本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备，更具体涉及米卡芬净钠中间体fr901379的发酵方法。
背景技术
近年来，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染发病率明显升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比，该类药物具有作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素b耐药的真菌具有很强的抗菌活性，是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。fda已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)和阿尼芬净(anidulafungin)。米卡芬净药用盐为米卡芬净钠。
fr901379是合成米卡芬净类药物的重要前体物质，由c.empetri经突变后获得的高产菌株发酵所得。fr901379通过脱酰酶脱除侧链后得到米卡芬净母核fr179642，fr179642经过化学修饰得到米卡芬净钠。
fr901379的结构如下：
usp5502033、ep0431350a1公布了使用coleophomaempetrif-11899发酵生产fr901379的过程，发酵培养基包含基本的碳氮源、无机盐，单位100mg/l。cn201010571797.2公开了一种使用coleophomaempetrif-11899发酵生产fr901379的培养基，优化了碳源和有机氮源，单位提高到300～400mg/l。但现行的发酵生产fr901379的技术中，仍然存在由于发酵液中丝状菌的生长特性，发酵液黏度过高，氧传递效果较差，溶氧偏低，从而抑制了菌体次级代谢，导致fr901379发酵单位偏低的问题。
201010571797.2提供了一种用于菌株coleophomaempetrif-11899或其变体生产fr901379的发酵培养基，所述发酵培养基含有碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。发酵效价为300～400mg/l。
201611019780.x提供了一种发酵生产fr901379的培养基及其方法，该培养基的组成为果糖、玉米蛋白粉、干酪素、酵母蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙、消泡剂、水，进一步包括在发酵过程中补加果糖和双氧水，经过对发酵培养基的改良，fr901379的产量较高，单位达到3.0～3.4g/l。但是该方法发酵液营养过于丰富，放罐菌体生物量大，分离纯化成本较高。
基于对扩大生产，降低成本的需要，在米卡芬净的生产领域，仍然需要更优的fr901379的发酵方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种全新的fr901379的发酵方法。该方法在fr901379发酵过程中加入棕榈酸甲酯作为fr901379脂肪酸侧链前体物质，促进fr901379的生物合成。同时在发酵液中引入与反应液不相溶的二甲基硅油，棕榈酸甲酯除了作为发酵前体，也和二甲基硅油一起作为发酵体系中的氧载体，减少气液传氧阻力，解决了现有技术发酵过程溶氧不足的问题，提高了fr901379的发酵产量，降低了生产成本。
本发明使用的菌株来源为coleophomaempetrif-11899。本发明是这样实现的：
1)、采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵培养基的制备，例如，包括但不限于201010571797.2中公开的发酵培养基。
2)、将菌株coleophomaempetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵。
3)、在发酵培养24～72h后，向发酵液中补加3～10％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。所述棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物中，二甲基硅油所占质量体积比为5％～10％。
4)、当发酵160h后，fr901379的浓度不再增长时，发酵结束。
通过本发明方法，fr901379放罐浓度可达3.27-3.40g/l，且成本较低。
具体实施例
在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
实施例1
将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。
发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。
将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为10％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。
在发酵培养48h后，向发酵液中补加3％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。
发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.27g/l。
实施例2
将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。
发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。
将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为5％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。
在发酵培养48h后，向发酵液中补加10％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。
发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.39g/l。
实施例3
将培养好的种子以5％(v/v)比例转入30l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：葡萄糖50、棉籽饼粉20、酵母粉10、蛋白胨10、硫酸镁2、磷酸氢二钾1、碳酸钙4、消泡剂1，其余为水。
发酵过程中控制温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速150rpm，过程中调控转速150～600rpm之间使溶氧不低于20％。
将棕榈酸甲酯和二甲基硅油按照二甲基硅油所占质量体积比为8％配制成溶液120℃灭菌30min后待用。
在发酵培养48h后，向发酵液中补加8％质量体积比的棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物。
发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.40g/l。