本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测慢性淋巴细胞性白血病基因多态性位点的引物及其检测方法。
背景技术：
慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll)是机体的淋巴细胞在体内异常增生和积蓄伴有免疫功能低下的疾病。由于慢淋患者淋巴细胞寿命极长，并经常伴有免疫反应缺陷，故又称“免疫无能淋巴细胞蓄积病”。与其他白血病相比，慢性淋巴细胞白血病更容易有家族倾向。有cll或其他淋巴系统恶性疾病家族史者，直系亲属发病率较一般人群高3倍。cll患者的亲属自身免疫病的发生率也明显增加。因此，早期的预测预防和早期诊断对慢性淋巴细胞性白血病的防治有着重大意义。
疾病的遗传易感基因检测是当前国内外的热点。而在遗传因素的易感基因检测中，采用单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphsm,snp)作为基因组标志的关联分析方法较为有效和常用。snp是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的dna序列多态性，在人群中的发生频率大于1％。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。snp遗传稳定性强，易于检测。位于基因内部的snp能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。在慢性淋巴细胞性白血病人群和正常对照人群中进行snp对比分析，可以确定相关基因多态性与疾病患病风险的关系。通过受检者的血液或者其他体液对慢性淋巴细胞性白血病易感基因中的关键性基因的遗传位点进行检测，能有效地为慢性淋巴细胞性白血病的预测、预防、诊断和治疗提供依据和指导。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测慢性淋巴细胞性白血病基因多态性位点的引物及其检测方法，通过受检者的血液对卵巢癌易感基因中的关键性基因的遗传位点进行检测，能有效地为卵巢癌的预测、预防提供依据和指导。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测卵巢癌基因多态性位点的引物，引物包括rs17483466位点的引物、rs13397985位点的引物、rs7176508位点的引物以及rs872071位点的引物，各引物的具体序列如下：
rs17483466-上游引物：5′-ggatctctgaatacttggta-3′；(seqidno.1)
rs17483466-下游引物：5′-cagaatccacagataagaag-3′；(seqidno.2)
rs13397985-上游引物：5′-agttctcccttcattgg-3′；(seqidno.3)
rs13397985-下游引物：5′-gtcttaaactgctcaggat-3′；(seqidno.4)
rs7176508-上游引物：5′-ggtctcctttacagcaag-3′；(seqidno.5)
rs7176508-下游引物：5′-ctcagaccctctcttttc-3′；(seqidno.6)
rs872071-上游引物：5′-ctctcagaccttacacacc-3′；(seqidno.7)
rs872071-下游引物：5′-gcagttctttcagcaga-3′。(seqidno.8)
一种检测卵巢癌基因多态性位点的方法，包括以下步骤：
(1)提取受检者全基因组dna；
(2)以步骤(1)中所得dna为模板，采用权利要求1中所述引物对其进行pcr扩增；
(3)回收扩增产物，并进行浓度测定，计算模板量，再次进行pcr扩增并对扩增产物进行纯化，最后通过序列分析仪对snp分型进行分析确定。
进一步地，步骤(2)中pcr扩增的扩增体系为：primerstarmax12.5μl、primerf1.5μl、primerr1.5μl、dna2μl，最后用h2o补足至25μl。
进一步地，步骤(2)中pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸2min后于4℃保存。
进一步地，步骤(3)中pcr扩增的扩增体系为：dtcsmastermix2.5μl、primerr1.0μl、模板dna3μl，最后用灭菌超纯水补足至10μl。
进一步地，步骤(3)中pcr扩增的反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于检测慢性淋巴细胞性白血病易感基因多态性位点的引物，设计的引物具有特异性高、准确性好等优点，根据设计的引物进行目的基因pcr扩增，用sanger测序准确的测定人慢性淋巴细胞性白血病易感基因中的多态性位点基因型，根据基因型结果预测受检者患慢性淋巴细胞性白血病的风险几率，对慢性淋巴细胞性白血病的预测和预防具有重大意义。
附图说明
图1为pcr电泳检测图；
图2为采用贝克曼gexp测序仪检测rs17483466位点的测序峰图；
图3为采用贝克曼gexp测序仪检测rs13397985位点的测序峰图；
图4为采用贝克曼gexp测序仪检测rs7176508位点的测序峰图；
图5为采用贝克曼gexp测序仪检测rs872071位点的测序峰图；
图6为采用abi测序仪3730检测rs17483466位点的测序峰图；
图7为采用abi测序仪3730检测rs13397985位点的测序峰图；
图8为采用abi测序仪3730检测rs7176508位点的测序峰图；
图9为采用abi测序仪3730检测rs872071位点的测序峰图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
1、设计引物
采用引物设计软件primer5.0设计出用于检测acoxl基因的rs17483466位点、sp140基因的rs13397985位点、loc145837-gemin8p1基因的rs7176508位点以及irf4基因的rs872071位点的引物，各引物的具体序列如下：
rs17483466-上游引物：5′-ggatctctgaatacttggta-3′；(seqidno.1)
rs17483466-下游引物：5′-cagaatccacagataagaag-3′；(seqidno.2)
rs13397985-上游引物：5′-agttctcccttcattgg-3′；(seqidno.3)
rs13397985-下游引物：5′-gtcttaaactgctcaggat-3′；(seqidno.4)
rs7176508-上游引物：5′-ggtctcctttacagcaag-3′；(seqidno.5)
rs7176508-下游引物：5′-ctcagaccctctcttttc-3′；(seqidno.6)
rs872071-上游引物：5′-ctctcagaccttacacacc-3′；(seqidno.7)
rs872071-下游引物：5′-gcagttctttcagcaga-3′。(seqidno.8)
其中，rs17483466位点的rs码见seqidno.9；rs13397985位点的rs码见seqidno.10；rs7176508位点的rs码见seqidno.11；rs872071位点的rs码见seqidno.12。
2、dna提取
用edta抗凝管采集受检者外周血3.0ml，然后通过天根血液基因组提取试剂盒提取受检者全基因组dna，提取过程按试剂盒说明书进行，再用超微量蛋白核酸分析仪(柏精biodropμlite)检测提取得到的dna的浓度及纯度，然后将满足要求的dna保存于-20℃的冰箱中，备用。
3、基因多态性位点检测
(1)pcr扩增：以步骤2中提取得到的dna为模板，采用步骤1中设计的引物进行pcr扩增，其反应体系见表，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸2min后于4℃保存。
表1pcr反应体系
pcr完成后，将扩增产物于4℃保存备用。
(2)电泳：取25μl的pcr扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳验证(图1)，发现目的条带清晰，无杂带，且片段大小与设计的大小一致，表明设计的引物特异性好，其中，1、2、3孔为acoxl基因的rs17483466位点；4、5、6孔为sp140基因的rs13397985位点；7、8、9为loc145837-gemin8p1基因的rs7176508位点；10、11、12孔为irf4基因的rs872071位点；rs13397985位点和rs7176508位点的条带大小一样。
(3)回收：用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒回收扩增产物，操作步骤按试剂盒说明书进行；并检测回收得到的目的片段的浓度。
(4)标记：取一只干净的0.2mlpcr管，依次加入：pcrmix、测序引物、灭菌超纯水、模板dna。其中模板dna和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的dna浓度决定，反应体系10(μl)与扩增条件分别见表2和表3。
表2标记反应体系
表3标记扩增程序
(5)纯化：取一只干净的pcr管，按体积比为2：2：1的比例依次加入3mna2oac(ph5.2)、0.1mna2edta(ph8.0)以及glycogen，配制成为终止液；
取上述终止液5μl加入到盛有步骤(4)所得pcr产物的pcr管中，充分混匀，瞬时离心；将液体转移至一只新的1.5mlep管中，再加入50μl预冷无水乙醇，充分混匀，放入-20℃的冰箱中冷冻10min；然后在12000rpm的条件下离心5min，除去上清液，向ep管加入150μl预冷70％乙醇，放入高速离心机中，在12000rpm离心2min，除去上清液；稍离心，用移液器吸干ep管内剩余的液体；打开ep管盖，37℃晾干至白色沉淀变透明；最后向ep管中加入25μl的sls(sampleloadingsolution)溶解dna，静置8min；瞬时离心；
(6)检测：将步骤(5)溶解制备得到的dna液体全部加入一块干净的96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，再加入半滴矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液；向胶槽加入超纯水至液体接近指示线；将96孔样品板、96孔缓冲液板、和胶槽装入gap测序仪，分别采用贝克曼gexp测序仪和abi测序仪3730进行检测，并通过序列分析软件(genomelabtmgexp(geneticanalysissystem))，将所测序列与标准序列进行比对，寻找snp位点，通过snp位点处碱基的类型，就可以得到snp位点的基因型，并保存分析图谱和原始检测结果，其中，贝克曼gexp测序仪的检测结果如图2、图3、图4和图5所示；abi测序仪3730的检测结果如图6、图7、图8和图9所示。
其中，图2和图6显示的均是acoxl基因rs17483466位点的测序峰图；其易感性位点为g，由此，acoxl基因的rs17483466位点的非易感基因型为tt，易感基因型为gt和gg，由图2和图6可知，基因型为tt，说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
图3和图7显示的均是sp140基因rs13397985位点的测序峰图；其易感性位点为g，由此，sp140基因的rs13397985位点的非易感基因型为aa，易感基因型为ag和gg，由图3和图7可知，基因型为aa，说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
图4和图8显示的均是loc145837-gemin8p1基因rs7176508位点的测序峰图；其易感性位点为a，由此，loc145837-gemin8p1基因的rs7176508位点的非易感基因型为gg，易感基因型为ag和aa，由图4和图8可知，基因型为gg，说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
图5和图9显示的均是rna5sp229基因rs872071的测序峰图；其易感性位点为g，由此，nf1b基因的rs872071的非易感基因型为aa，易感基因型为ag和gg，由图5和图9可知，基因型为aa，说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
序列表
<110>成都中创清科医学检验所有限公司
<120>一种用于检测慢性淋巴细胞性白血病基因多态性位点的引物及其检测方法
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