本发明涉及生物技术领域，具体涉及喷雾干燥制备植物乳杆菌zj316细菌素的方法。
背景技术
细菌素是由乳杆菌产生的一种耐高温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒，且具有较强抑菌活性的抗菌短肽。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或低分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。
细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。
目前已发现多株产细菌素的乳酸菌，这些乳酸菌的分子量从几千到几万道尔顿不等，如lactocin27分子量为12400da，lactacinb分子量为6300da，plantaricinama-k分子量为2900da等，这些细菌素的共同点是，细菌素是一种小分子多肽，具有蛋白质的一些基本特性。细菌素的本质是多肽或蛋白质。在细菌素的保存中，为了避免其活性的降低，实验室多采用冷冻干燥的方法，但是这一方法成本高，处理量少，运输困难，并不适合工业化大规模制备细菌素。根据不同的细菌素的特点，细菌素的纯化方法也存在差异，且目前公开的传统方法纯化效果、收率和活力均不是很理想。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出喷雾干燥制备植物乳杆菌zj316细菌素的方法，该种方法通过喷雾干燥法制备具有高收率和高活力的细菌素。
本发明提出喷雾干燥制备植物乳杆菌zj316细菌素的方法，包括以下步骤：
（1）发酵：将植物乳杆菌zj316进行活化并发酵培养，得到发酵液；
（2）分离：将所述发酵液通过膜分离系统进行过滤，过滤后收集上清液；
（3）收集：向所述上清液中加入辅料；混合后通过喷雾干燥法进行收集，得到细菌素。
本发明采用膜分离系统进行分离纯化，不仅可以在常温下进行，而且大大降低了有效成分的损失，特别适用于细菌素的分离；典型的物理分离过程，不用化学试剂和添加剂，产品不受污染，产品活性不受化学试剂和添加剂的影响；在过滤过程中不会带入杂质，有助于后序收集，保证了收率。
喷雾干燥法是系统化技术应用于物料干燥的一种方法。于干燥室中将稀料经雾化后，在与热空气的接触中，水分迅速汽化，即得到干燥产品。该法能直接使溶液、乳浊液干燥成粉状或颗粒状制品，可省去蒸发、粉碎等工序。干燥过程非常迅速。可直接干燥成粉末。易改变干燥条件，调整产品质量标准。由于瞬间蒸发，设备材料选择要求不严格。
干燥室有一定负压，保证了制备过程中的卫生条件，避免粉尘飞扬，提高产品纯度。生产效率高，操作人员少。生产能力大，产品质量高。每小时喷雾量较大，是干燥器处理量较大者之一。
采用喷雾干燥法进行收集其目的是提高处理量，使产品具有更高的收率、更好的活力。由于只添加了已知辅料，而且辅料对细菌素活力具有一定的保护作用，在收集过程中避免了其他杂质的混入，不仅保证了产品的纯度，而且也大大的提高了产品的收率，同时因所喷出的物料只是在喷成雾状颗粒时才受到高温，故只是瞬间受热，能保持这些活性材料在干燥后仍维持其活性成份不受破坏，提高了产品活力。
进一步的，步骤（1）中采用指数补料的方式进行发酵培养。指数补料是最为有效的流加策略，它可以根据菌体密度的增加与发酵液体积的增大改变流加速率，同时可以控制恒定的比生长速率，从而控制副产物的形成，减小抑制作用，但是指数补料对环境的适应性和可调控性不强，不能根据发酵环境变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节，所以在发酵后期菌体生长停滞并出现下降趋势，发酵液中细菌素的活性也没有增长的趋势。
进一步的，步骤（2）中的所述膜分离系统为生物膜过滤系统，型号为赛多利斯16828。该型号过滤系统具有定量加样、避免空气二次污染的优点，从而为后序收集工作提供了良好的发酵液，保证了高收率、高活力。
进一步的，步骤（3）中的所述辅料与所述上清液的体积比为1：4.8～5.2。由于辅料对细菌素的得率、比活力和效价均有很大的影响，所以辅料的用量在收集过程中也是至关重要的。加入量越高细菌素的收率就会越高，但是当细菌素的比活力会随着加入量的升高而降低，而效价与加入量不构成线性关系，所以通过综合分析数据比对，选择辅料与所述上清液的体积比为1：4.8～5.2为最优值。
进一步的，步骤（3）中的所述辅料为食盐、奶粉和淀粉中的一种或多种。不同的辅料对细菌素的收率、比活力和效价也会产生不同的作用，食盐可以保证细菌素的收率和效价，奶粉会给细菌素带来较强的比活力，而淀粉能够有效提高细菌素的比活力。所以根据不同辅料对细菌素的不同影响，可以单独使用，也可多种混合使用，优化辅料对细菌素的影响，本发明为了得到较高的收率和效价，采用单一食盐为辅料，也可加入一定量的奶粉，提高比活力。
进一步的，步骤（3）中所述喷雾干燥法的进口温度为153～157℃。由于在低温时，不易干燥，水分蒸发不彻底，导致成型困难，得率低。高温时，水分蒸发快，成型迅速，损失小，得率高。但是温度过高时，会使细菌素失去活性，比活力降低。
进一步的，步骤（3）中所述喷雾干燥法的压缩气体流速为900～1000l/h。压缩气体流速小，产品不易干燥，水分蒸发不彻底，导致成型困难，得率低；压缩气体流速大，水分蒸发快，成型迅速，损失小，得率高。
进一步的，步骤（3）中所述喷雾干燥法采用的是型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪。本发明采用的型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪内置玻璃器皿，玻璃器皿内壁都经抗静电处理，故在一般干燥情况下干粉不会粘到内壁上，保证样品的高回收率；为达到无菌的目的，可在使用前用高温热空气消毒，空气进口设置过滤器，以保持空气的洁净；干燥后的成品干粉，其颗粒度较均匀、一致，90%以上的干粉在同一颗粒度范围。
进一步的，所述微型喷雾干燥仪采用的是红宝石喷嘴或者三流体喷嘴。不同型号喷嘴可以适用于不同浓度的发酵液，使收集的适应性更加广泛。
进一步的，步骤（3）中所述喷雾干燥法的蠕动泵工作效率为18%～22%。随着泵的工作效率的增加，进料速度加快，而风机功率恒定，所以产品没有完全干燥，湿度大，收率低。所以本发明采用低频蠕动的方式进行收集，将将蠕动泵的工作效率控制在18%～22%。
本发明的喷雾干燥制备植物乳杆菌zj316细菌素的方法，该种方法通过对植物乳杆菌zj316的发酵，并对发酵液进行过滤，然后将得到的上清液采用喷雾干燥法进行细菌素的收集，大大提高细菌素的收率和活力，同时也提高了细菌素的纯度，并且由液态形式变成固态形式，便于储存和运输，因为液态存在对细菌素不稳定因素，变成固态后也有效的保护了细菌素的活力值。不仅避免了传统收集方法的高成本的缺点，而且也有效的提高了细菌素的收率。
本发明的喷雾干燥制备植物乳杆菌zj316细菌素的方法，通过对辅料种类、辅料混入体积比、进口温度、压缩气体流速、蠕动泵工作效率等关键参数的控制，使细菌素的收率、活力和效价均大大提高。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例1
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：4.8加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为153℃，压缩气体流速为900l/h，蠕动泵工作效率为18%，最终得到细菌素。
实施例2
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：5加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为155℃，压缩气体流速为950l/h，蠕动泵工作效率为20%，最终得到细菌素。
实施例3
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：5.2加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为157℃，压缩气体流速为1000l/h，蠕动泵工作效率为22%，最终得到细菌素。
对比例1
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过冷冻干燥法，最终得到细菌素。
对比例2
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；将上清液直接通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为153℃，压缩气体流速为900l/h，蠕动泵工作效率为18%，最终得到细菌素。
对比例3
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：20加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为157℃，压缩气体流速为1000l/h，蠕动泵工作效率为22%，最终得到细菌素。
对比例4
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：4.8加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为125℃，压缩气体流速为900l/h，蠕动泵工作效率为18%，最终得到细菌素。
对比例5
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：4.8加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为153℃，压缩气体流速为500l/h，蠕动泵工作效率为18%，最终得到细菌素。
对比例6
将植物乳杆菌zj316进行活化，将已经传代两次的种子菌液以3%的接种量接入发酵罐中，发酵过程中搅拌速度为100r/min，培养温度为30℃，发酵开始12h开始按照指数流加的方式进行补料，通过流加方程式计算出流加速率进行补料，最终得到发酵液；将发酵液通过型号为赛多利斯16828的生物膜过滤系统进行过滤，收集上清液；向上清液中按体积比1：4.8加入食盐；混合后通过型号为buchib-290的微型喷雾干燥仪进行收集，将微型喷雾干燥仪进口温度设置为153℃，压缩气体流速为900l/h，蠕动泵工作效率为35%，最终得到细菌素。
评价：
通过对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6所得到的细菌素的收率、比活力和效价进行检测，检测结果见表1。
通过表1数据对比可知，实施例1、实施例2、实施例3得到的细菌素在收率、比活力和效价方面均明显优于对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6。对比例1为同种环境条件下，通过统一菌种发酵采用冷冻干燥法制得的细菌素，各项品质值均低于实施例1、实施例2、实施例3；对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6为将辅料加入、辅料混入体积比、进口温度、压缩气体流速、蠕动泵工作效率参数调整至本发明范围外得到的细菌素数据，从数据对比可以明显看出，虽然某些对比例单项数据较高，但是其他两项数据却偏低，而实施例1、实施例2、实施例3各项数据值均较高，充分说明本发明的方法较现有技术具有较大的进步。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。