本发明涉及一种工程菌及其在生产l-酪氨酸中的应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
l-酪氨酸(p-hydroxyphenylalanine)是人体的必须氨基酸，在医药和食品方面具有重要的应用。目前l-酪氨酸的来提取法、酶法、基因工程菌发酵法等。从毛法等原料水解提取l-酪氨酸过程污染大且纯度较低。大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料重头合成l-酪氨酸的产率较低，目前无法与提取法及酶法竞争。以酪氨酸酚裂解酶酶法生产l-酪氨酸是最为广泛应用的方法。已有多种方案被设计(synthesisofl-tyrosineor3,4-dihydroxyphenyl-l-alaninefromdl-serineandphenolorpyrocathechol，agric.biol.chem.37(1973)493–499.中国专利201310168119.5)，其中以丙酮酸和苯酚为底物的转化方法已在工业上实施。丙酮酸是较为昂贵的一种中间体，因此专利201310289373.0采用未提纯的丙酮酸料液直接进行转化，或者先用乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸，然后再进一步催化生产l-酪氨酸(多酶偶联生物合成丙酮酸和l--酪氨酸研究，2014，南京大学硕士论文)，但丙酮酸易分解，这种方案效率并不高。技术实现要素：基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了不生成氧化氢的转化乳酸和苯酚产l-酪氨酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了三酶共表达的工程菌，实现了l-酪氨酸的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能生产l-酪氨酸并减少杂质生成的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本发明的第一个目的是提供能低成本生产纯多左旋巴的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源l-乳酸脱氢酶、nadh氧化酶和酪氨酸酚裂解酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了l-酪氨酸吸收基因。在一种实施方式中，所述外源l-乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的l-乳酸脱氢酶。外源的nadh氧化酶为乳酸菌来源的nadh氧化酶。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来自于lactococcuslactisatcc19257、lactobacillusplantarumatcc14917。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_003131075.1、krl33571.1的序列。在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nz_jxjz01000017region:18532..19509、azej01000016region:16296..17249的序列。在一种实施方式中，所述nadh氧化酶来自lactococcuslactisatcc19257、lactobacillussanfranciscensisdsm20451、lactobacillusbrevisatcc14869。在一种实施方式中，所述nadh氧化酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_032950924.1、wp_056958268.1、erk43827.1序列。在一种实施方式中，所述nadh氧化酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nz_jxjz01000002region:complement(39571..40911)、nz_ayym01000013region:complement(15875..17233)、awvk01000048region:complement(50022..51416)的序列。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶、nadh氧化酶、酪氨酸酚裂解酶是通过petduet-1共表达的。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于草生欧文氏菌(erwiniaherbicola)、中间柠檬酸菌(citrobacterintermedius)、弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)、嗜热菌symbiobacteriumthermophilum或者symbiobacteriumtoebii。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来源于citrobacterfreundiiatcc8090，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_003837154.1的序列。在一种实施方式中，所述l-酪氨酸吸收基因包括l-酪氨酸分解基因、苯酚分解基因中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述l-酪氨酸分解基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述苯酚分解基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述l-酪氨酸分解基因和苯酚分解基因的核苷酸序列是ncbi上,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还强化表达了将底物转运至细胞内的乳酸转运蛋白基因、苯酚转运相关基因、氨根离子转运基因中的任意一种或者多种。在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还进一步强化表达了nad合成基因、磷酸吡多醛合成相关基因中的任意一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldp(乳酸转运基因)、amtb(氨根离子转运基因)、hpax(苯酚转运基因)、mhpt(苯酚转运基因)、icsa(nad合成基因)、nada(nad合成基因)、pdxj(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述宿主菌为escherichiacolibl21(de3)。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将escherichiacolibl21(de3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述lldp在ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293；amtb为nc_012892region:442006..443292；hpax为；nc_012892region:complement(4502025..4503401)；mhpt为nc_012892region:344788..345999；icsa为nc_012892region:complement(2526116..2527330)；nada为nc_012892region:740487..741530；pdxj为nc_012892region:complement(2567591..2568322)。本发明的第二个目的是提供一种生产光学纯l-酪氨酸的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。在一种实施方式中，所述生产l-酪氨酸，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重1-200g/l，l-乳酸1-200g/l，苯酚浓度1-200g/l，ph7.0-9.0，温度15-40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌，该菌可应用于l-酪氨酸的生产。本发明选择方案不产过氧化氢，细胞不易分解l-酪氨酸，并且细胞内有较高的nad含量。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本发明的大肠杆菌工程菌的功能核心是可以共表达三种酶，分别为l-乳酸脱氢酶(l-lactatedehydrogenase)、nadh氧化酶(nadhoxidase)、酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase)。其原理为：在工程菌全细胞内，l-乳酸脱氢酶以菌体内的nad为辅酶将l-乳酸脱氢生成丙酮酸和nadh；nadh氧化酶将nadh氧化生成nad，实现了辅酶nad的再生。然后在酪氨酸酚裂解酶的作用下丙酮酸、氨根离子、苯酚合成为l-酪氨酸，同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1.本发明所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、lactococcuslactisatcc19257、lactobacillusbrevisatcc14869、citrobacterfreundiiatcc8090购自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。lactobacillussanfranciscensisdsm20451购自德国微生物菌种保藏中心dsmz。pcasred、pcrispr-gdna购自镇江爱必梦生物科技有限公司。2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达(1)大肠杆菌芳香化合物降解基因的敲除本发明中的苯酚和l-酪氨酸都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大肠杆菌乳酸、苯酚、氨根离子转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择乳酸转运相关的基因是lldp，ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293。苯酚转运相关的基因是hpax和mhpt，ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4502025..4503401)和nc_012892region:344788..345999。氨根离子转运相关的基因是amtb，ncbi上accessionno为：nc_012892region:442006..443292。(3)大肠杆菌nad合成相关基因的过表达在乳酸脱氢过程中需要以nad为辅酶，强化表达大肠杆菌nad合成途径的关键酶，可以提高菌体内的nad水平，从而有利于丙酮酸的生成。选择的基因有icsa、nada。ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(2526116..2527330)、nc_012892region:740487..741530。(4)磷酸吡多醛(pyridoxalphosphate)合成相关基因的表达磷酸吡多醛(胺)是酪氨酸裂解酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxj,有利于l-酪氨酸的合成。ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(2567591..2568322)。3.乳酸转化生成丙酮酸相关酶的选择(1)l-乳酸脱氢酶的选择l-乳酸是最为廉价的有机酸，目前主要以l-乳酸氧化酶氧化l-乳酸生产丙酮酸，在此过程中产生过氧化氢，过氧化氢会氧化丙酮酸生成乙酸。l-乳酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，通常以nad(nadp)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量或碳源只有乳酸时一些乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸，以l-乳酸为底物将l-乳酸上生成的氢传递给辅酶nad或nadp，从而生成nadh或nadph。本发明从lactococcuslactisatcc19257和lactobacillusplantarumatcc14917中分别得到l-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是wp_003131075.1)和lpldh(氨基酸序列是krl33571.1)，表达产物用于乳酸的脱氢。(2)nadh氧化酶的选择乳酸脱氢酶从乳酸上脱氢生成丙酮酸nadh。nadh需要被nad氧化酶氧化重新生成nad,从而实现反应的持续进行。nadh氧化酶有产水型和产过氧化氢型两种，产水型的nadh氧化酶不会产生过氧化氢毒性。本发明分别从lactobacillussanfranciscensisdsm20451、lactococcuslactisatcc19257、lactobacillusbrevis中得到产水型nadh氧化酶基因lsnox(氨基酸序列是wp_056958268.1)、llnox(氨基酸序列是wp_003131075.1)、lbnox(氨基酸序列是erk43827)，表达产物用于nad的再生。.(3)酪氨酸酚裂解酶的选择来源于草生欧文氏菌(erwiniaherbicola)、中间柠檬酸菌(citrobacterintermedius)、弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)以及嗜热菌symbiobacteriumthermophilum和symbiobacteriumtoebii等的酪氨酸酚裂解酶是最常研究。本发明从中选择活性较高的来源于弗氏柠檬酸细菌的酶，从citrobacterfreundiiatcc8090中得到酪氨酸酚裂解酶基因cftpl(氨基酸序列是wp_003837154.1)。4.共表达体系的构建及细胞的培养目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，理论上来讲因为每个基因前都有t7和rbs，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含三个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。5.全细胞转化生产l-酪氨酸全细胞转化体系为：细胞湿重为1-200g/l，l-乳酸1-200g/l，苯酚1-200g/l，ph7.0-9.0，温度20-50℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1-24小时。6.样品的检测分析l-酪氨酸的定量分析采用perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦megresc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1根据文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法将escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb进行单或双敲除，其中，本发明所用基因敲除的质粒为pcasred与pcrispr-gdna(hpadsgrna)与同源臂(hpaddonor)一起导入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna诱发宿主在hpad基因位点发生双链断裂，重组酶red将hpaddonor整合到hpad基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分别如序列表seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14所示。mhpb以同样的方式敲除。配置ph为8的溶液，苯酚或l-酪氨酸1g/l，湿菌体量100g/l，35℃放置10小时后测定浓度。表1中显示了反应体系中，苯酚或l-酪氨酸的剩余量。表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度菌株苯酚g/ll-酪氨酸g/lescherichiacolibl21(de3)0.60.4escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)0.90.8escherichiacolibl21(δhpad,de3)0.70.5escherichiacolibl21(δmhpb,de3)0.60.6很显然escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，将之命名为escherichiacolihm。实施例2重组大肠杆菌构建：首先将编码乳酸脱氢酶、nadh氧化酶、酪氨酸酚酸裂解酶的基因，分别连接到质粒petduet-1上。得到各种三基因共表达重组质粒后，将质粒转化大肠杆菌escherichiacolihm，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。收集到的细胞进行转化分析，结果如表2所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重100g/l，l-乳酸50g/l，苯酚50g/l，ph8.0，温度为35℃，摇床转速250转/分钟；转化时间10小时。表2共表达大肠杆菌生成l-酪氨酸的效率比较菌株l-酪氨酸g/lescherichiacolihm/petduet-1-lsnox-llldh-cftpl43.5escherichiacolihm/petduet-1-lsnox-lpldh-cftpl57.0escherichiacolihm/petduet-1-llnox-llldh-cftpl66.2escherichiacolihm/petduet-1-llnox-lpldh-cftpl57.7escherichiacolihm/petduet-1-lbnox-llldh-cftpl38.8escherichiacolihm/petduet-1-lbnoxl-pldh-cftpl52.2由上表可以看出escherichiacolihm/petduet-1-llnox-llldh-cftpl结果最好。实施例3根据实例2所述的菌株构建方法(各类质粒根据说明明书采用不同的抗性平板筛选阳性转化子)及诱导表达方法，收集各类细胞进行转化分析，结果如表3所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重50g/l，l-乳酸10g/l，苯酚10g/l，ph7.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间10小时。表3各种表达质粒对于生产l-酪氨酸的比较菌株l-酪氨酸g/lescherichiacolihm/petduet-1-llnox-llldh-cftpl6.3escherichiacolihm/pacycduet-1-llnox-llldh-cftpl4.3escherichiacolihm/pcoladuet-1-llnox-llldh-cftpl5.7escherichiacolihm/prsfduet-1-llnox-llldh-cftpl5.3escherichiacolihm/pcdfduet-1-llnox-llldh-cftpl4.8由上表可以看出采用petduet-1共表达时效果最好。实施例4采用文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法，将escherichiacolihm基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:10所示。强化基因lldp表达时，以escherichiacolihm基因组为模板，以引物lldp-ff/lldp-fr、lldp-gpda-f/lldp-gpda-r、lldp-rf/lldp-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldp-ff和lldp-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含lldpsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在lldp基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到lldp基因之前，并测序验证。强化基因hpax表达时，采用类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含hpaxsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在hpax基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到hpax基因之前，并测序验证强化基因mhpt表达时，采用类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含mhptsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在mhpt基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到mhpt之前，并测序验证强化基因amtb表达时，采用类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含amtbsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在amtb基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到amtb基因之前，并测序验证下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表4引物名称与序列表序号对照根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/l，l-乳酸50g/l，苯酚10g/l，ph8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。表5转化结果比较菌株l-酪氨酸g/lescherichiacolihm(pg-lldp)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl8.3escherichiacolihm(pg-hpax)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl7.5escherichiacolihm(pg-mhpt)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl7.8escherichiacolihm(pg-amtb)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl7.0escherichiacolihm(pg-hpax，pg-mhpt)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl8.9escherichiacolihm(pg-lldp,pg-hpax,pg-mhpt)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl9.7escherichiacolihm/petduet-1-llnox-llldh-cftpl6.9将效果最好的escherichiacolihm(pg-lldp,pg-hpax,pg-mhpt)命名为escherichiacolihmlhm。实施例5根据实例4的方法将escherichiacolihmlhm中icsa和/或nada基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:22所示。然后再将质粒导入。强化基因icsa表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含icsa-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在icsa基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到icsa基因之前，并测序验证强化基因nada表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含nada-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在icsa基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到nada基因之前，并测序验证强化基因pdxj表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含pdxj-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在icsa基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到pdxj基因之前，并测序验证下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表6引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号icsasgrnaseqidno:2nadasgrnaseqidno:3pdxjsgrnaseqidno:16基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/l，l-乳酸200g/l，苯酚200g/l，ph9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。表7转化结果比较菌株l-酪氨酸g/lescherichiacolihmlhm(pg-icsa、pg-nada)petduet-1-llnox-llldh-cftpl83.1escherichiacolihmlhm(pg-icsa)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl53.5escherichiacolihmlhm(pg-nada)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl81.9escherichiacolihmlhm(pg-nada,pg-pdxj)/petduet-1-llnox-llldh-cftpl94.0escherichiacolihmlhm/petduet-1-llnox-llldh-cftpl54.9将最好的escherichiacolihmlhm(pg-nada,pg-pdxj)命名为escherichiacolihp实施例6根据实施例2所述诱导表达方法，将escherichiacolihp/petduet-1-llnox-llldh-cftpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/l，l-乳酸1g/l，苯酚1g/l，ph7.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，l-酪氨酸浓度为52mg/l。实施例7根据实施例2所述诱导表达方法，将escherichiacolihp/petduet-1-llnox-llldh-cftpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/l，l-乳酸200g/l，苯酚200g/l，ph8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。测定结果，l-酪氨酸浓度为402g/l。l-酪氨酸难溶于水，高浓度下会析出，此结果为稀释后测定的结果。同样条件下escherichiacolibl21(de3)/pcoladuet-1-llnox-llldh的l-酪氨酸浓度为365g/l。以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。序列表<110>江南大学<120>一种工程菌及其在生产l-酪氨酸中的应用<130>2018.3.15<160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gattgccaccgtccacgagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cggctggcaggctgaagaag20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ttaacggcgtcggcttcggg20<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4aaatacaatctctgtaggttcttct25<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5tcggccactcatcaacatgattcatgagtctgttgctcatctccttgtca50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6tgacaaggagatgagcaacagactcatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>7<211>50<212>dna<213>人工序列<400>7cgtagttttgttgccagagattcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>8<211>50<212>dna<213>人工序列<400>8cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgaatctctggcaacaaaactacg50<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9taacacctgacccgcagtgtaaccg25<210>10<211>1100<212>dna<213>escherichiacolibl21(de3)<400>10atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaac900aggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacac960taaatcagtaagttggcagcatcaccccgttttcagtacgttacgtttcactgtgagaat1020ggagattgcccatcccgccatcctggtctaagcctggaaaggatcaattttcatccgaac1080gttcctgacaggagaaaacc1100<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tatgcccgtcgatcgcgccc20<210>12<211>120<212>dna<213>人工序列<400>12ccaagatcacgcacgtaccgtcgatgtatctctctgaactgccagggaaaaaccacggtt60agatcagcaagcgttgccgggaaatgggcgtcgataccattatcgttttcgacacccact120<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13tcatcgagtacctcttgcgc20<210>14<211>120<212>dna<213>人工序列<400>14tagcctgatatgcacgcttatcttcactgtctttcccactcgccgctggtgggatatgtc60aatggcgtgattgccagcgcccgcgagcgtattgcggctttctcccctgaactggtggtg120<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15cgaacagaaagacgatcagg20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16cgtcgcggtcagtaatgtga20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17ggtaatggctgcacctgcgg20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18gcgggatgaagatgatgaag20当前第1页12