本发明属于分子生物学和中药鉴定学领域，涉及沉香dna提取方法，特别是指一种从含树脂高、形成(存放)时间长及深加工产品(或残留物)沉香中提取dna的方法。
背景技术：
：沉香为瑞香科沉香属或拟沉香属植物中含有树脂的木材，是一种名贵的中药。沉香作为药物始载于粱代陶弘景的《名医别录》，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，主治胸腹胀满疼痛、胃寒呕吐、呃逆、肾虚气逆作喘等症。在流通过程中沉香物种、结香方式等信息缺失，再经加工炮制，因此需要经过鉴定才能判断其品质。传统的“看、闻、烧”方法带有主观意识，基于《中国药典》的沉香检测方法也难以客观的判断基原物种，导致掺杂使假或替代的现象屡见不鲜，对临床用药、海关执法、市场规范造成了极大困扰。沉香形成时间久，一般需要几年甚至几十年，木材老化严重，大多由死细胞组成，含有大量的次生代谢产物和色素，dna降解较严重。其高纯度dna的提取难度较大，常规的方法提取效果差，难以满足在种质资源、结香机理、物种鉴定、遗传进化、系统发育和品种选育等领域的要求，而开展这些研究工作，往往需要获得沉香高质量的dna，因此高质量dna的提取是必不可少的一步。此外，其沉香成本过高，重新购买实验沉香样品代价大。因此，迫切需要一种能够适用于提取沉香高质量dna的方法。技术实现要素：本发明的目的在于：提供一种提取沉香高质量dna的方法，尽可能去除或降低dna提取的抑制物，实现树脂含量高、形成(存放)时间久及深加工产品(或残留物)中沉香高质量的dna释放和富集，为沉香分子标记技术等相关领域的研究提供有效的技术手段。为实现上述目的，本发明公开了一种用于提取沉香高质量dna的方法，包括了以下步骤：(1)沉香样品消毒，除杂，充氮，磨成沉香粉末；(2)向步骤(1)所得样品中加入dna提取液，混匀后水浴温浴，室温冷却，再加入dna分离液，混匀，离心，收集上清液；(3)向上清液中加入预冷dna沉淀液，抽吸混匀，静置沉淀；(4)室温冷却，加入dna洗涤液，冰浴后转移至dna吸附柱中，离心，弃去废液；(5)向步骤(4)的dna吸附柱中加入乙醇溶液，离心，弃去废液；(6)使步骤(5)的dna吸附柱中的溶剂挥发后，加入预热的dna溶解液，离心，取上清，即得沉香总dna；(7)将dna提取液作为模板dna，加入到pcr反应体系，定向扩增得到dna目的片段。优选的，所述的沉香样品为任何含有沉香dna的样品。更优选的，所述的沉香样品为含树脂的沉香、沉香药材、沉香木、沉香属植物组织、沉香深加工产品或沉香深加工残留物中的一种或几种。优选的，离心工作温度为4-20℃，离心速率4500-12000rpm，时间1-20min；温浴温度为50-65℃，反应时间为3-8h；沉淀温度-20℃，反应时间为12-18h；冰浴时间5-10min；步骤(5)中的乙醇溶液为70-80％乙醇溶液；步骤(4)、(5)和(6)重复操作1-2次。优选的，所述的dna提取液为3％ctab、100mmtris-hcl、2mmedta、1.4mmnacl、1％pvp-40、0.3mptb、10mg/ml蛋白酶k及β-巯基乙醇；所述的dna分离液为24:1的氯仿-异戊醇；所述的dna沉淀液为异丙醇或无水乙醇；所述的dna洗涤液包括5-8m的乙酸铵；所述的dna溶解液为水或te液；更优选的，步骤(2)加入5-10μl/mg的dna提取液，等体积的dna分离液；步骤(3)加入2倍体积的dna沉淀液；步骤(4)加入等体积的洗涤液。优选的，步骤(7)pcr扩增反应条件为：94-95℃预变性0.4-5min；94℃变性0.4-1min，50-56℃退火0.5-1min，72℃延伸0.5-2min，35-55次循环；72℃延伸5-20min；4℃保温；pcr反应体系为：总体积为15-50μl，2×easytaqpcrsupermix10-15μl、10-100mm引物1-2μl、5-1200ng的dna模板，余量为ddh2o。优选的，步骤(2)为：向步骤(1)所得样品中加入3％的鞣酸溶液，摇匀，静置，加入壳聚糖，摇匀，静置，再加dna提取液，混匀后水浴温浴，室温冷却，再加入dna分离液，混匀，离心，收集上清液。更优选的，步骤(2)中温浴的操作步骤为：温浴温度为60-65℃，反应时间为1-2h；然后降温至50-60℃，反应时间1-2h；再升温至65℃，反应1-5h。本发明的有益效果：(1)本发明采用的方法在传统ctab法基础上，提高了沉香dna数量和质量，避免了ctab法提取效果不稳定、进口试剂盒(如qiagen、omega)昂贵且提取率较低，传统ptb法提取时间久(5-7天)且提取过程会引入酚、多肽及碳水化合物的干扰的缺点；(2)沉香样品中大量的蛋白质、多糖、酚类、色酮类等物质将会干扰沉香dna的提取，本发明在加入dna提取液前，首先顺序加入鞣酸和壳聚糖进行预处理，经过该预处理步骤降低抑制物对沉香dna提取的影响；(3)在水浴温浴步骤对温度和反应时间进行调整，采用了多级裂解的方式，提高dna提取效率；(4)本发明使用的样品量较少，0.1-0.2g样品即可满足基因组dna的提取。这种微创检测方法更适合珍贵的沉香及沉香珍贵品的dna提取，避免了大面积破坏实物；(5)本发明也适合从沉香深加工过程中的残留物中有效的提取到dna；(6)本发明所述方法操作步骤简单，所提取的dna符合下游应用的要求，实用性强，可进行规模化操作。附图说明图1是本发明实施例1提取的沉香总dna吸收波谱；图2是本发明实施例1提取的沉香总dna及pcr扩增电泳图；图1、2中，最左侧为dnamarker，1、2、3、4分别为白木干燥木材、浸出物含量10％沉香、浸出物含量30％沉香及水浴加热6h残留物沉香样品。图3是不同提取方法的沉香总dna电泳图；图4是不同提取方法沉香总dna的its2序列pcr扩增电泳图；图3、4中，最左侧为dnamarker，1、2、3、4和5分别为浸出物含量为15％-20％的沉香样品。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验用试剂：ctab(十六烷基三甲基铵)、tris-hcl(ph＝8.0)、edta(ph＝8.0)、nacl、pvp-40(聚乙烯吡咯烷酮)、ptb、醋酸铵、蛋白酶k、β-巯基乙醇、氯仿异戊醇(24:1)、无水乙醇、80％乙醇、te缓冲液、琼脂糖、1×tbe液、dnamaker、dnaladdingbuffer、核酸染料、壳聚糖和鞣酸。所用的te缓冲液组分：10mmtris-hcl和1mmedta混合液(ph＝8.0)。本发明实施例中所述dna提取液为3％ctab、100mmtris-hcl、2mmedta、1.4mmnacl、1％pvp-40、0.3mptb、10mg/ml蛋白酶k及β-巯基乙醇；所述的dna分离液为24:1的氯仿-异戊醇；所述的dna沉淀液为异丙醇或无水乙醇；所述的dna洗涤液包括5-8m的乙酸铵；所述的dna溶解液为水或te液。实施例1：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：(1)取200mg的干燥白木香木材，经75％酒精擦拭表面和去除表面污垢，晾干，切碎，置于5ml离心管中，加入液氮充分封口研磨5min。(2)迅速加入1000μl预热的dna提取液，摇匀；60℃水浴温浴8h，期间晃动离心管数次；加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下9000rpm离心20min。(3)将步骤(2)所得上清液转移至新的5ml离心管中，确保不吸入残渣；加入2倍体积的dna沉淀液，抽吸混匀，-20℃静置18h。(4)取出步骤(3)的离心管室温冷却，加入等体积的dna洗涤剂，冰浴5min，吸取650μl溶液至dna吸附柱放置在2ml收集管中，10000rmp离心1min，弃去收集管的液体，剩余样品重复此过程。(5)将步骤(4)的吸附柱放置在新的收集管中，加入650μl的80％乙醇，10000rmp离心1min，弃去收集管离心液，重复2次，再12000rpm离心1min。(6)将步骤(5)中的dna吸附柱放在新的1.5ml离心管上，开盖，放置2min。向dna吸附柱中加入100μl的预热的无菌水或te液，温浴2min，离心，重复此步骤。在nanodrop2000dna浓度测定仪测定浓度和纯度。(7)吸取步骤(6)所得沉香总dna作为dna模板，进行定向pcr扩增。pcr结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr反应体系为：(1)反应总体积25μl；(2)2×easytaqpcrsupermix(-dye)(+dye)12.5μl；(3)10mm引物(i2f、i2r)各1μl；(4)ddh2o8.5μl；(5)dna模板2μl。用于扩增rrna编码基因片段its2的一对通用引物序列：(1)上游引物i2f：5’-atgcgatacttggtgtgaat-3’；(2)下游引物i2r：5’-gacgcttctccagactacaat-3’；(3)预期扩增产物产物片段长度为500bp。pcr扩增程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。沉香总dna的浓度和纯度检测：分别取白木香干燥木材、浸出物含量10％沉香、浸出物含量30％沉香、水浴加热6h残留物沉香为样品，参照实施例1的方法，测定浓度和纯度，结果见表1、图1-图2。表1本发明提取沉香总dna的浓度和纯度根据实验结果可知，采用本发明实施例1方法提取不同沉香样品所得的总dna浓度达到96.6-499.8ng/μl，a260/a280值1.87-2.11。经pcr扩增后，在500nm处获得清晰条带。实施例2：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：(1)取200mg的干燥白木香木材，经漂白剂擦拭表面和去除表面污垢，晾干后切碎置于5ml离心管中，加入液氮充分封口研磨5min。(2)迅速加入2000μl预热的dna提取液，摇匀；50℃水浴温浴3h，期间晃动离心管数次；加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下4500rpm离心1min。(3)将步骤(2)所得上清液转移至新的5ml离心管中，确保不吸入残渣；加入2倍体积的dna沉淀液，抽吸混匀，-20℃静置12h。(4)取出步骤(3)的离心管室温冷却，加入等体积的dna洗涤剂，冰浴10min，吸取650μl溶液至dna吸附柱放置在2ml收集管中，4500rmp，离心20min，弃去收集管的液体，剩余样品重复此过程。(5)将步骤(4)的吸附柱放置在新的收集管中，加入650μl的70％乙醇，4500rmp，离心20min，弃去收集管离心液，重复1次，再4500rpm，离心20min。(6)将步骤(5)中的dna吸附柱放在新的1.5ml离心管上，开盖，放置1min。向dna吸附柱中加入100μl的预热的无菌水或te液，温浴1min，离心，重复此步骤。在nanodrop2000dna浓度测定仪测定浓度和纯度。(7)吸取步骤(6)所得沉香总dna作为dna模板，进行定向pcr扩增。pcr结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr反应体系为：(1)2×easytaqpcrsupermix(-dye)(+dye)15μl；(2)10mm引物(i2f、i2r)各2μl；(3)dna模板1200ng。以ddh2o补充体积至50μl；用于扩增rrna编码基因片段its2的一对通用引物序列：(1)上游引物i2f：5’-atgcgatacttggtgtgaat-3’；(2)下游引物i2r：5’-gacgcttctccagactacaat-3’；(3)预期扩增产物产物片段长度为500bp。pcr扩增程序包括：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，55个循环；72℃延伸20min。实施例3：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：(1)分别取100mg的干燥白木香木材，经75％酒精擦拭表面和去除表面污垢，晾干后切碎，置于5ml离心管中，加入液氮充分封口研磨5min。(2)迅速加入500μl预热的dna提取液，摇匀。65℃水浴温浴8h，期间晃动离心管数次。加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下12000rpm离心1min。(3)将步骤(2)所得上清液转移至新的5ml离心管中，确保不吸入残渣。加入2倍体积的dna沉淀液，抽吸混匀，-20℃静置12h。(4)取出步骤(3)的离心管室温冷却，加入等体积的dna洗涤剂，冰浴10min，吸取650μl溶液至dna吸附柱放置在2ml收集管中，12000rmp，离心10min，弃去收集管的液体，剩余样品重复此过程。(5)将步骤(4)的吸附柱放置在新的收集管中，加入650μl的80％乙醇，12000rmp离心5min，弃去收集管离心液，重复2次，再10000rpm离心5min。(6)将步骤(5)中的dna吸附柱放在新的1.5ml离心管上，开盖，放置2min。向dna吸附柱中加入100μl的预热的无菌水或te液，温浴2min，离心，重复此步骤。在nanodrop2000dna浓度测定仪测定浓度和纯度。(7)吸取步骤(6)所得沉香总dna作为dna模板，进行定向pcr扩增。pcr结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr反应体系为：(1)2×easytaqpcrsupermix(-dye)(+dye)10μl；(2)10mm引物(i2f、i2r)各1μl；(3)dna模板5ng。以ddh2o补充反应总体积至15μl；用于扩增rrna编码基因片段its2的一对通用引物序列：(1)上游引物i2f：5’-atgcgatacttggtgtgaat-3’；(2)下游引物i2r：5’-gacgcttctccagactacaat-3’；(3)预期扩增产物产物片段长度为500bp。pcr扩增程序包括：95℃预变性0.4min；94℃变性0.4min，50℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，35个循环；72℃延伸5min。实施例4：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：步骤(2)：向步骤(1)所得样品中加入3％的鞣酸溶液3ml，摇匀，静置5min，加入2mg壳聚糖，摇匀，静置，再加1000μl预热dna提取液，混匀后60℃水浴温浴6h，室温冷却，期间晃动离心管数次；加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下4500rpm离心1min。其余步骤与实施例1相同。实施例5：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：步骤(2)为：向步骤(1)所得样品中加入3％的鞣酸溶液3ml，摇匀，静置5min，加入2mg壳聚糖，摇匀，静置，迅速加入1000μl预热的dna提取液，摇匀，60℃温浴2h，然后降温至50℃温浴1h，再升温至65℃温浴5h，期间晃动离心管数次；加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下9000rpm离心20min。其余步骤与实施例1相同。实施例6：一种用于沉香高质量dna的提取方法，其步骤为：步骤(2)为：向步骤(1)所得样品中加入3％的鞣酸溶液3ml，摇匀，静置5min，加入2mg壳聚糖，摇匀，静置，迅速加入1000μl预热的dna提取液，摇匀，65℃温浴1h，然后降温至60℃温浴2h，再升温至65℃温浴1h，期间晃动离心管数次；加入等体积的dna分离液，涡旋30s，室温下9000rpm离心20min。其余步骤与实施例1相同。沉香总dna的浓度和纯度检测：分别取实施例1-6中步骤(6)所得沉香总dna，测定浓度和纯度，结果见表2。表2本发明实施例1-6提取沉香总dna的浓度和纯度浓度ng/μla260/a280比值实施例1499.81.92实施例2450.62.05实施例3474.82.01实施例4504.61.87实施例5517.61.85实施例6516.41.87对比例：不同方法提取沉香总dna1、改良ctab法(1)分别吸取0.2g沉香样品置5ml离心管中经液氮研磨成粉，加1000μl预热的3％ctab提取缓存液，混合均匀后65℃水浴8h，期间不时的晃匀，待室温。(2)向离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次，9000rpm，离心10min。(3)将步骤(2)两次的上清液转移至5ml离心管，加等体积的预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃过夜。(3)取出步骤(3)的样品，恢复至室温，9000rpm，离心10min，弃去上清液，用ctab洗涤缓冲液500μl冲洗2次，离心后吸取液体，室温干燥。(4)用500μl的70％乙醇洗涤2次，弃去上清液，室温下干燥。(5)加入50μl无菌水溶解干燥后的dna，重复1次。2、omegahpplantdnakitdna提取试剂盒取0.2g沉香样品置5ml离心管中经液氮研磨成粉，除步骤(1)加入预热的1000μl的cpl和10μlβ-巯基乙醇外，其余步骤按制造商说明书执行。3、ptb法(1)取0.2g沉香置5ml离心管中经液氮研磨的沉香粉末，加1ml的0.5m的edta完全浸泡粉末，室温下放置48h，使其脱矿质。(2)加500μl蛋白酶k和1mlptb溶液，涡旋混匀，65℃水浴12h。(3)用等体积的苯酚:氯仿(1:1)抽提，12000rpm离心10min，上清液转移至新的2ml离心管。(4)向步骤(3)中加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，12000rpm离心10min，吸取上清液至新的2ml离心管，重复此过程。(5)加入2倍体积的预冷的无水乙醇和550μl的7.5m醋酸铵，混匀。-20℃存贮12h，沉淀dna。(6)待恢复至室温，12000rmp离心20min，弃去液体，加300μl的80％乙醇洗涤2次，并用80％乙醇沉淀过夜。(7)12000rpm离心20min，弃去液体，室温干燥，加入100μl无菌水溶解dna。检测方法：取2μl沉香总dna在nanodrop2000dna浓度测定仪测定浓度和纯度，再用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，分别取沉香总dna样品或pcr扩增产物和2μldnaladdingbuffer混匀点样，电泳15min，在凝胶成像仪下观察。结果见表3和图3-4。表3不同提取方法沉香总dna浓度和纯度结果表明，与不同的提取方法对比，采用本发明方法，所得沉香总dna的浓度和纯度均较高，经pcr扩增后，5个样品均能得到清晰条带。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。当前第1页12