％fcs的完全培养基重悬融合细胞。取无菌96孔培养板，根据总细胞数计算所需的96孔板数量，每孔种1×105个融合细胞和0.5×105胸腺细胞，共100μl。将96孔培养板放入37℃，5％co2细胞培养箱进行培养。
(9)24小时后，用含10％fcs的完全培养基配制2×hat溶液，往96孔板中每孔加100μl。放回细胞培养箱，继续培养10-14天。
(10)培养10天后，拿出96孔板观察是否有细胞克隆产生，并防止克隆长得过大或培养基变黄。大概第14天，取细胞上清，用elisa检测特异性抗体的产生，elisa具体步骤见方法实施例2，标记抗体检测阳性并且存在细胞克隆的孔，取孔内细胞进行亚克隆。
(11)根据需要做亚克隆的孔的多少，准备足够量的96孔培养板。在96孔板中每孔加入100μl含有1×ht的10％fcs完全培养基。不断吹打需要做亚克隆的细胞孔，将细胞吹打下来并转移到新96孔板的a1孔中，从a到h往下进行5倍倍比稀释，再用排枪从第1列到第12列往右进行2倍倍比稀释。再往每孔中加入100μl含有1×ht的10％fcs完全培养基，并放回细胞培养箱，培养10-14天。
(12)亚克隆10-14天后，用elisa方法检测细胞的抗体表达情况，挑选既高效表达抗体、又仅有一个细胞克隆的孔，取孔内细胞进行第二次的亚克隆。整个杂交瘤构建过程必须重复5-6次亚克隆，直至获得稳定高效表达抗体的细胞株为止，即只要有细胞的孔，抗体表达均为阳性，且细胞越多，抗体表达量越大。注意第2次以后的亚克隆不再需要添加ht溶液，且由于细胞状态愈发良好，增殖迅速，后面的亚克隆时间可能会缩短至10天甚至更短，应经常查看细胞状态。
(13)获得稳定高效表达抗体的杂交瘤后，从96孔板逐渐缓慢地扩大细胞培养，用含有10％dmso的fcs冻存细胞。
(14)将细胞培养基中的血清从10％fcs缓慢转换到10％低igg的fbs中，在逐步从10％fbs降低血清含量到8％、6％，最后到4％fbs中并进行大量扩增和生产抗体。培养大约3-4周后，收集细胞上清，先用孔径为1f的过滤纸过滤细胞残片，加入0.02-0.05％叠氮钠，最后用0.2μm过滤器进行无菌抽滤，4℃保存上清。
(15)运用
(16)用lonza内毒素检测试剂盒检测抗体中的内毒素含量，超过1eu/mg浓度时，用pierce去内毒素填料纯化抗体溶液。确保抗体不含内毒素后，浓缩抗体至15mg/ml左右，测量准确浓度，4℃保存。或用冷冻干燥的方法，将抗体制成干粉，可在-20℃长期保存。
上述制得的抗体即为l7d8单克隆抗体，该抗体包括重链和轻链，其中，重链由氨基酸序列seqidno.1构成，轻链由氨基酸序列seqidno.2构成。l7d8单克隆抗体可以结合天然的xi型胶原蛋白，可以通过免疫组织化学、elisa和wb等方法，去检测生物样本中(组织切片、尿液、血液)的天然xi型胶原蛋白。
重链(igg)的氨基酸序列seqidno.1如下所示：
tatgaacctagccctgatttccccagccttcagttcccagattcagtgatcagccttgaacacagacctgtcaccatgaagttgtggctgaactggattttccttgtaacacttttaaatggtatccagtgtgaggtgaaactggtggagtctggaggaggcttggtacagcctgggggttctctgagactctcctgtgcaacttctgggttcaccttcactgattactacatgagctgggtccgccagcctccaggaaaggcacctgagtggttgggttttattagaaacaaagctaaaggttacacaacagagtatagtgcatctgtgaagggtcggttcaccatctccagagataattcccaaaacatcctctatcttcaaatgaacaccctgagagctgaggacagtgccacttattactgtgcaagagccctatcaactgggaaccccttctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacaacagccccatctgtctatccactggcccctg
轻链(kappa)的氨基酸序列seqidno.2如下所示：
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l7d8单克隆抗体还可以通过基因工程的方法获得。
实施例2：l7d8单克隆抗体的特异性检测
我们利用elisa方法来研究l7d8单克隆抗体与抗原的特异性结合，具体步骤如下：
(1)用5μg/ml的天然或变性rcxi，rcii，bcxi，包被于96孔elisa板，每孔50μl，用膜密封后，4℃过夜。
(2)取出elisa板，在室温放置一小时后，用pbst洗板3次。再用3％脱脂奶粉封闭elisa板，每孔100μl，室温封闭2小时。
(3)pbst洗板3次后，在a行加入50μl1μg/ml的纯化的l7d8单克隆抗体，或加入50μl1:1000稀释的小鼠血清样本，从a到g行往下进行5倍倍比稀释，保留h行作为空白对照，室温孵育2小时。
(4)pbst洗板3次后，加入1:4000稀释的羊抗鼠kappa链偶联辣根过氧化物酶二抗，每孔50μl，室温孵育1小时。
(5)pbst洗4次后，每孔加入50μlabts溶液，肉眼观察颜色反应，达到合适的颜色浓度时，按照每块板加显色液的先后顺序，在405nm波长下依次进行检测。
elisa检测结果显示：l7d8单克隆抗体能够以较强的亲和力结合天然的rcii、rcxi以及bcxi，但并不能与它们的变性蛋白结合，如图1所示。
实施例3：l7d8单克隆抗体在体内或体外对软骨的结合情况
抗体能对机体产生影响的前提是能在体内外结合自身组织，l7d8抗体在elisa实验中能胶原结合，为了检测它在体内外结合软骨组织的能力，我们用免疫组织化学技术来进行研究。
1、新生、成年小鼠体外组织染色
(1)无抗体注射3日龄新生小鼠的冷冻爪部组织切片，从-20℃冰箱取出后室温干燥5分钟，用含有0.1％tween20的pbst清洗3次，每次3分钟，在冰上用丙酮固定5分钟，pbst清洗3次，每次3分钟。记为切片a。
(2)按照标准的胶原诱导关节炎步骤。在8-10周龄成年dba/1j小鼠身上诱导关节炎后，取小鼠后爪制作石蜡切片。切片用蛋白酶k方法进行抗原修复，记为切片b。
(3)所有切片依次用3％h2o2封闭10分钟，5％bsa+2％大鼠血清封闭30分钟，链亲和素封闭15分钟，生物素封闭15分钟，所有封闭液用pbst配制，封闭步骤之间用pbst清洗3次，每次3分钟。
(4)用pbs稀释的5μg/ml生物素化抗体m2139，l7d8或pbs，加入切片a和b中，室温孵育40分钟，用pbst清洗3次，每次3分钟。
(5)用pbst1:2000稀释的亲和素偶联辣根过氧化酶溶液，加入所有切片中，室温孵育30分钟，pbst清洗3次，每次3分钟。
(6)用二氨基联苯胺试剂盒和超纯水配制显色液，显色3分钟。肉眼观察染色情况，及时用pbs清洗1次，缓速单蒸流动水泡洗5分钟，终止显色。注意回收保存剧毒二氨基联苯胺。
(7)htx浸泡90秒，缓速单蒸流动水泡洗5分钟，显微镜下检查染色情况，如果染色被冲洗消失，需要进行重新显色。
(8)95％乙醇浸泡1分钟，99％乙醇1分钟。
(9)二甲苯浸泡两次，每次5分钟。
(10)用水溶性封片剂封片，室温过夜干燥，拍照保存。
2、新生小鼠体内组织染色
(1)2日龄的bq.cia9i新生小鼠，腹腔注射100μg生物素化的m2139，l7d8或者100μlpbs，每组2-3只小鼠。注射小鼠时，应注意从靠近胸部的正中位置往下进针，避开脏器，小心插入腹腔并推入抗体溶液，留意拔针后有无漏液情况。抗体注射24小时后，取小鼠后爪制作冷冻切片。
(3)切片从-20℃冰箱取出后，室温干燥5分钟，用4％福尔马林固定5分钟后，用pbst清洗3次。
(4)所有切片运用1中步骤(3)进行封闭。
(5)所有切片运用1中步骤(5)进行亲和素偶联辣根过氧化酶溶液孵育
(6)所有切片运用1中步骤(6)进行二氨基联苯胺方法，显色8-9分钟。
(7)所有切片运用1中步骤(7、8、9、10)进行后续染色、脱水、透明和封片。
3、成年小鼠体内组织染色
(1)6周龄bq.cia9i小鼠，静脉注射1mg生物素化的m2139，l7d8抗体或者200μlpbs。24小时后取小鼠鼻部软骨组织，制作鼻部横切7μm厚度的冷冻切片。
(2)将切片从-20℃冰箱取出，在冰上用丙酮固定10分钟，干燥10分钟后，放入pbs中浸泡15分钟。
(3)样本用含有2％bsa的pbst封闭45分钟后，用pbst清洗3次，每次3分钟。
(4)用pbst1:300稀释链亲和素偶联alexafluor568，室温孵育60分钟，用pbst清洗3次，每次3分钟。
(5)用含有dapi的vectashield封片剂封片，室温干燥15-30分钟后，用confocal显微镜拍照保存。封片后的样本可在4℃冰箱避光保存1个月左右。
为了检验l7d8单克隆抗体能否在体内结合新生和成年小鼠的软骨组织，我们对m2319和l7d8抗体进行生物素化，并且将生物素化抗体注射到2日龄的新生或者6周龄的成年bq.cia9i小鼠体内。其中，生物素化的cii抗体m2139在此实验中被用作阳性对照抗体。抗体注射24小时后，取新生小鼠的爪部和成年小鼠的鼻部组织制作冷冻切片，用免疫组织化学技术分析抗体与软骨的体内结合能力(由于成年小鼠骨骼较硬，在不经脱钙的情况下，对足部组织进行冷冻切片的技术难度很大，很难得到完整的组织切片，于是改取小鼠鼻部软骨组织代替)。在新生小鼠软骨组织中，阳性对照m2139抗体可以结合到关节软骨表面，而l7d8抗体没有非常明确的阳性染色(如图2a，上所示)。在成年组织切片染色中，阳性对照m2139抗体可以结合到关节软骨区域，l7d8抗体则无法与成年软骨组织发生结合反应(如图2a，下所示)。
对于抗体在体外结合软骨能力的分析，我们取无抗体处理的新生小鼠、有或无关节炎侵犯的成年小鼠爪部组织，与生物素化的m2139或l7d8抗体进行共孵育，接着检测抗体与软骨组织的结合情况。无论是新生小鼠组织，还是有或无关节炎侵犯的成年小鼠关节组织，l7d8抗体无法与任意的这些组织发生反应(如图2b所示)。
实施例4：小鼠关节炎模型的血清cii和cxi抗体反应
为了探究cii和cxi诱导的小鼠关节炎中，血清抗体与关节炎发展的潜在联系，我们用cii或cxi对表达关节炎易感基因aq的dba/1j雄性小鼠进行免疫，并在免疫后的第21和70天采取血样。
我们观察到cii免疫的小鼠产生了严重的关节炎，且发病率很高；而cxi免疫的小鼠发病率低，且病情很轻(如表1所示)。针对cii和cxi的血清抗体反应同时存在于cii和cxi免疫小鼠的整个病程中，且随着病程推进，血清抗体反应不断增强。在免疫早期，cii免疫的小鼠体内针对cxi的抗体反应比cxi免疫的小鼠强(第21天：p值＝0.0009)，但免疫后期，cii和cx免疫小鼠的血清cxi抗体反应没有差异(第70天：p值＝0.1393)(如图3和图4所示)。在cii免疫的小鼠中，血清cii和cxi抗体反应与疾病严重程度不存在相关关系。
表1cii和cxi免疫小鼠的关节炎发病率和最大关节炎评分
cii:二型胶原；cxi:xi型胶原蛋白；cfa：完全弗氏佐剂；ifa：不完全弗氏佐剂
图3和图4是cii和cxi免疫小鼠的血清抗体反应示意图。cii和cxi免疫的dba/1j小鼠，在第21和70天采血，用酶联免疫吸附试验(elisa)检测血清抗体。未免疫的小鼠血清作为阴性对照。mann-whitneyu检验被用于组间抗体反应比较的统计分析。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110>东莞光极生物科技有限公司
<120>l7d8单克隆抗体及其应用
<130>1
<160>2
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