本发明涉及靶dna片段的检测技术，具体涉及一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。
背景技术：
罗非鱼是世界上养殖最广泛的鱼类之一，全球产量仅在2013年就达到450万吨。尽管罗非鱼在差水质中耐受力比其他淡水鱼更好，但随着水产养殖活动的广泛开展，养殖业受到了各种各样的病原体的影响，最为突出的就是链球菌。链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌和海豚链球菌，具有发病率高和死亡率高的特点，目前已经造成巨大经济损失。
无乳链球菌和海豚链球菌很难被区别鉴定，特别是又具有高同源性，所以容易造成误诊，更是难以区分。自从1957年在日本培养的虹鳟鱼首次被报道感染了链球菌以来，由于无乳链球菌和海豚链球菌具有类似的临床症状，因此还未能建立一种简单、便捷和高效的分子诊断技术。传统的生理生化测试方法，都比较耗时和费力；另外，由于链球菌病发病迅速，如诊断不及时、不准确，也会影响后续的预防和治疗。此外，相似的表型和生物化学特征也会导致错误的鉴定。
目前，已经有一些新技术被应用于罗非鱼链球菌的诊断，如16s测序技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、循环介导等温扩增技术、双重、多重和定量pcr等。但这些技术也存在一定的不足，如16s测序技术很难区分同源性较高的种类；荧光抗体技术和elisa存在成本昂贵及操作步骤繁杂等；lamp易发生假阳性；定量pcr需要昂贵的仪器、专业的操作并且成本较高；双重和多重pcr的两对及以上的引物间会产生干扰等。因此，需要建立一种方便、灵敏、快速和经济的诊断罗非鱼链球菌病的方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物。
本发明的另一目的在于提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。
本发明的再一目的在于提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。该方法对检测对象损伤小、快速准确、操作简便。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，包括如下引物序列：
st-1：5'-tgaggtaaccttttaggagc-3'；
st-2：5'-aatcgcttttgctttctc-3'。
本发明提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，包括上述引物st-1和st-2。
本发明提供上述引物或试剂盒在鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。
本发明还提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，包括如下步骤：
(1)取待检样品；
(2)加入含有上述引物st-1和st-2的反应混合液和待检样品，配成pcr反应体系混合液；进行pcr反应于一个反应程序：95℃预变性5min，94℃30sec，60℃30sec和72℃1min的30个循环，最后72℃延伸10min；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测检测液是否出现特异的dna条带，出现则判定为阳性；没有出现特异性条带的则判定为阴性；阳性表示待检样品中含有无乳链球菌或/和海豚链球菌；阴性表示不含有无乳链球菌和海豚链球菌；
其中，出现616bp片段的为无乳链球菌，794bp片段的则为海豚链球菌。
所述的pcr反应体系混合液是1μl的待检样品、0.2μm的引物st-1、0.2μm的引物st-2、不含mgcl2的1×taqbuffer、0.2mm的dntp、0.625u的taq酶、2mm的mgcl2和depc水，总体积为25μl。
所述的待检样品包括但不限于无乳链球菌和海豚链球菌的基因组dna、菌落和组织样品；优选为鱼的脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉或细菌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明解决了现有技术检测无乳链球菌和海豚链球菌存在的周期长、操作复杂、检测成本高等问题，本发明最短在1.5h内即可完成所有检测操作，简单快速；
(2)本发明基于检测16s-23s的基因序列，可同时快速地检测养殖生产中的无乳链球菌和海豚链球菌，准确性高，其对基因组dna和菌落检测下限分别为1.5pg/μl(dna)和5.8cfu/μl(单菌落)；
(3)无乳链球菌和海豚链球菌的人工感染最低检出下限均为105cfu/g；
(4)检测成本低，只需一对引物，操作简便，适合多样本的同时检测；
(5)本发明还可以用于鱼的脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉和水体中无乳链球菌和海豚链球菌的检测及鉴定。
(6)本发明所用的一对特异性引物st-1和st-2，是根据无乳链球菌和海豚链球菌的全基因序列，尤其是16s和23s设计的。按照本发明的方法对样品进行分子检测，可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌。本发明建立的分子检测方法对无乳链球菌和海豚链球菌的检测下限均为1.5pg/μl(dna)和5.8cfu/μl(单菌落)；在人工分别感染无乳链球菌和海豚链球菌的混合罗非鱼组织样中，其对两种菌的灵敏度均为105cfu/g；在腹腔注射无乳链球菌(1.83×107cfu/ml)和海豚链球菌(4×107cfu/ml)的罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏等组织器官中都可以检测出无乳链球菌和海豚链球菌。本方法可同时快速检测罗非鱼养殖中无乳链球菌和海豚链球菌，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警。
附图说明
图1是通用引物扩增16srdnapcr产物的琼脂糖凝胶电泳(a)和引物st-1和st-2扩增特异性序列(b)；其中，m代表dna2000bp大小标记；泳道1和泳道2分别代表了无乳链球菌atcc13813和海豚链球菌atcc29178参考菌株，泳道b同时含有这两个细菌；泳道3-9代表停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌。
图2是特异引物对无乳链球菌的敏感性；其中，(a)m代表dna2000bp大小marker，p为阳性对照，n为阴性对照；泳道1-8分别代表无乳链球菌dna的150ng/μl、15ng/μl、1.5ng/μl、0.15ng/μl、15pg/μl、1.5pg/μl、0.15pg/μl和15fg/μl；(b)m代表dna2000bp大小marker，p为阳性对照，n为阴性对照；泳道1-8代表用于扩增的细菌数量：5.8×105、5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101、5.8×100、5.8×10-1和5.8×10-2cfu/ml。
图3是特异引物对海豚链球菌的敏感性；其中，(a)m代表dna2000bp大小marker，p为阳性对照，n为阴性对照；泳道1-8分别代表无乳链球菌dna的15ng/μl、1.5ng/μl、0.15ng/μl、15pg/μl、1.5pg/μl、0.15pg/μl、15fg/μl和1.5fg/μl；(b)m代表dna2000bp大小marker，p为阳性对照，n为阴性对照；泳道1-8代表用于扩增的细菌数量：5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101、5.8×100、5.8×10-1、5.8×10-2和5.8×10-3cfu/ml。
图4是特异引物应用于人工标本的检测灵敏度；(a)无乳链球菌，(b)海豚链球菌；其中，m代表dna2000bp大小标记，p为阳性对照，n为阴性对照；通过一个引物，预计616bp和794bp的预计大小的pcr产物为分别来自无乳链球菌和海豚链球菌；泳道1-8：以浓度107～100cfu/g的无乳链球菌和海豚链球菌分别与含有罗非鱼脑、脾脏、肝脏、肾脏和肌肉的混合物混合后的pcr扩增结果。
图5是分别感染无乳链球菌(a)和海豚链球菌(b)的鱼组织扩增的pcr产物；其中，m代表dna2000bp的marker，1和2、3和4、5和6、7和8，分别代表实验组中罗非鱼的大脑、肝脏、脾脏和肾脏扩增的pcr结果，9为阳性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用仪器及试剂：
细菌dna抽提试剂盒，购于大连宝生物工程有限公司，dntp、mgcl2、taqdna聚合酶、10×pcrbuffer和goldview均购于天根生化科技(北京)有限公司，脑心浸液培养基(bhi)营养琼脂(广东环凯微生物科技有限公司生产)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，高速离心机(sigma公司，美国)，pcr仪(abi公司，美国)，纯水仪(millipore公司，美国)，移液器(eppendorf公司，德国)，凝胶成像仪(bio-rad公司，美国)，核酸电泳仪(bio-rad公司，美国)震荡仪(海门其林贝尔公司，江苏)，高压灭菌锅(北京发恩科贸有限公司，北京)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂，上海)，超低温冰箱(thermo公司，美国)和nanodrop2000c超微量分光光度计(赛默科技，美国)。
实施例中所用的无乳链球菌(streptococcusagalactiae)atcc13813购自上海康朗生物科技有限公司，海豚链球菌(strepstococcusiniae)atcc29178和停乳链球菌(streptococcusdysgalactiae)标准菌株nctc4335购自中国微生物菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc6538购自广东微生物菌种保藏中心，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)bncc186123、创伤弧菌(vibriovulnificus)bncc186281、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)bncc185983和大肠杆菌(escherichiacoli)bncc336902购自北纳生物，迟钝爱德华菌(edwardsiellatarda)atcc15947购自上海北诺生物科技有限公司。
实施例1同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法的建立
(1)模板制备：取纯培养的无乳链球菌、海豚链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌，采用dna提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取其基因组dna，用作反应模板；
(2)引物设计合成：根据文献，在ncbi里下载无乳链球菌和海豚链球菌的全基因组序列，通过比对，有目的的寻找两段同源序列，并且同源序列之间的大小在两个菌中不一样且大小合适。最后发现无乳链球菌和海豚链球菌的16s和23s具有高同源性，且间隔序列大小在两菌种不一样，前者273bp，后者451bp。最后设计了特异性引物，预计前者扩出片段大小为616bp，后者扩出片段大小为794bp，相差大小178bp，刚好在2000bpmarker中750bp条带的上下。
引物序列为：
st-1：5'-tgaggtaaccttttaggagc-3'；
st-2：5'-aatcgcttttgctttctc-3'，由华大基因合成；
(3)pcr反应体系：25μl反应体系混合液是1μl的模板，0.2μm的引物st-1、0.2μm的引物st-2、不含mgcl2的1×taqbuffer、0.2mm的dntp、0.625u的taq酶、2mm的mgcl2和depc水；
(4)pcr反应程序：95℃预变性5min，94℃(30sec)，60℃(30sec)和72℃(1min)的30个循环，最后72℃延伸10min；
(5)pcr的特异性检测：以步骤(1)中的无乳链球菌、海豚链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌的dna为模板，检验此pcr技术的特异性，结果如图1，无乳链球菌中出现616bp和海豚链球菌出现的和794bp的特异条带，而其他均未出现条带。
实施例2一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法的dna灵敏度，包括如下步骤：
(1)分别提取无乳链球菌和海豚链球菌dna：分别取纯培养无乳链球菌和海豚链球菌的菌液2～3ml，用商业化的dna抽提试剂盒提取dna，用分光光度计测定其浓度；
(2)采用实施例1的体系和程序，分别以无乳链球菌和海豚链球菌的dna作为阳性对照的模板，以depc水作为阴性对照的模板；
(3)将测定浓度的dna浓度，按所需，无乳链球菌和海豚链球菌都稀释为1.5μg/μl，1.5μg/μl，150ng/μl，15ng/μl，1.5ng/μl，0.15ng/μl，15pg/μl，1.5pg/μl，0.15pg/μl和15fg/μl；
(4)如图2a和图3a所示，无乳链球菌和海豚链球菌的dna灵敏度都为1.5pg/μl。
实施例3一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法的单细菌灵敏度，包括如下步骤：
(1)分别挑取平板上无乳链球菌和海豚链球菌，用pbs(磷酸盐缓冲盐水，ph7.4)洗两遍，按十倍梯度稀释，涂板计数；
(2)无乳链球菌和海豚链球菌分别稀释为5.8×105、5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101、5.8×100、5.8×10-1、5.8×10-2、5.8×10-3和5.8×10-4cfu/ml；
(3)采用实施例1的体系和程序，分别以无乳链球菌和海豚链球菌的dna作为阳性对照的模板，以depc水作为阴性对照的模板；取计数后的菌液100μl，用商业化的dna抽提试剂盒提取待检样品的dna作为模板；也可直接将菌液煮沸10min，取上清液作为待检样品的模板；
(4)如图2b和图3b所示，乳链球菌和海豚链球菌的纯菌物的灵敏度都为5.8cfu/μl。
实施例4一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法关于人工混合样的灵敏度检测，包括如下步骤：
(1)取健康罗非鱼的脑、脾脏、肝脏、肾脏和肌肉，称重，在无菌条件下，用pbs(磷酸盐缓冲盐，ph7.4)均质化；
(2)组织混合物分别与已计数的无乳链球菌和海豚链球菌混合，其浓度分别约为107、106、105、104、103、102、101和100cfu/g。然后，提取在dna前，60μl组织混合液被6μl溶菌酶(10mg/ml)在37℃水解30分钟。以管中的上清液或提取的dna为模板，检测极限是由1克组织中细菌细胞的数量计算出来的；
(3)采用实施例1的体系和程序，分别以无乳链球菌和海豚链球菌的dna作为阳性对照的模板，以depc水作为阴性对照的模板。
(4)如图4所示，无乳链球菌和海豚链球菌的人工标本的检测灵敏度都达到了105cfu/g。
实施例5一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法人工感染的应用，包括如下步骤：
(1)六十条健康罗非鱼(oreochromisspp.)(25.0±2.0)，购自广东罗非鱼良种场，定期喂养1周，然后他们被随机分为三组，一个腹腔注射无乳链球菌(1.83×107cfu/ml)，第二个腹腔注射海豚链球菌(4×107cfu/ml)，最后一组腹腔注射等体积的生理盐水，作为阴性对照。1周后，脑、肝脏、脾脏和肾脏组织从这些试验鱼中取出。
(2)0.2～0.3g的组织样煮沸10分钟，在10000g离心2分钟，取上清为模板。
(3)采用实施例1的体系和程序，分别以无乳链球菌和海豚链球菌的dna作为阳性对照的模板，以depc水作为阴性对照的模板。
(4)结果如图5所示，预计的阳性样都为阳性，预计的阴性样都为阴性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>暨南大学
<120>一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>st-1
<400>1
tgaggtaaccttttaggagc20
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>st-2
<400>2
aatcgcttttgctttctc18