本发明涉及一种蛋白制剂的纯化方法，确切讲本发明涉及一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，特别是一种破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂的纯化方法。
背景技术：
破伤风(tetanus)是破伤风梭菌经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生毒素而引起肌痉挛的一种特异性感染。因各种原因造成深部创伤的患者，均给予预防或治疗破伤风的药物，一般为破伤风抗毒素。破伤风抗毒素是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制成的液体抗毒素球蛋白制剂。
破伤风抗毒素的生产具有悠久的历史，其生产技术也一直发展变化。破伤风抗毒素的制造方法前后经历过三个发展阶段，最初阶段的“原制血清”制品质量差，不良反应发生率高。第二个阶段制备的“浓制血清”，去除了大部分杂蛋白并使抗毒素蛋白得到了一定的浓缩，质量有较大的改进。第三个阶段是精制抗毒素阶段，自20世纪30年代创建，引入了胃酶消化，加温变性工艺，20世纪80年代在此基础上引入了超滤技术，把胃酶消化、硫酸铵盐析、超滤技术组成一个新的抗毒素生产工艺，即为现有技术中的硫酸铵沉淀工艺，此工艺使制品的外观、透明度、纯度等均有了较大的提高。(参见《医学生物制品学》，第二版，人民卫生出版社，1144)
现有技术中的硫酸铵沉淀工艺是生产破伤风抗毒素的通用方法。其原理为高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。该工艺属于粗放提纯过程，纯化的破伤风抗毒素蛋白含量高、比活性低。
随着层析技术的发展，在硫酸铵沉淀工艺基础上增加离子交换层析技术，破伤风抗毒素随之升级换代为破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2。离子交换层析是利用蛋白质所带电荷的不同来分离蛋白质，采用不同的ph和(或)离子强度的缓冲液洗脱，使带不同电荷的蛋白质分离。增加离子交换层析工艺后，产品比活性得到了一定幅度的提高，但离子交换层析工艺属于非特异性吸附，不具有专一性，产品的比活性提高幅度有限。关于离子交换层析工艺参见申请号为201610492044.x、名称为《一种无防腐剂的马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法》的中国发明专利申请。
技术实现要素：
本发明提供了一种克服现有技术不足的蛋白制剂的纯化方法。
本发明的免疫球蛋白制剂的纯化方法是将经胃酶消化、硫酸铵沉淀、超滤处理后的蛋白用免疫亲和层析进行纯化。
本发明所述的免疫球蛋白制剂的纯化方法特别适用于破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2。
优选地，本发明所涉及的免疫球蛋白是破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2，其免疫亲和层析所用的层析介质为破伤风类毒素与载体偶联。本发明优先的载体为预活化的琼脂糖凝胶，特别是nhs-activatedsepharose4fastflow、cnbr-activatedsepharose4b、epoxy-activatedsepharose6b、cnbr-activatedsepharose4fastflow、cnbr-activatedsepharose6mb、cnbr-activatedbestarose4fastflow、cnbr-activatedbestarose4b、nhs-activatedbestarose4fastflow或epoxy-activatedbestarose6b。
优选地，本发明所涉及的免疫球蛋白制剂的纯化方法是：先清洗载体，再将载体与配基缓冲体系均置换为ph8.3的0.1mnahco3含0.5mnacl溶液，然后将载体与配基混合在室温下振荡1～4小时或4℃条件下过夜后装柱，使用ph8.3的0.1mnahco3含0.5mnacl溶液冲洗层析柱去除未结合配基，再分别依次用ph8.0的0.1mtris-hcl缓冲液、ph8.0～9.0的0.1mtris-hcl含0.5mnacl缓冲液和ph3.0～4.0的0.1mhac含0.5mnacl缓冲液冲洗层析柱，再将破伤风马免疫血浆经胃酶消化、硫酸铵沉淀、超滤处理后加载到层析柱中，用平衡缓冲液冲洗层析柱至紫外吸收值达到基线，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2溶液，用30～50kd的超滤膜超滤置换缓冲体系至超滤浓缩液蛋白含量为10～40g/l，所述平衡缓冲液为20～50mmpb，含0.1～0.5mnacl，ph7.0±0.2；所述洗脱缓冲液为0.1～0.5mhac溶液、0.1～0.5mhac含0.1～0.5mnacl溶液、0.05～0.5mgly-hcl溶液或0.05～0.5mgly-hcl含0.1～0.5mnacl溶液中的一种；所述超滤缓冲液为0.4％～0.7％nacl溶液。
本发明采用的免疫亲和层析技术属于特异性配体亲和层析，与现有技术相比更具专一性、高效性、特异性。制备得到的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂与现有技术相比具有高效价、高比活性的特点，且不依赖于高效价的原料血浆，提高了血浆的利用率，降低了血浆生产企业的成本。
附图说明
图1按照实施例3制备的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂亲和层析纯化图谱。
图2按照实施例3制备的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂superdex200increase10/300gl检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细阐述。后述内容中：m指物质的量浓度，单位为mol/l；iu/g指比活性的单位，表示每1g蛋白质所含的抗体效价。
以下实施例中，生产所用原料血浆的平均效价为1600iu/ml，未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
处理步骤如下：
a.破伤风马免疫血浆的预处理：常温下，将马免疫血浆用注射用水或0.85％氯化钠水溶液搅拌稀释2倍，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，然后按120g/l加入硫酸铵，温度调至25±1℃，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。上述滤液按100g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至6.8±0.2，温度调至25±1℃，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
b.胃酶消化：步骤a的沉淀物用注射用水或0.85％氯化钠水溶液溶解并搅拌稀释，稀释至体积为投产血浆量的2倍，调ph至3.2±0.2，加入胃酶，胃酶加量为每毫升溶液2个活力单位，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，在温度30±1℃下消化120min。
c.加温变性及一次沉淀：步骤b的溶液按120g/l加入硫酸铵，调ph至5.2±0.2，升温至57±1℃，保持30min。降温至35℃以下，按3g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
d.二次沉淀：步骤c的滤液按150g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至7.2±0.2，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
e.明矾沉淀：步骤d的沉淀用注射用水按投产血浆量的1倍溶解并搅拌稀释，按82ml/l加入10％硫酸铝钾溶液，调ph至7.8±0.2，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
f.超滤：步骤e的滤液澄清过滤后，用30kd的超滤膜超滤至硫酸铵含量≤1.0g/l，超滤浓缩液蛋白含量为30g/l。所述的超滤缓冲液为20mmpb，含0.1mnacl，ph7.0±0.2。
g.配基偶联并装柱：用载体偶联配基(破伤风类毒素，tt)。具体过程如下：
1)载体处理：用a缓冲液按说明书处理载体；
2)配基处理：用b缓冲液置换配基的缓冲体系；
3)载体与配基偶联：将处理好的载体与配基溶液混合，室温振荡1～4h或4℃过夜，然后将偶联好的介质装柱，用b缓冲液冲洗5～10个柱体积；
4)封闭：用c缓冲液低流速冲洗层析柱5～10个柱体积，封闭未结合位点；
5)清洗：用5～10个柱体积的d缓冲液和e缓冲液交替清洗层析柱3～6个循环；
所述的a缓冲液为：1mmhcl溶液，ph3.0；
b缓冲液为：0.1mnahco3含0.5mnacl溶液，ph8.3；
c缓冲液为：0.1mtris-hcl缓冲液，ph8.0；
d缓冲液为：0.1mtris-hcl含0.5mnacl缓冲液，ph8.0～9.0；
e缓冲液为：0.1mhac含0.5mnacl缓冲液，ph3.0～4.0；
h.柱层析纯化：g步骤装好的层析柱用平衡缓冲液平衡5～10个柱体积，然后将步骤f得到的超滤浓缩液加载至平衡好的层析柱中，加载流速为150cm/h。加载完毕用步骤f所述的缓冲液冲洗层析柱至紫外吸收值达到基线，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2溶液；用30kd超滤膜超滤置换缓冲体系至超滤浓缩液蛋白含量为10～40g/l。所述平衡缓冲液为20mmpb，含0.1mnacl，ph7.0±0.2；所述洗脱缓冲液为0.1mhac溶液、0.1mhac含0.1mnacl溶液、0.05mgly-hcl溶液、0.05mgly-hcl含0.1mnacl溶液中的一种；所述超滤缓冲液为0.7％nacl溶液。
i.原液制备：将上述h步骤的洗脱液调ph至6.0～7.0，按9.0g/l加入甘氨酸，氯化钠含量为7.0g/l，除菌过滤后即为原液，置于2～8℃保存。
j.半成品配制分装：将i步骤的原液用稀释液稀释至效价≥2000iu/ml，除菌过滤，分装，得到一种高效价、高比活性的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂。所述稀释液为0.9％甘氨酸溶液，含0.7％nacl。
实施例2
处理步骤如下：
a.破伤风马免疫血浆的预处理：常温下，将马免疫血浆用注射用水或0.85％氯化钠水溶液搅拌稀释3倍，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，然后按170g/l加入硫酸铵，温度调至25±1℃，持续搅拌120min，静置180min。开启搅拌，按10g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。上述滤液按140g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至6.8±0.2，温度调至25±1℃，持续搅拌120min，静置180min。开启搅拌，按10g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
b.胃酶消化：步骤a的沉淀物用注射用水或0.85％氯化钠水溶液溶解并搅拌稀释，稀释至体积为投产血浆量的3倍，调ph至3.2±0.2，加入胃酶，胃酶加量为每毫升溶液8个活力单位，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，在温度30±1℃下消化60min。
c.加温变性及一次沉淀：步骤b的溶液按170g/l加入硫酸铵，调ph至5.2±0.2，升温至57±1℃，保持30min。降温至35℃以下，按10g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
d.二次沉淀：步骤c的滤液按200g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至7.2±0.2，持续搅拌120min，静置180min。开启搅拌，按10g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
e.明矾沉淀：步骤d的沉淀用注射用水按投产血浆量的2倍溶解并搅拌稀释，按82ml/l加入10％硫酸铝钾溶液，调ph至7.8±0.2，持续搅拌120min，静置180min。开启搅拌，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
f.超滤：步骤e的滤液澄清过滤后，用50kd的超滤膜超滤至硫酸铵含量≤1.0g/l，超滤浓缩液蛋白含量为70g/l。所述的超滤缓冲液为50mmpb，含0.5mnacl，ph7.0±0.2。
g.配基偶联并装柱：用载体偶联配基(破伤风类毒素，tt)。具体过程如下：
1)载体处理：用a缓冲液按说明书处理载体；
2)配基处理：用b缓冲液置换配基的缓冲体系；
3)载体与配基偶联：将处理好的载体与配基溶液混合，室温振荡1～4h或4℃过夜，然后将偶联好的介质装柱，用b缓冲液冲洗5～10个柱体积；
4)封闭：用c缓冲液低流速冲洗层析柱5～10个柱体积，封闭未结合位点；
5)清洗：用5～10个柱体积的d缓冲液和e缓冲液交替清洗层析柱3～6个循环；
所述的a缓冲液为：1mmhcl溶液，ph3.0；
b缓冲液为：0.1mnahco3含0.5mnacl溶液，ph8.3；
c缓冲液为：0.1mtris-hcl缓冲液，ph8.0；
d缓冲液为：0.1mtris-hcl含0.5mnacl缓冲液，ph8.0～9.0；
e缓冲液为：0.1mhac含0.5mnacl缓冲液，ph3.0～4.0；
h.柱层析纯化：g步骤装好的层析柱用平衡缓冲液平衡5～10个柱体积，然后将步骤f得到的超滤浓缩液加载至平衡好的层析柱中，加载流速为250cm/h。加载完毕用步骤f所述的缓冲液冲洗层析柱至紫外吸收值达到基线，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2溶液；用50kd超滤膜超滤置换缓冲体系至超滤浓缩液蛋白含量为10～40g/l。所述平衡缓冲液为50mmpb，含0.5mnacl，ph7.0±0.2；所述洗脱缓冲液为0.5mhac溶液、0.5mhac含0.5mnacl溶液、0.5mgly-hcl溶液、0.5mgly-hcl含0.5mnacl溶液中的一种；所述超滤缓冲液为0.4％nacl溶液。
i.原液制备：将上述h步骤的洗脱液调ph至6.0～7.0，按11.0g/l加入甘氨酸，氯化钠含量为4.0g/l，除菌过滤后即为原液，置于2～8℃保存。
j.半成品配制分装：将i步骤的原液用稀释液稀释至效价≥2000iu/ml，除菌过滤，分装，得到一种高效价、高比活性的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂。所述稀释液为1.1％甘氨酸溶液，含0.4％nacl。
实施例3
处理步骤如下：
a.破伤风马免疫血浆的预处理：常温下，将马免疫血浆用注射用水或0.85％氯化钠水溶液搅拌稀释2.5倍，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，然后按150g/l加入硫酸铵，温度调至25±1℃，持续搅拌60min，静置120min。开启搅拌，按7g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。上述滤液按120g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至6.8±0.2，温度调至25±1℃，持续搅拌60min，静置120min。开启搅拌，按7g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
b.胃酶消化：步骤a的沉淀物用注射用水或0.85％氯化钠水溶液溶解并搅拌稀释，稀释至体积为投产血浆量的2.5倍，调ph至3.2±0.2，加入胃酶，胃酶加量为每毫升溶液5个活力单位，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，在温度30±1℃下消化90min。
c.加温变性及一次沉淀：步骤b的溶液按150g/l加入硫酸铵，调ph至5.2±0.2，升温至57±1℃，保持30min。降温至35℃以下，按7g/l加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
d.二次沉淀：步骤c的滤液按180g/l搅拌加入硫酸铵，调ph至7.2±0.2，持续搅拌60min，静置120min。开启搅拌，按7g/l加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。
e.明矾沉淀：步骤d的沉淀用注射用水按投产血浆量的1.5倍溶解并搅拌稀释，按82ml/l加入10％硫酸铝钾溶液，调ph至7.8±0.2，持续搅拌60min，静置120min。开启搅拌，过滤，收集滤液，废弃沉淀。
f.超滤：步骤e的滤液澄清过滤后，用50kd的超滤膜超滤至硫酸铵含量≤1.0g/l，超滤浓缩液蛋白含量为50g/l。所述的超滤缓冲液为40mmpb，含0.3mnacl，ph7.0±0.2。
g.配基偶联并装柱：用载体偶联配基(破伤风类毒素，tt)。具体过程如下：
1)载体处理：用a缓冲液按说明书处理载体；
2)配基处理：用b缓冲液置换配基的缓冲体系；
3)载体与配基偶联：将处理好的载体与配基溶液混合，室温振荡1～4h或4℃过夜，然后将偶联好的介质装柱，用b缓冲液冲洗5～10个柱体积；
4)封闭：用c缓冲液低流速冲洗层析柱5～10个柱体积，封闭未结合位点；
5)清洗：用5～10个柱体积的d缓冲液和e缓冲液交替清洗层析柱3～6个循环；
所述的a缓冲液为：1mmhcl溶液，ph3.0；
b缓冲液为：0.1mnahco3含0.5mnacl溶液，ph8.3；
c缓冲液为：0.1mtris-hcl缓冲液，ph8.0；
d缓冲液为：0.1mtris-hcl含0.5mnacl缓冲液，ph8.0～9.0；
e缓冲液为：0.1mhac含0.5mnacl缓冲液，ph3.0～4.0；
h.柱层析纯化：g步骤装好的层析柱用平衡缓冲液平衡5～10个柱体积，然后将步骤f得到的超滤浓缩液加载至平衡好的层析柱中，加载流速为200cm/h。加载完毕用步骤f所述的缓冲液冲洗层析柱至紫外吸收值达到基线，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2溶液；用50kd超滤膜超滤置换缓冲体系至超滤浓缩液蛋白含量为10～40g/l。所述平衡缓冲液为40mmpb，含0.3mnacl，ph7.0±0.2；所述洗脱缓冲液为0.3mhac溶液、0.3mhac含0.3mnacl溶液、0.3mgly-hcl溶液、0.3mgly-hcl含0.3mnacl溶液中的一种；所述超滤缓冲液为0.5％nacl溶液。
i.原液制备：将上述h步骤的洗脱液调ph至6.0～7.0，按10.0g/l加入甘氨酸，氯化钠含量为5.0g/l，除菌过滤后即为原液，置于2～8℃保存。
j.半成品配制分装：将i步骤的原液用稀释液稀释至效价≥2000iu/ml，除菌过滤，分装，得到一种高效价、高比活性的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂。所述稀释液为1.0％甘氨酸溶液，含0.5％nacl。
实施例1、实施例2和实施例3中的工艺参数分别是对应工艺参数的上限、中间值和下限，其结果均符合预期要求。下面仅以实施例3制备的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂进行说明，检定结果见表1、表2及图1、图2所示。
表1三批破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂检定结果
本发明实施例3制备出的三批制品，经6个月加速稳定性研究考察，制品各项检定结果均符合药典要求，证明本发明技术可行，三批制品稳定性研究结果见表2：
表2破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂稳定性研究结果
本发明实施例3的制品与现有技术制品比活性比较见表3所示：
表3实施例3与现有技术制备的制品比活性比较
注：表中离子交换层析制品的数据来源于发明专利申请《一种无防腐剂的马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法》，申请号为201610492044.x。硫酸铵沉淀制品数据来源于本单位硫酸铵沉淀工艺生产数据。
本发明所采用的免疫亲和层析工艺，生产所用原料血浆的平均效价为1600iu/ml，所生产出的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2平均比活性为186277iu/g。现有技术中的硫酸铵沉淀工艺,生产所用原料血浆的平均效价为1600iu/ml，所生产的破伤风抗毒素平均比活性为55564iu/g。离子交换层析工艺生产所用原料血浆的平均效价为3000iu/ml，所生产的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2平均比活性为91606iu/g(离子交换层析工艺制品数据源自申请号为201610492044.x、名称为《一种无防腐剂的马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法》的发明专利申请)。
本发明与现有技术相比的优势：
1、本发明采用的免疫亲和层析技术属于特异性配体亲和层析，与现有技术相比更具专一性、高效性、特异性。
2、本发明制备的破伤风马免疫球蛋白f(ab’)2制剂与现有产品相比具有高效价、高比活性的特点。
3、本发明制备工艺不依赖于高效价的原料血浆，提高了血浆的利用率，降低了血浆生产企业的成本。
以上实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。