一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记及应用的制作方法

文档序号：14983884发布日期：2018-07-20 20:43阅读：398来源：国知局

本发明涉及油菜育种及分子生物学领域，具体涉及一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记及应用。

背景技术：

甘蓝型油菜是我国重要的油料作物，不但为人类提供食用油，而且还可以提供富含蛋白质的饲料，因此提高油菜产量一直是育种家们首要目标。种子大小(重量)和角果长度是油菜产量构成的重要组成部分，近二十年来在油菜等中发现了数百个粒重和角果长度的qtl，但这些qtl的遗传和分子调控网络还不清楚。

种子大小/重量被认为是最重要的性状之一，种子作为高等植物有性生殖的产物，不仅是植物繁育的最主要形式，也是人类赖以生存的粮食的最主要来源。油菜种子不仅是油分和蛋白质的储存器官，更是油菜最主要的收获物质，研究种子大小/重量具有非常重要的意义。(1)油菜的单株总产量主要由单株角果数、每角果粒数和粒重三个主要因素构成，其中粒重的遗传力最高，受环境影响最小，是油菜的一个重要经济性状，和油菜产量呈正相关(clarkeandsimpson，1978；butruilleetal.，1999；shietal.，2009)。(2)种子重量还影响种子含油量和蛋白质含量等性状(morganetal.，1998；adamskiaetal.，2009；lionnetonetal.，2004)。(3)大粒的种子其发芽力优于小粒种子，并且由大粒种子长成的植株其环境适应性要高于由小粒种子长成的植株。因此，阐明油菜粒重形成的遗传基础有利于油菜的产量提高和品质改良。

种子大小/重量是植物重要的产量性状之一。在被子植物中，成熟的种子包括胚、胚乳和种皮，分别由受精卵、受精极核和珠被发育而来。作物粒重的形成是细胞分裂以增加细胞数目、细胞延伸以增大体积和光合产物积累、内含物不断充实的过程(eglietal.,1989；于振文，1995；郭文善，1997；李伯航，1998；李娜，2015)。在许多植物中，子叶或胚乳的干物质积累与细胞数及籽粒的大小呈正相关关系(于振文，1995；郭文善，1997；李伯航，1998；brocklehurstetal.,1978；herzogetal.,1982；guldanetal.,1985；reddyetal.,1983；张祖建，1998；魏凌基，2004；李娜，2015)。目前为止，一些信号途径已经被报道通过影响胚乳或母体的生长来控制种子大小/重量，包括：iku途径、泛素-蛋白酶体途径、g-蛋白信号途径、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、植物激素和转录因子等不同的信号途径(lietal.,2016)。

近年来，随着分子标记技术的发展，油菜千粒重的qtl定位取得了较大的进展。quijada等(2006)在2年2点4个群体的实验中鉴定到了3个关于粒重的qtls(n7，n17和n19)，但是没有一个qtl能够在多个群体中重复检测到。udall等(2006)在hua-dh、syn-dh和一个测交群体中分别鉴定到6、4和5个qtls，并且发现位于n14连锁群的qtl能够在不同的群体和环境中稳定遗传。shi等(2009)使用一个tndh群体和一个rc-f2群体在10个自然环境中共鉴定到159个千粒重的qtls，但是只有4个主效qtls并且只有一个qtl-qsw.a7-2能够在10个环境中都能检测到。fan等(fanetal.2010)构建了一个dh群体和一个f2群体用于千粒重的qtl定位。在9个千粒重的qtls中，两个主效的qtl-tswa07a和tswa07b能够在不同年份重复检测到，解释了27.6-37.9％的表型变异，并且这两个主效qtl能够同时在dh群体和f2群体中检测到，证实该qtl对千粒重的重要作用。yang等(2012)利用含有186个株系的重组自交系群体定位到了9个粒重的qtls，其中，位于a09染色体的一个主效qtl-cqswa9解释的表型变异为28.2％，并且该qtl和控制角果长度的主效qtl-cqsla9位于同一区间，暗示了该区间可能同时含有控制千粒重和角果长度的基因，或者是有基因能够同时影响千粒重和角果长度。

虽然在目前的研究已经鉴定到了一批影响粒重和角果长度的qtl，但是关于油菜粒重和角果长度的功能分子标记较少，而且未发现能够区分油菜种子高粒重的标记。

技术实现要素：

为解决上述问题本发明提供一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记，该分子标记解决了常规育种方法中存在的粒重和角果长度只能后期鉴定，使得育种周期长、易受环境影响、选择效率低的问题，提高了油菜育种的效率。

一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记对基因bnaa.arf18a的分子标记，所述的核苷酸序列是seqidno.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步的，上述基因bnaa.arf18a含有9个snp，起始密码子atg定义为+1，其中，6个snp分别位于外显子区域+186、+193、+262、+1045、+1303、+1345，3个snp位于内含子区域+59、+931、+1429，9个snp在不同的单株dna中构成hapa、hapb和hapc三种单体型，hapa型的核苷酸序列如seqidno.1所示，hapb型的核苷酸序列如seqidno.2所示，hapc型的核苷酸序列如seqidno.3所示。

上述三个单体型中，含有hapa的材料其千粒重(3.02±0.29g)和角果长度(5.09±0.35cm)都是最低的，最大的是含有hapc的材料(4.05±0.46g；7.37±1.81cm)，含有hapb的材料位于中间水平(3.44±0.42g；5.38±0.36cm)。

进一步的，所述分子标记是根据三种单体型间不同的snps设计的引物对。

进一步的，上述引物对是bnaa.arf18a-186或/和bnaa.arf18a-262，引物对

bnaa.arf18a-186的正向引物的核苷酸序列如seqidno.4所示、反向引物的核苷酸序列如seqidno.5所示；bnaa.arf18a-262的正向引物的核苷酸序列如seqidno.6所示、反向引物的核苷酸序列如seqidno.7所示。

上述分子标记在油菜育种中的应用也是本发明的保护范围，所述油菜育种包括分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种等育种方法。

本发明还提供了上述分子标记在油菜育种中应用的方法，包括以下步骤：

(1)pcr扩增体系建立：采用引物对bnaa.arf18a-186和bnaa.arf18a-262的任一对或两对，以甘蓝型油菜单株dna为模板，进行pcr扩增。

(2)对上述pcr扩增的产物进行酶切：

若采用引物对bnaa.arf18a-186扩增，将扩增产物进行ecorv酶切，电泳分离，不能观察到211bp长度的条带，则该单株是高粒重和长角果单株，观察到211bp长度的条带，则该单株不是高粒重和长角果单株。

若采用引物对bnaa.arf18a-262扩增，将扩增产物进行bsmai酶切，电用分离，观察到125bp长度的条带，则该单株是低粒重和短角果单株，若不能观察到125bp长度的条带，则该单株为不是低粒重和短角果单株。

若采用引物对bnaa.arf18a-186和bnaa.arf18a-262分别进行pcr扩增，采用引物对bnaa.arf18a-186扩增的产物采用ecorv酶切，采用引物对bnaa.arf18a-262扩增的产物采用bsmai酶切，分别电泳分离，在ecorv酶切的产物中不能观察到211bp长度的条带，该单株是高粒重和长角果单株；在bsmai酶切的产物中观察到125bp长度的条带，则该单株是低粒重和短角果单株；在ecorv酶切的产物中观察到211bp条带，且在bsmai酶切的产物中不能观察到125bp的条带，则该单株为中等粒重和中等长度角果的单株。

育种者可根据需要预测、筛选或鉴定单株的粒重和角果长而选取上述引物对中的任一对或多对单株的dna进行扩增和酶切，从而得出单株的粒重和角果长。

本发明的有益效果在于：

本发明的分子标记，在油菜幼苗期就能能够快速可靠的鉴定不同品种油菜单株的粒重和角果长度，提高了油菜育种效率，大大的缩短了油菜育种年限；采用分子标记进行鉴定和选择，可将群体的粒重和角果长度分别提高17％和34％，后期测试鉴定的工作量减少33％以上。

附图说明

图1是甘蓝型油菜粒重(上)和角果长度(下)关联分析的结果，其中，横坐标为染色体物理距离，纵坐标为每个snp位点的-log10(p)数值，水平的虚线代表达到显著的-log10(p)数值，千粒重为6.02，角果长度为6.3；

图2是自然群体中bnaa.arf18a的单体型分析结果示意图，其中(a)bnaa.arf18a基因结构及snps位点构成的三种不同的单体型示意图，灰色的方框和黑色的横线分别代表外显子和内含子。(b)三种不同单体型间的千粒重和角果长度的表型差异，星号代表hapb和hapc与hapa之间的差异显著性，*p≤0.05,***p≤0.001；

图3是bnaa.arf18a中两对dcaps标记的开发，方框中显示的是dcaps标记序列，括号内的数字表示基因序列的位置，蓝色字母代表不同单体型间的snp，红色字母代表在设计dcaps标记过程中为引入酶切位点而改变的碱基。

图4为dcaps标记在不同粒重和角果长度材料中的检测情况示意图，其中，1-5为自然群体中的hapa材料，6-10为自然群体中的hapb材料，11-15为自然群体中的hapc材料。

具体实施方式

以下为本发明方法的一种具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，任何不超离本发明实质内容的变换，仍应属于本发明的保护范围。

实施例1:

一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记bnaa.arf18a-186和bnaa.arf18a-262，通过以下方法获得：

本实施例以157份遗传来源不同、粒重和角果长度变异较大的油菜品种为例，构建了一个自然群体，详细说明获得与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记的方法，具体如下：

(一)群体构建：

以157份遗传来源不同、粒重和角果长度变异较大(1.75-5.71g/4.02-10.62cm)的油菜品种组成的自然群体为研究材料(世界范围内收集)。

(二)粒重及角果长度的测定：

(1)植物材料在田间种植，每个株系3行，每行8-10株，随机区组设计；长江流域一般9月份播种于于苗床，10月下旬移栽至大田；常规方法进行大田管理，直至种子成熟(次年5月初)；

(2)在成熟期时，每个株系随机选取5个单株，从主花序的底部依次向上各取20个差异不明显角果，这样每个株系共有100个角果。

测量长度：油菜的角果并不是完全的直线，大多数都有弯曲现象。取一根长棉线，以第一个角果的最底端(不含果柄)对齐棉线起点，把棉线贴合角果的走向向前延伸，直到角果果喙的前端即为棉线终点，即我们只取角果果身的长度，记下棉线起点到终点的值，这个值即为单个角果的长度值，取100个角果的平均值即为各个品种的角果长度(cm)。

测量千粒重：将每个株系收获的种子放于烘箱烘干，从中随机数出1000粒种子称重，重复3次，取3次测量的平均值即为各个品种的粒重(g)。

(三)dna提取

对于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩叶片，采用“ctab法提取植物基因组dna”实验步骤提取基因组dna。

(1)采集适量幼嫩叶片，用液n2研成粉末，0.4g装入2ml离心管中(-20℃预冷)。

(2)预热2％ctab(灭菌)到70℃，加700μl到装有叶片粉末的离心管中，(为防止氧化，还可以加入14μl的β-巯基乙醇)混匀(防止冻融)。

(3)立即置于65℃水浴45min，每5min，上下颠倒1次；

(4)加入等体积(600μl)氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。12000g离心5分钟。

(5)取上清，重复4步一次(可以省去)。

(6)取450μl上清于一新2ml离心管，加入1ml95％乙醇和20μl10mnh4ac，混匀，室温放置10min。

(7)12000g离心10min，去上清，用75％无水乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。

(8)加入50μl0.5te或无菌水(含20μg/rnase)，置于4℃过夜，待dna溶解后，检测dna浓度及质量。

(四)基因组重测序

将dna样品送北京百迈客公司测序。实验流程按照illumina公司提供的标准protocol执行，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程。样品基因组dna检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将dna片段化，然后对片段化的dna进行片段纯化、末端修复、3′端加a、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用illuminahiseqtm4000进行测序，测序长度为pe125，测序深度为5。

将测序得到的原始数据进行过滤，得到cleanreads。用bwa(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件将cleanreads与油菜参考基因组brassica_napus.annotation_v5(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)进行比对；用gatk软件进行snp和indel检测，具体流程参考gatk官方网站的bestpractice：

https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php。删除缺失率>0.6位点，缺失率小于0.6的位点使用软件beaglev4.1(https://faculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.html#download)进行填补。最后，去除杂合率大于0.25和最小等位基因频率(minorallelefrequency，maf)小于0.05的位点，剩余的位点用于全基因组关联分析。

(五)关联分析

利用r语言的mrmlmv1.3软件包进行gwas分析(teametal.,2014)，采用q+k的混合线性模型对性状和标记进行关联位点的检测，rmlm阈值设定为p＜-log10(0.05/me)(me为有效标记数的数目，具体数目参照软件分析方法)，mrmlm的阈值设定为lod>3。rmlm的结果通过r软件包qqman(https://cran.r-project.org/web/packages/qqman/)进行manhattan图和q-q图显示。在a09染色体的27.78mb-28.61mb检测到一个与粒重和角果长度显著相关的区间(图一)。

(六)候选基因预测

将显著的snp位置向上向下各延伸100kb或者与选择与显著snp处于同一单体型区(r²＞0.5)的区间，我们将这样的区间定义为候选关联区间。在此区间参考以下条件预测候选基因：1)参考已报道qtl定位的结果；2)snp直接落在基因内部并引起氨基酸的改变；3)在甘蓝型油菜或拟南芥参考基因组上与性状相关的已知功能的基因。根据以上方法筛选到一个已经报道的与油菜粒重和角果长度相关的基因bnaa.arf18a(liuetal.,2015)。

(七)功能标记转化与检测

在bnaa.arf18.a基因内部总共含有9个snps，3个位于内含子6个位于外显子且只有2个snps引起了氨基酸的改变；9个snps在不同的材料间可以构成3种不同类型的单体型(haplotype)hapa、hapb和hapc(图二)。三个单体型中，含有hapa的材料其千粒重(3.02±0.29g)和角果长度(5.09±0.35cm)都是最低的，最大的是含有hapc的材料(4.05±0.46g；7.37±1.81cm)，含有hapb的材料位于中间水平(3.44±0.42g；5.38±0.36cm)。根据三种单体型间不同的snp信息设计了两对dcaps标记(引物设计是根据dcaps标记的原理在caps标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合snp位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和caps标记类似的多态性。这里，我们利用在线网站dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)辅助设计)：bnaa.arf18a-186的正向引物序列为5’-atggcgaatgtagatggagat-3’，反向引物序列为5’-ctctgtgtacagctgatcttgatat-3’；bnaa.arf18a-262的正向引物序列为5’-gttgtttgtttgattttcaggtt-3’，反向引物序列为5’-gaccctgagggaagtagaaaagtct-3’(图三)。

根据自然群体单体型分析的结果，每个单体型分别选取了5个不同的株系(1-5：hapa，6-10：hapb，11-15：hapc)使用两对dcaps标记进行pcr扩增，其pcr产物分别用相应的限制性内切酶消化处理。3％的琼脂糖凝胶电泳的结果显示：正如实验设想的一样，ecorv能够将11-15号材料的bnaa.arf18a-186pcr产物切断却不能将1-10号材料的pcr产物切开；bsmai能够将6-15号材料的bnaa.arf18a-262pcr产物切断却不能将1-5号材料的pcr产物切开(图四)。通过两对dcaps标记的选择，人们可以选择出千粒重和角果长度的最优单体型。

实施例二：

一种与油菜粒重及角果长度紧密相关的分子标记在油菜高产育种中的应用，其步骤是：

以欧洲冬性品种express(低粒重短角果)和中国半冬性品种house7(高粒重长角果)为亲本，构建dh分离群体为研究材料，利用bnaa.arf18a-186和bnaa.arf18a-262两种dcaps标记进一步扩大检测范围，检测方法如下：

(1)提取dh群体及亲本dna，方法同实施例二。

(2)首先检测dh群体亲本的单体型类型，利用下述引物进行pcr过程：

bnaa.arf18a-186的正向引物序列为5’-atggcgaatgtagatggagat-3’，反向引物序列为5’-ctctgtgtacagctgatcttgatat-3’；

bnaa.arf18a-262的正向引物序列为5’-gttgtttgtttgattttcaggtt-3’，反向引物序列为5’-gaccctgagggaagtagaaaagtct-3’

(3)pcr反应体系：总体积为25μl，具体成分如下：

(4)pcr扩增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循环，72℃10min。运行完毕后4℃条件下保存。

(5)pcr扩增产物的酶切：每10μl用2.5u相应的的限制性酶ecorv和bsmai在37℃条件下处理1-16h。

(6)2种酶切产物经3％琼脂糖凝胶电泳分离后，express仅出现一条为211bp及一条为125bp的条带，说明express不能被ecorv和bsmai酶切，即express为单体型a(hapa)；house7出现一条为188bp(23bp太小看不出)及一条为98bp(27bp太小看不出)的条带，说明house7能够被ecorv和bsmai酶切，即house7为单体型c(hapc)。那么由二者得来的dh群体中只有hapa和hapc两种单体型，只用其中一条引物即可将不同表型的材料区别开。

(7)采用同样的方法在dh群体中进行检测，结果发现：dh群体中等位基因(hapa)来自于亲本‘express’的株系数目基本等于dh群体中等位基因(hapc)来自于亲本‘house7’的株系数目；所有含有hapc的株系其千粒重和角果长度均值分别为3.72±0.14g和6.21±0.42cm，显著高于所有含hapa的株系均值(3.22±0.1g和5.13±0.25cm)；二者千粒重和角果长度都存在显著性差异(p≤0.001)。通过选择含有hapc的单株，可以进一步快速培育高产油菜品种。

以上结果充分说明，这两个dcaps标记确实可以用于油菜粒重和角果长度的预测、鉴定和筛选。

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<110>西南大学

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