一种粮食样品中硒形态的测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤：1）检测的前期准备；2）粮食样品硒形态的提取；3）建立HPLC-HGAFS联用技术；4）上机测试与结果计算。该方法成本低，操作简便，提取效率高，可同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na2SeO4）五种硒形态和含量。
【专利说明】
一种粮食样品中砸形态的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，属于分析化学领域。
【背景技术】
[0002] 硒是人体必须的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)的组成成分，具 有清除体内自由基、抗细胞脂膜过氧化、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能。 硒缺乏会导致克山病、白肌病、地方性癌症等疾病的发病率增高。我国有2/3的地区缺硒， 其中1/3地方严重缺硒。根据我国13省份普查显示，人均每日硒摄入量仅为36微克，低于 世界卫生组织推荐的日常摄入量50微克的标准，也达不到中国营养学院建议的50-200微 克的摄入量，我国居民普遍缺硒。提高我国居民的日常硒摄入量，对于改善国民健康有重大 意义。
[0003] 但是，科学、合理地补硒不但要提高人体摄入硒的总量，也要关注人体对于硒的可 吸收利用性。研究表明，不同形态硒的吸收利用性、安全性有较大差异。无机硒的吸收效果 和安全性远远不及有机硒。
[0004] 我国居民的膳食结构以植物性食品为主，且植物性食品也是居民摄入硒的主要来 源。因此，测定植物中的硒形态，对于指导居民科学补硒，开发安全高效的富硒食品，具有指 导意义。
[0005] 目前，测试主要硒形态的主要技术为气相色谱（GC)、电泳（CE)高效液相色谱 (HPLC)等与HGAFS (高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析)、ICP-MS (电感耦合等离 子体质谱）联用技术。但是GC对于硒代氨基酸和硒代蛋白等非挥发性的硒化物的检测 存在较多的困难；CE在与ICP-MS联用时，所需流速不同，限制其发展应用；现在主要采用 HPLC技术。如：富硒植物材料中硒形态的测定方法（中国专利申请号201110428248. 4)中 利用HPLC-HGAFS检测富硒植物中硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys )、 硒代蛋氨酸（SeMet)和亚硒酸钠（Na2Se04)四种硒态。但由于所用试剂的差异，该方法无 法检测出硒的六价形态。植物硒形态的检测方法（中国专利申请号201210215457. 5)中 采用HPLC-ICP-MS联用技术分析植物样品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (1〇36〇5^)、硒代蛋氨酸（36161:)、亚硒酸钠（似 236〇4)和硒酸钠（似236〇4)五种硒态。水 产品中硒形态的检测方法（中国专利申请号201310376921. 3)利用HPLC-HGAFS联用技术 分析水产品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亚硒酸钠（Na 2Se04)和硒酸钠 (Na2Se04)四种硒态，该方法主要用于对水产品中硒形态的测定，没有探讨对粮食样品中硒 形态测定的适用性。但是，目前ICP-MS价格昂贵，检测成本高，不易推广；而采用HGAFS技 术的方法检测硒形态种类又不完善，并且这些方法中都没有提到样品中硒的提取率，有可 能检出硒仅为样品中总硒的少部分。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种成本相对较低、硒形态种类检测完备且操 作简便、提取效率高的粮食样品中硒形态的测定方法。
[0007] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下： 本发明所述粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤： 1)检测的前期准备： i) 设备：HPLC-HGAFS (型号为 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色谱柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器(型号KQ-610)、摇床、离心机； ii) 试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH4、盐酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亚硒 酸钠（Na 2Se04)和硒酸钠（Na2Se04)标准物质、18. 2 ΜΩ水。
[0008] 2)粮食样品砸形态的提取： i) 称取供干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进彳丁提取，超声； ii) 提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4°C下，10000转/分， 离心30 min，上清液过0. 22 μ m滤膜，得到待测溶液。
[0009] 3)建立HPLC-HGAFS (高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术： i) 仪器条件：流动相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速 1 mL/min ;进样体积 100 μ L ;蠕动栗转速65 rpm ;灯电流/辅阴极：100mA，45mA ;光电倍增管负高压：300V ;载气流 速：300mL/min ;屏蔽气流速：700mL/min ; ii) 氢化物发生条件：还原剂成分：〇. 35wt%Na0H+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化剂 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;载流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（1636〇}^)、亚硒酸钠（似236〇 4)、硒 代蛋氨酸（SeMet)和硒酸钠（Na2Se04)混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图。
[0010] 4)上机测试与结果计算： 样品中待测物硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、亚硒酸钠 (Na2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸钠（Na2Se0 4)的含量可由下式计算得： X=CXVXF/m 式中： X-样品中待测物质的含量，yg/kg; C一待测液中该物质的浓度，μ g/L; V一测定液体总体积，mL ; F-稀释倍数； m-称样质量，g。
[0011] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，称取样品质量为0. 1-0. 2 g。
[0012] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，样品与提取液Tris-HCl的固液比为1 : 25-1:100。
[0013] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，超声提取时间为10-30 min，超声功率600 W， 超声频率40 KHZ。
[0014] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，纤维素酶与粮食样品的质量比为1:1-1:10， 破壁处理温度控制在40-55°C，振荡转速150-200 rpm，振荡时间30 min-2 h。
[0015] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，蛋白酶K与粮食样品的质量比为1 :20-1:100， 水解温度控制在40-55°C，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。
[0016] 作为优选方案，其中所述步骤2)中，蛋白酶XIV与粮食样品的质量比为 1:20-1:100,水解温度控制在30-45°C，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。
[0017] 作为优选方案，其中所述粮食样品为小麦或玉米。
[0018] 相比现有技术，本发明具有以下有益效果： 1、 采用超声提取，结合多种酶，硒的提取效率高，提取率可达80%以上，且酶用量少，节 约成本，提取过程操作简便，易于重复； 2、 相较于现有方法，可以同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (MeSeCys)、亚硒酸钠（Na 2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸钠（Na2Se04)五种硒形态和含 量，且其最低检出限相当低。
【附图说明】
[0019] 图1为各种硒形态的标准分离谱图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实 施条件可以根据具体条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0022] 实例1 :小麦中硒形态的测定 1)检测的前期准备： i) 设备：HPLC-HGAFS (型号为 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色谱柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器(型号KQ-610)、摇床、离心机； ii) 试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH4、盐酸、甲酸、 (ΝΗ 4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亚硒 酸钠（Na 2Se04)和硒酸钠（Na2Se04)标准物质、18. 2 ΜΩ 7K，酶和标准物质均采购于Sigma公 司。
[0023] 2)小麦硒形态的提取： i) 称取烘干、粉碎、过100目筛后的〇.2g小麦粉于15 mL塑料离心管中，加入5 mL提 取缓冲液100 mm〇l/L Tris-HCl，超声提取20 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ; ii) 加入纤维素酶40 mg，50°C，恒温振荡培养lh，振荡转速为180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，然后在4°C下，10000转/ 分，离心30 min，上清液过0. 22 μ m的滤膜后，制备得到上机待测液； 3)建立HPLC-HGAFS (高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术： i)将液相色谱设置为流动相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;进样体 积100 μ L ;蠕动栗转速65 rpm ;灯电流/辅阴极：100mA，45mA ;光电倍增管负高压：300V ; 载气流速：300mL/min ;屏蔽气流速：700mL/min ;氢化物发生条件设置为：还原剂成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化剂成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;载流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii)配制20、40、60、80、100 ng/g混标，待仪器稳定后，做标准曲线，上机测定待测溶 液；在上述条件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留时间依次为：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待测液色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为其为该待测物质；根 据检测结果计算得到样品中各种硒形态含量。
[0024] 结果分析： 1)图1显示标准溶液中五种硒形态的色谱图，表明五种硒形态均能得到有效分离，且 峰形良好。
[0025] 2)仪器的检出限及精密度，见表1。
[0026] 表1.仪器的检出限及精密度的要求
从表1中可以看出，五种硒形态均具有良好的线性范围、相关系数和检出限，说明本发 明检测结果准确可靠，重复性好和精确度高。
[0027] 3)小麦中硒形态的结果，见表2。
[0028] 表2.小麦中硒形态的测定结果
从表2中可以看出，小麦中的总硒含量为22. 3 ± 0.025 mg/kg，则小麦硒提取率为 92%。表明本发明硒的提取效率高。
[0029] 4)加标回收实验结果，见表3。表3结果显示，五种硒形态的加标回收率在 91. 1-120%之间，回收效果理想。
[0030] 表3五种硒形态加标回收率的测定结果
实例2 :玉米中硒形态的测定 1)检测的前期准备： i) 设备：HPLC-HGAFS (型号为 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色谱柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器(型号KQ-610)、摇床、离心机； ii) 试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH4、盐酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亚硒 酸钠（Na 2Se04)和硒酸钠（Na2Se04)标准物质、18. 2 ΜΩ 7K，酶和标准物质均采购于Sigma公 司。
[0031] 2)玉米硒形态的提取： i) 称取烘干、粉碎、过100目筛后的〇.2g玉米粉于15 mL塑料离心管中，加入5 mL提 取缓冲液100 mm〇l/L Tris-HCl，超声提取20 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ; ii) 加入纤维素酶40 mg，50°C，恒温振荡培养lh，振荡转速为180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，然后在4°C下，10000转/ 分，离心30 min，上清液过0. 22 μ m的滤膜后，制备得到上机待测液； 3)建立HPLC-HGAFS (高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术： i) 将液相色谱设置为流动相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;进样体 积100 μ L ;蠕动栗转速65 rpm ;灯电流/辅阴极：100mA，45mA ;光电倍增管负高压：300V ; 载气流速：300mL/min ;屏蔽气流速：700mL/min ;氢化物发生条件设置为：还原剂成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化剂成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;载流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii) 配制20、40、60、80、100 ng/g混标，待仪器稳定后，做标准曲线，上机测定待测溶 液；在上述条件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留时间依次为：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待测液色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为其为该待测物质；根 据检测结果计算得到样品中各种硒形态含量。
[0032] 结果分析： 1)玉米中硒形态的测定结果，见表4。表4结果显示，玉米中的总硒含量为12.81 土 1. 56 mg/kg，则硒的提取率为91%，表明本发明硒的提取效率高。
[0033] 表4.玉米中硒形态的测定结果
2)加标回收实验结果，见表5。表5结果显不，五种硒形态的加标回收率在90-107. 4% 之间，回收效果理想。
[0034] 表5.五种硒形态加标回收率的测定结果
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了 解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质 所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种粮食样品中硒形态的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1)粮食样品砸形态的提取： 1) 称取供干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进彳丁超声提取； ii) 提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4°C下，10000转/分， 离心30 min，上清液过0. 22 μ m滤膜，得到待测溶液； 2) 建立HPLC-HGAFS联用技术： i) 仪器条件：流动相：40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0 ;流速 1 mL/min ;进样体积 100 μ L ;蠕动栗转速65 rpm ;灯电流/辅阴极：100mA，45mA ;光电倍增管负高压：300V ;载气流 速：300mL/min ;屏蔽气流速：700mL/min ; ii) 氢化物发生条件：还原剂成分：〇. 35wt%NaOH+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化剂 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;载流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠 Na2Se04J?代蛋氨 酸SeMet和硒酸钠 Na2Se<Vg#，建立五种硒形态标准溶液的色谱图； 3) 上机测试与结果计算： 样品中待测物硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠 Na2Se04、硒代 蛋氨酸SeMet和硒酸钠 Na2Se04的含量由下式计算得： X=CXVXF/m 式中： X-样品中待测物质的含量，yg/kg; C一待测液中该物质的浓度，μ g/L; V一测定液体总体积，mL ; F-稀释倍数； m-称样质量，g。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，称取样品的质量为 0. 1-0. 2 g〇3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，样品与提取液Tris-HCl 的固液比为1 :25-1:100。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，超声提取时间为10-30 min，超声功率为600 W，超声频率40 KHZ。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，纤维素酶与粮食样品的质 量比为1:1-1:10,破壁处理温度控制在40-55°C，振荡转速150-200 rpm，振荡时间30 min-2 h〇6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，蛋白酶K与粮食样品的质 量比为1:20-1:100，水解温度控制在40-55°(：，振荡转速150-200印111，振荡时间4 11-12 11。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，蛋白酶XIV与粮食样品的 质量比为1:20-1:100,水解温度控制在30-45°C，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h〇8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述粮食样品为小麦或玉米。
【文档编号】G01N30/88GK106033081SQ201510113923
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月16日
【发明人】黄阳, 刘颖, 朱元元
【申请人】中国科学技术大学苏州研究院