本发明涉及技术领域，具体地说，是一种基于多色探针熔解曲线分析的喹硫平、阿立哌唑药物基因组学检测方法。
背景技术：
非典型抗精神病药是一类需要进入脑内才能发挥药理作用的亲脂性药物。其中喹硫平和阿立哌唑是近几年上市的二苯二氮卓类药物。由于喹硫平和阿立哌唑疗效好、耐受性和安全性好，而备受临床医生和患者喜欢，已经成为临床上治疗精神分裂症的一线方案。
喹硫平的化学名为：11-[4-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-1-哌嗪基]二苯并[b,f][1,4]硫氮杂卓，同时对多巴胺D2和5-HT2受体有拮抗作用，对于5-HT2受体具有更高的阻断作用。喹硫平对5-HT2和D2受体有较高的结合率，但对D2受体有较低的亲和力和快速解离速度。喹硫平对5-HT1A、5-HT6、组胺-1(H1)、α1-肾上腺素和α2-肾上腺素受体也有亲和力，同时，还有温和的5-羟色胺再摄取抑制作用。目前，喹硫平已用于治疗精神分裂症和多种跨类诊断的疾病，例如：情感障碍、抑郁症状、躁狂、焦虑和抑郁症状、强迫症、创伤后应激障碍、攻击和敌意、边缘人格障碍和震颤谵妄等。
阿立哌唑的化学名为：7-{4-[4-(2,3-二氯苯基)-l-哌嗪基]丁氧基}-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮，是DA部分激动剂，对D2、D3受体具有较强的亲和力，D2受体部分激动可稳定DA系统，避免了类似传统抗精神病药物引起DA功能不足而导致的不良影响。另外，阿立哌唑对5-HT1A部分激动，而对5-HT2A部分拮抗。对D2受体的拮抗作用大于5-HT受体。目前，阿立哌唑主要用来治疗精神分裂症的阳性症状、阴性症状，对情感症状及兴奋激越、认知障碍亦有明显疗效。
中国专利文献CN105861685A公开了一种基于rs5993883的检测喹硫平用药效果的试剂盒。中国专利文献CN102912004A等公开了CYP1A2基因检测液相芯片和特异性引物。中国专利文献CN103122389A公开了一种用于CYP3A5SNP(rs776746)分型快速检测的试剂盒。中国专利文献CN103834721A公开了一种细胞色素P450CYP3A4SNP的检测试剂盒。中国专利文献CN105331692A公开了用于检测rs1800497的引物组合物、检测试剂盒及检测方法。但是，关于本发明的基于多色探针熔解曲线分析的喹硫平、阿立哌唑药物基因组学检测方法目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种基于多色探针熔解曲线分析的喹硫平、阿立哌唑药物基因组学检测的引物和探针组合。
本发明的第二个目的是，提供一种引物和探针组合的应用。
本发明的第三个目的是，提供一种检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型的试剂盒。
本发明的第四个目的是，提供一种检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型的方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种基于多色探针熔解曲线分析的喹硫平、阿立哌唑药物基因组学检测的引物和探针组合，所述的引物和探针组合用于检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型，
rs762551位点的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，
rs762551位点的下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，
rs776746位点的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，
rs776746位点的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，
rs2242480位点的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，
rs2242480位点的下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，
rs1800497位点的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，
rs1800497位点的下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；
rs762551位点的探针序列如SEQ ID NO:9所示，
rs776746位点的探针序列如SEQ ID NO:10所示，
rs2242480位点的探针序列如SEQ ID NO:11所示，
rs1800497位点的探针序列如SEQ ID NO:12所示。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的引物和探针组合在制备检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型的试剂盒中的应用。
所述的引物和探针组合在制备检测喹硫平和阿立哌唑耐药的试剂盒中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型的试剂盒，所述的试剂盒中包括：如SEQ ID NO:1～8所示的引物序列，如SEQ ID NO:9～12所示的探针序列，dNTP，Klentaq酶。
所述的试剂盒中包括SEQ ID NO:1所示的引物0.9，SEQ ID NO:2所示的引物0.09，SEQ ID NO:3所示的引物0.09，SEQ ID NO:4所示的引物0.9，SEQ ID NO:5所示的引物0.9，SEQ ID NO:6所示的引物0.09，SEQ ID NO:7所示的引物0.9，SEQ ID NO:8所示的引物0.09，如SEQ ID NO:9所示的探针0.27，如SEQ ID NO:10所示的探针0.09，如SEQ ID NO:11所示的探针0.27，如SEQ ID NO:12所示的探针0.09，dNTP 200μM，Klentaq酶0.4U。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测rs762551、rs776746、rs2242480和rs1800497四个位点基因分型的方法，所述的方法包括PCR扩增和HRM分析；PCR扩增条件：95℃预变性3min，然后进行55个反应循环，每个循环包括95℃、15s的变性，55℃、15s的退火以及76℃、20s的延伸，随后反应体系在76℃恒温3min；HRM分析：PCR扩增反应完成后，反应体系在95℃恒温1min，在45℃恒温3min，随后由45℃至85℃进行0.15℃/s的升温，并且每0.3℃记录一次荧光信号，检测共需要进行四次，每次记录一种颜色的荧光信号。
PCR扩增反应在micPCR仪内完成。
对不同荧光颜色的熔解曲线进行分析，即可在同一个反应体系中对四个位点进行分析。
本发明优点在于：
1、本发明的检测方法针对与喹硫平耐药有关的SNP位点rs762551、rs776746，以及阿立哌唑耐药有关的位点rs2242480、rs1800497，可在同一个反应体系中检测四个位点，减少了试剂用量，缩短了检测时间。
2、与Sanger测序法相比，本发明的检测方法仅需2小时左右即可完成，检测速度较快；且由于不依赖特殊检测仪器，成本较为低廉；本发明的检测方法的扩增、检测过程都在闭管条件下完成，不仅减少了气溶胶污染的可能，而且简化了操作。
3、使用本发明的检测方法对240个人外周血DNA样本进行检测，并用Sanger测序方法进行验证，rs762551、rs776746、rs2242480以及rs1800497四个位点的检测正确率都为100％，具有较高的准确率。
附图说明
附图1是利用多色探针熔解曲线检测rs762551位点的结果图。WT：野生型标本；HET：杂合变异标本；HOM：纯合变异标本。
附图2是利用多色探针熔解曲线检测rs776746位点的结果图。WT：野生型标本；HET：杂合变异标本；HOM：纯合变异标本。
附图3是利用多色探针熔解曲线检测rs2242480位点的结果图。WT：野生型标本；HET：杂合变异标本；HOM：纯合变异标本。
附图4是利用多色探针熔解曲线检测rs1800497位点的结果图。WT：野生型标本；HET：杂合变异标本；HOM：纯合变异标本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
材料与仪器
micPCR实时荧光定量PCR分析仪(Bio Molecular Systems)，Klentaq酶(Ab Peptides)，引物与分子信标探针(上海生工生物)，dNTP(TriLink)，人基因组DNA标本。
方法
1、引物设计：针对与喹硫平耐药有关的SNP位点rs762551、rs776746，以及阿立哌唑耐药有关的位点rs2242480、rs1800497设计相应的扩增引物和分子信标探针，引物序列见表1，探针序列见表2。
2、PCR扩增体系：扩增反应体系为10μL，包括200μM的dNTP，0.4U Klentaq酶，基因组DNA 25ng，体系中的引物和探针的浓度见表3。
3、PCR扩增条件：95℃预变性3min，然后进行55个反应循环，每个循环包括95℃、15s的变性，55℃、15s的退火以及76℃、20s的延伸，随后反应体系在76℃恒温3min。扩增反应在micPCR仪内完成。
4、HRM分析：扩增反应完成后，反应体系在95℃恒温1min，在45℃恒温3min，随后由45℃至85℃进行0.15℃/s的升温，并且每0.3℃记录一次荧光信号，本检测共需要进行四次，每次记录一种颜色的荧光信号。对不同荧光颜色的熔解曲线进行分析，即可在同一个反应体系中对四个SNP位点进行分析。
结果
本研究利用四种颜色的荧光探针和能够检测四色荧光的PCR仪，建立了一种基于熔解曲线分析的四重SNP分型方法。本方法可以对喹硫平、阿立哌唑相关的四个SNP位点rs762551、rs776746、rs2242480以及rs1800497在同一个反应体系内进行基因分型，减少了试剂用量，缩短了检测时间。其中，野生型标本与纯合变异标本都属于纯合子，由于扩增子与探针完全正确配对或者错配的原因，其熔解曲线的位置在横坐标上发生了改变。杂合变异标本由于即含有正确配对的扩增子-探针双链，又含有错误配对的扩增子-探针双链，因此会在熔解曲线图上出现两个峰，结果如图1～图4所示。
表1针对四个SNP位点的引物序列
表2针对四个SNP位点的探针序列及其荧光、淬灭标记物
表3PCR反应体系中引物与探针的浓度
实施例2
使用实施例1的检测方法对240个人外周血DNA样本进行检测，并用Sanger测序方法进行验证，rs762551、rs776746、rs2242480以及rs1800497四个位点的检测正确率都为100％，具有较高的准确率。
与Sanger测序法相比，本方法仅需2小时左右即可完成，检测速度较快；且由于不依赖特殊检测仪器，成本较为低廉；本方法的扩增、检测过程都在闭管条件下完成，不仅减少了气溶胶污染的可能，而且简化了操作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120> 一种基于多色探针熔解曲线分析的喹硫平、阿立哌唑药物基因组学检测方法
<130> 人工序列
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgttcatgt tgggaatctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgcgtgtt ctgtgcttgg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtatgtacc acccagctta ac 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atacccctag ttgtacgaca c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaggcattt ttgctaaggt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggaaattga tgcagtttta ccc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctcctagaa catcacgcaa atg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgtgcagctc actccatcct g 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctatctgcgt cctgggccca cagatag 27
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agggaagctc ttttgtcttt caatatctct tccct 35
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catccttgag tggatggtac atggagaagg atg 33
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catgcgcctg cctcgaccag catg 24