本发明涉及一种用于猪流行性腹泻病毒(pedv)分离的免疫纳米磁珠，还涉及pedv低含量临床样品的病毒高效分离方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，pedv)属于尼多病毒目(nidovirales)，冠状病毒科(coronaviridae)，冠状病毒属(coronavirus)成员，是引起猪流行性腹泻(ped)的病原。ped是以感染猪的腹泻、呕吐和脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，各种年龄的猪都能感染发病，尤其对哺乳仔猪具有较高致死率。猪流行性腹泻发病区域遍及全球，给养猪业带来巨大危害。对临床上患ped猪样品中病毒的快速分离鉴定，是研究pedv流行病学、分子生物学以及高效疫苗研制的必要环节。然而，目前临床病原感染复杂多样，已经罕见单一病原感染的临床病例，这种情况使用常规方法对单一病原分离十分困难。同时对于一些低病原含量样本，使用常规方法分离也很难获得成功。因此，建立对临床多重感染和低病原含量样品中的目标病原有效分离的方法，对病原学、流行病学和疫苗等研究具有重要意义。
免疫磁珠在生命科学领域应用日渐普遍，尤其在病原检测和分离等方面。免疫磁珠分离技术是以抗体包被的磁珠为载体，利用抗原、抗体的特异性结合形成抗原-抗体-磁珠复合物，该复合物在磁场作用下可定向运动，从而实现抗原的特异性地分离。该方法结合了分散固相萃取的高效性、免疫亲合作用的特异性及磁回收的简便性，可有效简化前处理流程，缩短前处理时间，提高富集和分离效率。随着纳米磁珠制备和表面包被技术的不断成熟完善，各种抗体以及特异性亲和因子等都可用于磁珠包被，从而获得免疫磁珠，这些免疫磁珠的特异性则完全取决于包被的抗体或亲和因子。目前，常用的主要抗体包括单克隆抗体(igg)、单链抗体、单域抗体(sdab)等。单域抗体是骆驼科和软骨鲨鱼等血清天然存在的仅有重链的igg抗体，该类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区的单一结构域组成，又称为重链抗体(vhh)或纳米抗体(nanobody，nb)。sdab同普通igg抗体分子一样保持了良好的、特异的抗原结合能力。同时，sdab还具有易于在大肠杆菌表达系统中可溶性表达、耐高温、耐极度ph值等独特性质。这些特性使sdab成为免疫磁珠制备的理想候选抗体。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一种能够结合并高效富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，pedv)的免疫纳米磁珠；本发明的另一目的是提供一种pedv低含量样品病毒有效分离的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，pedv)的免疫纳米磁珠，该免疫纳米磁珠具有磁性的fe2o3核心和偶联有pedv膜蛋白特异性单域抗体的表面，该pedv膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如seqidno.2所示。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的免疫纳米磁珠的方法，包括以下步骤：
(1)纳米磁珠的活化
取带有羧基表面的fe2o3纳米磁珠，加入离心管，用无菌pbs缓冲液洗3次，用磁力架收集磁珠，然后向有磁珠的离心管中加入0.4mol/l的edc和0.2mol/l的nhs，活化磁珠表面，用pbs缓冲液洗5次，备用；
(2)包被抗体缓冲液置换
取pedv膜蛋白特异性单域抗体溶液，利用超滤管更换溶解缓冲液为pbs缓冲液，备用；
(3)免疫纳米磁珠制备
取已更换缓冲液的pedv膜蛋白特异性单域抗体溶液，加入有活化磁珠的离心管，置37℃，120rpm摇动，孵育2h，用pbs缓冲液洗5次，收集磁珠，然后用质量体积比为0.1％的牛血清白蛋白，置37℃，封闭30min，收集磁珠，用含体积比为0.01％叠氮钠，10％甘油的pbs缓冲液重悬，即得，4℃储存备用。
其中，优选的，所述的带有羧基表面的fe2o3纳米磁珠的直径为200nm。
其中，优选的，加入的0.4mol/l的edc和0.2mol/l的nhs的体积比为1:1。
其中，优选的，步骤(1)-(3)中所述的pbs缓冲液的ph值均为7.4。
更进一步的，本发明还提出了一种pedv低含量样品病毒有效分离的方法，即利用本发明所述的免疫纳米磁珠对低病毒含量临床样品中的pedv进行捕获和富集，在通过细胞分离传代，实现病毒分离。
其中，优选的，所述的方法的具体步骤为：
a.免疫纳米磁珠与样品共孵育：将临床疑似pedv感染猪粪便以及分泌物棉拭子类型样品或组织样品，用无菌pbs缓冲液浸泡或组织匀浆，与免疫纳米磁珠，室温，80rpm，共孵育1h，用无菌pbst洗5次，磁力架收集免疫纳米磁珠；
b.免疫纳米磁珠与病毒复合物接种细胞：用含100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem，洗免疫纳米磁珠5次，磁力架收集，与1ml含5μg/ml胰酶，100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem混合，并加入到细胞表面，37℃，5％co2，孵育1h；
c.更换细胞培养液：加入含5μg/ml胰酶，100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基，37℃，5％co2继续培养24h，开始观察细胞病变(cpe)，并进行病毒传代，实现病毒分离。
其中，优选的，步骤a中所述的pbs缓冲液的ph值为7.4，步骤b中所述的细胞为vero细胞。
以上所述的猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，pedv)膜蛋白特异性单域抗体及其核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，所述的猪流行性腹泻病毒膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如seqidno.2所示。优选的，所述的核苷酸序列如seqidno.1所示。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明利用纳米磁珠和pedv特异性单域抗体制备了免疫纳米磁珠，能够有效捕获和富集粪便、组织等多种样品中的pedv。样品经处理后利用免疫纳米磁珠进行病毒捕获和富集，将结合病毒的免疫纳米磁珠直接接种到细胞，即可实现对病毒分离。本发明制备的免疫纳米磁珠和pedv分离方法，适用于临床复杂和低病毒含量样品中pedv的快速、有效分离。
附图说明
图1为pedv特异性sdab的序列分析、表达和纯化；
a：通过thekabatetal.(kabat,1991)方式进行骨架和互补决定区划分。(kabat,e.a.,1991.sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.usdepartmentofhealthandhumanservices,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth.)。b：表达与纯化.泳道1，空白对照；泳道2，表达；泳道3，纯化；m，蛋白分子量标准。c：elisa实验分析sdab-mc40与m蛋白结合活性。
图2为免疫纳米磁珠对m蛋白结合活性分析；
重组表达m蛋白与免疫纳米磁珠共孵育，通过sds-page检测结合情况，并通过westernblot验证，利用pedv抗体阳性猪血清为一抗，hrp标记的兔抗猪抗体为二抗；泳道1，免疫纳米磁珠结合的m蛋白；泳道2，使用的总重组m蛋白；泳道3，与磁珠孵育后的上清液；泳道4，与磁珠孵育后的上清液；泳道5，使用的总重组m蛋白；泳道6，免疫纳米磁珠结合的m蛋白。
图3为免疫纳米磁珠对pedv毒株cv777的捕获活性分析；
利用磁珠与cv777感染vero细胞上清共孵育，收集磁珠，一部分用pedv特异性引物，通过rt-pcr检测，可见与预期大小相符条带(a)，泳道1共孵育后磁珠检测，泳道m，dnamarker；另一部分通过3％磷钨酸钠负染，用透射电镜观察，可见磁珠表面结合有大小约为100nm的病毒粒子(b)。
图4为病毒富集作用分析；
将pedv细胞毒cv777，利用pbs倍比稀释，pcr检测，取rt-pcr无法检测到的稀释病毒与免疫纳米磁珠共同孵育，然后通过rt-pcr检测，分析免疫纳米磁珠的病毒富集作用。泳道1，空白磁珠对照；泳道2，稀释后病毒rt-pcr检测；泳道3–泳道9，分别为400、600、800、1000、1200、1400和2000μl稀释病毒与磁珠孵育后rt-pcr检测结果。
图5为田间毒株的分离鉴定；
用免疫纳米磁珠与疑是pedv感染仔猪粪便样品共孵育，收集磁珠，通过rt-pcr检测(b)，泳道1，处理后粪便样品直接检测(200μl样品用于rna提取)；泳道2，1ml处理后样品与免疫纳米磁珠孵育后检测；泳道3，空白磁珠对照；泳道4；2ml处理后样品与免疫纳米磁珠孵育后检测；泳道5，3ml处理后样品与免疫纳米磁珠孵育后检测。接种vero细胞，观察到明显细胞病变(a)；利用免疫荧光技术，可见细胞内明显荧光(c)；用透射电镜方观察细胞超薄切片，可见细胞内明显病毒粒子，箭头所示部分病毒颗粒(d)。
图6为基于s基因的进化分析。
用mega6.0软件，将分离株jxdv1801与ncbi上公布已知亚型的10株pedv的s基因序列进行比对分析，并用最大似然法(ml)，泊松模型(poissonmodel)构建系统发育树。结果证实分离株为g1亚型。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1pedv特异性免疫纳米磁珠的制备
1.1pedv膜蛋白(m)特异性sdab的筛选和表达
利用噬菌体展示技术，淘选m蛋白免疫双峰驼文库，得到与m蛋白特异结合的噬菌体，进行测序分析，得到sdab基因序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示，进行序列分析；然后将其克隆到pet-32a表达质粒，用大肠杆菌(e.coli)进行表达，利用ni纯化树脂进行目的蛋白纯化；通过酶联免疫吸附实验(elisa)，分析sdab-mc40与m蛋白的结合活性。
对m蛋白结合的噬菌体测序分析，获得特异性单域抗体sdab-mc40(图1a)；连接32a载体后，转化到大肠杆菌，获得大小相符的表达蛋白，并且为可溶性表达，利用ni纯化树脂能够得到目的蛋白(图1b)，其氨基酸序列如seqidno.2所示；elisa分析结果证实sdab-mc40具有m蛋白结合活性。
1.2纳米磁珠的活化
取500μl，浓度为2mg/ml，直径200nm，带有羧基表面的fe2o3纳米磁珠，加入1.5ml离心管，用1ml无菌pbs(ph7.4)洗3次，用磁力架收集磁珠。然后加入0.4mol/l的edc和0.2mol/l的nhs各200μl，到有磁珠的离心管中，活化磁珠表面，用pbs(ph7.4)洗5次，备用。
1.3包被抗体缓冲液置换
取1ml浓度为2.35mg/ml原核表达并纯化的sdab-mc40，利用超滤管更换其溶解缓冲液为pbs(ph7.4)，并达到最终体积为1ml，浓度为1.8mg/ml，备用。
1.4免疫纳米磁珠制备
取1ml已更换缓冲液的sdab-mc40，加入有活化磁珠的离心管，置37℃，120rpm摇动，孵育2h，用pbs(ph7.4)洗5次，收集磁珠，然后用质量体积比为0.1％的牛血清白蛋白，置37℃，封闭30min，收集磁珠，用1ml含体积比为0.01％叠氮钠，10％甘油的pbs缓冲液(ph7.4)重悬，4℃储存备用。
2免疫纳米磁珠病毒结合活性分析
2.1免疫纳米磁珠对pedv膜蛋白(m)捕获活性分析
免疫纳米磁珠与m蛋白的结合活性，通过sds-page和westernblot进行分析。取200μlpbs(ph7.4)加入1.5ml离心管，然后加入10μl浓度为2mg/ml的免疫纳米磁珠和50μl浓度为1.23mg/ml重组m蛋白，37℃，80rpm摇动，孵育1h；同时设置未偶联单域抗体的空白磁珠对照。用磁力架收集磁珠与结合物，弃掉上清，用pbst(ph7.4)洗5次，80rpm，5min/次，收集磁珠；加入sds-page上样缓冲液，沸水煮10min；一部分样品直接通过12％的sds-page分析，结果免疫纳米磁珠与m蛋白共孵育样品泳道出现与m蛋白大小一致条带(图2)。
另一部分样品通过12％的sds-page分离后，转到pvdf膜。然后与pedv阳性猪血清，室温，80rpm，孵育1h，pbst洗4次。在与辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗猪二抗，室温，80rpm，孵育1h，用pbst，80rpm，洗5次，5min/次。用ecl显色液显色；结果在免疫纳米磁珠与m蛋白共孵育样品泳道出现与m蛋白大小一致条带(图2)。这些结果表明制备的免疫纳米磁珠具有m蛋白捕获功能。
2.2免疫纳米磁珠对pedv细胞毒(毒株cv777)捕获分析
免疫纳米磁珠与pedv(毒株cv777)的结合活性通过透射电镜和rt-pcr进行分析。取1mltcid50值为107.2/0.1ml的cv777细胞毒，与20μg免疫纳米磁珠混合，37℃，80rpm，孵育1h，然后用磁力架分离免疫纳米磁珠，弃掉上清，用pbst洗5次。用磁力架收集的免疫纳米磁珠，一部分用3％磷钨酸负染，用透射电镜观察，结果在磁珠周围可观察到大小约为100nm的病毒颗粒，与pedv大小90-180nm相符(图3b)。
另一部分用于提取rna，使用pedv特异性检测引物，通过rt-pcr直接检测，结果与cv777共孵育免疫纳米磁珠样品出现与预期大小相符特异性条带(图3a)。这些结果证实制备的免疫纳米磁珠，具有pedv病毒捕获功能。
3免疫纳米磁珠对低pedv含量样品富集能力分析
将pedv细胞毒株cv777，10倍倍比稀释，直到rt-pcr不能检测到，取这个稀释度样品，利用免疫纳米磁珠与不同体积稀释后病毒孵育，通过rt-pcr检测。结果当样品中病毒含量低到pcr无法检测到时，利用免疫纳米磁珠对病毒进行富集后，能通过rt-pcr检测到(图4)，表明该发明制备的免疫纳米磁珠适合于低pedv含量样品的病毒富集。
实施例2pedv低含量样品的病毒分离方法
1临床样品处理
疑似pedv感染猪粪便以及分泌物等棉拭子类型样品，置于2ml离心管，加入1ml无菌pbs(ph7.4)室温放置2h，2000rpm离心5min，取上清；疑似pedv感染病死猪组织样品，用无菌pbs(ph7.4)组织匀浆(匀浆仪器或石英砂研磨)，室温放置4h或4℃过夜，10000rpm离心10min，取上清。
2免疫纳米磁珠捕获样品中pedv
无菌取1mg/ml的免疫纳米磁珠20μl，加入2ml离心管，用无菌pbs(ph7.4)洗3次，磁力架收集免疫纳米磁珠。取处理样品上清1ml，加入到含免疫纳米磁珠的离心管，混匀，室温孵育1h，对于低pedv含量样品(pcr无法直接检测到)，可以反复取足够多的样品上清液与免疫纳米磁珠孵育，用磁力架收集磁珠病毒复合物。
3细胞接种
用无血清细胞培养液(dmem)洗磁珠磁珠病毒复合物5次，每次洗5min，磁力架收集，然后加入到vero细胞表面，37℃，5％co2，孵育1h，去掉与细胞孵育液体，加入含5μg/ml胰酶，100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基，37℃，5％co2继续培养24h，开始观察细胞病变(cpe)，80％细胞出现cpe后，收细胞冻融3次，在vero细胞进行病毒传代。
实施例3田间pedv感染样品的病毒分离
将临床疑似感染粪便样品处理后，利用免疫纳米磁珠富集，通过rt-pcr检测，然后将捕获的病毒接种到vero细胞，观察cpe并进行传代。同时通过免疫荧光和细胞超薄切片透射电镜方法验证，并通过pcr克隆s基因，进行序列分析。结果疑似pedv感染仔猪粪便样品处理后直接通过rt-pcr，电泳后未见明显条带，而通过不同量的样品与磁珠孵育后，rt-pcr检测，出现预期到小的条带(图5b)。与样品孵育后的磁珠接种vero细胞后24h，出现了明显cpe(图5a)；病毒传代后通过ifa能够观察到细胞内存在明显荧光(图5c)；收获细胞固定后，制作超薄切片，通过透射电镜能够观察到细胞内存在大量病毒粒子(图5d)；对s基因克隆，测序其长度为4149bp，与已公布序列比对进化分析证实其为pedvg1亚型(图6)，这些结果表明通过免疫纳米磁珠对样品中pedv成功进行了富集和分离，证实该磁珠可用于低pedv含量样品的病毒分离。
病毒分离培养是研究病毒的病原学、流行病学以及疫苗等必不可少的环节。本发明制备的免疫纳米磁珠可以在复杂样品中分离pedv，解决混合感染单一病原难以分离的问题，同时免疫纳米磁珠还可以对低病毒含量样品进行富集，从而实现对低病毒含量样品中病毒高效检测与分离。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种猪流行性腹泻病毒低含量样品的病毒分离方法
<160>2
<170>patent-in3.5
<210>1
<211>378
<212>dna
<213>poreineepidemicdiarrheavirus
<400>1
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<210>2
<211>126
<212>prt
<213>poreineepidemicdiarrheavirus
<400>2
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