本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种狗牙根中一个受低温显著诱导的基因cderf1及其应用；具体地说，是一个从狗牙根(cynodondactylon(linn.)pers.)中分离的耐寒性相关的新基因cderf1。
背景技术
低温是影响植物生长发育的重要环境因子之一，它限制了植物的地理分布，决定了农作物的生长周期。低温胁迫会导致植物体内发生一系列的变化，包括细胞膜稳定性的改变，抗氧化酶活性的变化，和渗透调节物质含量的变化等。同时，为了更好地抵御这些胁迫，植物体内进化出了胁迫信号应答的复杂而高效的调控途径。这个复杂的信号传导网络获取的刺激信号，会激活转录因子表达，通过转录因子与下游靶基因启动子区的顺式作用元件结合，从而激活或抑制这些基因的表达，最后通过基因产物对相应的信号做出应答。目前从不同的植物中克隆得到许多的转录因子，并报道在植株的非生物胁迫响应中发挥重要的作用。转录因子可以作为主要的调节子改善植物的复杂性状，研究者将与抗逆相关的转录因子分为ap2/erebp、bzip、zn-fmger、nac、myb和wrky六类。
乙烯应答因子(ethylene-responsivefactors，erfs)是ap2/erebp——这一庞大转录因子家族中的一个亚组。ap2/erebp结构域是在apetala2蛋白中发现的，由约60个氨基酸组成，可形成一个α-螺旋和三个β-折叠片，c-端由18个氨基酸残基形成双亲性的a-螺旋可能参与同其它转录因子及dna间的相互作用。ap2/erebp至少含有1个ap2结构域，在植物中分布广泛，并且参与许多生物学过程，包括植物生长发育、病原菌防御、干旱、盐碱、低温等环境胁迫响应。还参与水杨酸、茉莉酸、乙炼和脱落酸等信号转导途径，而且可以作为多个信号的交叉因子发挥作用。erfs类转录因子可以受到多种胁迫的诱导表达，同时参与不同胁迫信号转导途径的交叉应答，在植物低温胁迫应答过程中也挥了重要的作用。
狗牙根(cynodondactylon)又名拌根草、百慕大、爬根草或铺地草等，属禾本科多年生草本植物，狗牙根原产于非洲，是暖季型草的一种，广泛分布在热带、亚热带和暖温带等区域。作为暖季型“当家草种”的狗牙根，在我国应用前景十分广阔，其所带来的经济、社会和生态效益也不可估量。狗牙根具有极强的抗热性和抗旱性，但抗寒性差也不耐阴，在日平均气温24℃以上时生长良好，当日均气温下降至6～9℃时生长缓慢，开始变黄。在我国广大过渡带及其以北地区，狗牙根存在一定枯黄期，致使其观赏品质和使用价值降低。因此，低温被普遍认为是狗牙根推广应用的最大限制因素。
目前，狗牙根抗寒机制研究处于起步阶段，对狗牙根抗寒性的研究以国外报道见多，且多集中在应对低温胁迫时狗牙根的质膜稳定性、抗氧化酶活性、可溶性糖和蛋白含量、光合作用等以及代谢组学变化等生理生化层面变化。这些基础理论研究，为狗牙根耐寒品质的改良提供了一定的参考依据。但同时，由于狗牙根遗传背景尚不清楚，对其在分子生物学层面的相关研究较为少见，狗牙根抗寒分子机理研究薄弱，且缺乏原创性抗寒基因。因此，狗牙根中耐寒应答基因有待于进一步发掘和分析，对狗牙根低温胁迫应答途径有待于深入研究。
本发明以耐寒基因型狗牙根为实验材料，以前期狗牙根转录组数据为基础，经过ncbi数据库比对之后，利用race技术，从狗牙根中克隆出一条显著受低温诱导的erfs基因，命名为cderf1。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种狗牙根中一个受低温显著诱导的基因cderf1及其应用。
本发明的目的是这样实现的
1、基本思路
本发明涉及一个新基因，具体地说涉及从狗牙根(cynodondactylon(linn.)pers.)中分离一个受低温显著诱导的基因cderf1。本发明利用新近发展的高通量转录组测序技术(rna-seq)，研究了抗寒狗牙根与低温敏感狗牙根材料在受到低温胁迫时，其全基因组水平上基因差异表达情况，从中发掘了一个受低温显著诱导的cderf1基因；然后利用race技术，克隆出了cderf1基因的全长cdna序列；该发明对于狗牙根抗寒育种实践和对狗牙根抗寒机理的基础科学研究，都具有十分重要的理论和现实意义。
2、具体方案
①狗牙根中一个受低温显著诱导的基因cderf1
本发明提供了一个来自于狗牙根的基因cderf1，其中狗牙根为极端耐寒型wbd128，保存于中国科学院武汉植物园草坪种质资源圃；该基因的orf序列如seqidno.1所示，所编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。
②基因cderf1的获得方法
a、通过对狗牙根转录组数据进行分析，筛选出了4条显著受低温诱导的erfs序列；
b、基于筛选出的4条erfs序列设计pcr扩增引物；
c、利用狗牙根cdna扩增erf部分序列并测序；
d、进而通过race-pcr技术从中获得cderf1基因全长。
③基因cderf1的应用
a、通过对cderf1基因在狗牙根不同胁迫处理表达模式的分析，推测该基因可能参与植物抗逆反应；
b、利用农杆菌介导法转化到拟南芥，并研究其在转基因拟南芥中的抗逆功能，为cderf1基因在其他植物上的应用奠定了基础；
c、可用于植物转化，提高植物的耐寒能力。
3、本发明的优点与效果
1)本发明的cderf1基因是能够针对性调控植物耐寒能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小；
2)本发明对cderf1基因转化拟南芥进行基因功能研究，获得效果如下：
a、获得了对低温胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥；
b、cderf1基因具有抵抗低温胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。
附图说明
图1是cderf1与其他物种erf家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对；
图2是cderf1与其他物种erf转录因子之间聚类分析；
图3是cderf1基因在低温、干旱、高盐胁迫及aba、acc和ja处理条件下表达模式分析；
图4是转基因拟南芥cderf1基因插入与表达验证，wt：野生型；oe1、oe2：cderf1超表达转基因拟南芥；
图5是cderf1转基因拟南芥耐寒性表型实验，wt：野生型；oe1、oe2：cderf1超表达拟南芥；
图6是cderf1转基因拟南芥活性氧含量检测，wt：野生型；oe1、oe2：cderf1转基因拟南芥；
图7是cderf1转基因拟南芥耐寒生理参数变化，wt：野生型；oe1、oe2：cderf1转基因拟南芥。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例详细说明
1、实施例1：狗牙根中受低温诱导的erfs类转录因子获得
通过对极端耐寒型wbd128种质和低温敏感型wbdg17狗牙根种质的转录组数据分析，在wbd128中找到四条显著受到低温诱导的erfs序列，并分别基于这四条序列设计4对引物：
erf1-up：5’-cgccaaggccaagactaactt-3’，
erf1-dn：5’-ctgcccgtagaagaagtactg-3’；
erf2-up：5’-atggttagcttgcggagacgt-3’，
erf2-dn：5’-ctgtgccgttttctacgcttg-3’；
erf3-up：5’-gcccaaggccaagaccaact-3’，
erf3-dn：5’-tcgaggaagaggaacggctg-3’；
erf4-up：5’-gcttcctcctcttcttcgtc-3’，
erf4-dn：5’-aagaactgggcctggatctg-3’；
对低温处理过的极端耐寒型wbd128狗牙根种质中提取总rna，用mlv反转录酶合成单链cdna，具体方法如下：
1)利用trizol法提取叶片中总rna
具体步骤如下：
首先取适量的植株新鲜叶片，加入液氮研磨成粉末状；之后将粉末转移到rnaase-free的ep管中，加入1mltrizol，震荡混匀，室温放置5min，4℃、12000r/min离心5min；取上清转移至新的ep管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温放置5min，然后4℃、12000r/min离心5min；吸取上清转至新的ep管里，加入600μl的异丙醇，室温静置10min，然后4℃、12000r/min离心15min；弃上清，依次加入375μl乙醇和125μldepc水洗涤沉淀，然后待沉淀干燥之后加入30μldepc-h2o溶解，放入-70℃保存。
2)将提取的rna反转录为cdna
具体步骤如下：
取2.5μgrna，加1μloligo15t，补水(depc-h2o)至8μl，混合均匀，70℃水浴5min，冰上5min，然后按顺序加入下列试剂：
混匀，42℃水浴1h，70℃水浴15min，即获得cdna，置于-20℃备用；
然后以此为模板，用上述设计的引物pcr扩增出cderf1的部分cdna序列；
反应程序为：94℃预变性5min进入循环过程：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后以72℃延伸7min；后用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；
结果发现，4对引物中只有erf2能扩增出一致性好，特异性强的条带；然后对其凝胶回收后连接到pmd-18t载体上，将重组质粒转化在e.colidh5α感受态细胞中，将菌液涂布到含有氨苄的lb平板上，37℃，倒置，过夜培养12h；对阳性克隆进行测序，并用blast程序对序列进行同源性分析。
2、实施例2：狗牙根cderf1基因的分子克隆
测序发现erf2序列5’端是从起始密码子atg开始的，紧接着进行了3’racepcr扩增；根据takara3’-fullracecoresetwithprimescripttmrtase说明书上的要求设计了3条特异性引物进行3’-race，其引物如下：
erf2-3’raceouter,5’-ctcgtggattctccaaatggtgca-3’；
erf2-3’raceinner1,5’-aggacgagagaacccagtattacc-3’；
erf2-3’raceinner2,5’-accaagcgtagaaaacggcacaga-3’；
3’-race的原理是：以totalrna为模板，使用3’raceadaptor引物，在反转录酶primescriptreversetranscriptase作用下进行反转录，合成标准第一条cdna；使用上游外侧特异性引物(erf2-3’raceouter)和3’raceouterprimer进行第一轮pcr扩增；若第一轮pcr反应未能得到目的产物，再使用上游特异性引物(erf2-3’raceinner1)和3’raceinnerprimer进行第二轮pcr反应；以此将目的基因3’端cdna片段扩增出来。
利用3’race技术，获得cderf1基因全长cdna序列；经测序表明为erfs家族转录因子，cderf1全长cdna为660bp(seqidno.1)，编码一个由219个氨基酸组成的蛋白(seqidno.2)；
根据序列测序结果，到ncbi数据库里进行序列比对，发现克隆到的cderf1基因序列与粟米sierf和水稻oserf具有较高同源性；cderf1与erfs类转录因子保守的dna结合域比对及进化树分析如图1和图2所示；基于该序列再次设计如下引物，扩增出该基因的orf序列(注：该基因的orf序列为seqidno.1)：
cderf1-o-up：5’-ttatggttagcttgcggagac-3’；
cderf1-o-dn：5’-ctaagatgtcaaattctcggcg-3’。
3、实施例3：转录因子基因cderf1在逆境胁迫时的表达谱分析
erf转录因子广泛响应各种生物与非生物胁迫，如低温、干旱、高盐、病虫害及机械伤害等都可诱导erf转录因子基因的表达，不同的erf转录因子在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式；本实验中所用到的引物序列如下：
cderf1-qup：5'-actgcagaggtacacct-3'；
cderf1-qdn：5'-gaagagccaccaccatt-3'；
cdact2up：5'-tctgaagggtaagtagagtag-3'；
cdact2dn：5'-actcagcacattccagcagat-3'。
将生长2个月的成熟狗牙根，分别给予低温(4℃)、干旱(25％peg)、高盐(200mmnacl)、脱落酸(100μmaba)、乙烯(100μmacc)和茉莉酸(100μmja)等不同处理；分别于0,1,3,6,12,24,48h剪取幼苗叶片，迅速置于液氮中速冻，并转移到-70℃冰箱保存，直至rna抽提；每组样品具有三次重复；rna抽提和cdna的合成如实施例1所述；反应体系如下：
实验所使用的仪器是abi公司的steponeplus荧光定量pcr仪，反应条件使用标准模式；反应条件为：94℃，1min；94℃，20s；60℃，20s；72℃，31s；采集荧光信号，共40个循环；60-95℃，每1℃采集一次荧光信号，持续1s。
反应结束后，用excel软件进行分析及绘图，其结果如图3所示；
结果显示，经过低温处理1h后，cderf1迅速增加，在处理3h后，该基因表达强烈；经过干旱处理1h后，cderf1表达量上调并达到峰值；经过高盐胁迫24h后达到峰值；同时，aba、乙烯和ja处理下的狗牙根中cderf1表达显著上调；经aba处理1h后，cderf1表达量显著上调，并达到峰值；acc处理之后也得到了类似的结果；ja处理1h后cderf1表达量增加，在处理6h后达到峰值。这些结果表明cderf1受peg、nacl、低温、aba、ja和acc诱导表达。
4、实施例4：cderf1过量表达载体的构建
1)以连有cderf1基因的克隆载体为模板，以cderf1oeup/dn为引物，利用高保真酶la-taq扩进行pcr扩增，获得cderf1基因orf全长，引物序列如下：
cderf1oeup：5’-cttctagaatggttagcttgcggagacg-3’；
cderf1oedn：5’-ggggatccctaagatgtcaaattctcgg-3’。
得到pcr产物纯化后，将其连接到pmd18-t载体上，并转化大肠杆菌感受态细胞，经过pcr检测，获得阳性单菌落提取质粒，进行双酶切，体系如下：
酶切条件为37℃，3-4h；然后利用凝胶电泳的方法，回收目的片段。
2)将pmd35s载体同样用xbai和bamhi酶切，体系如下：
酶切条件为37℃，3-4h，然后利用乙醇沉淀的方法，回收表达载体。
具体方法如下：加水至100μl，然后加入无水乙醇250μl，摇匀，至于-20℃，放置30min；12000rpm，离心15min，去上清；然后加入300μl75％的乙醇，混匀后12000rpm，离心5min；轻轻倒掉上清，倒置晾干5min，最后加入20-25μl的ddh2o。
3)将回收的cderf1片段连入pmd35s载体中，其反应体系如下：
连接条件为16℃，3-12h，然后转化大肠杆菌感受态细胞trans5α，具体方法如下：
①迅速从-80℃超低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，快速置于冰上；
②将上一步得到的连接产物全部加入感受态细胞中，吸打2-3次，并轻弹ep管底部混匀，再将其置于冰上30min；
③在恒温水浴锅中，42℃热激90s，再置于冰上3-5min；
④在ep管中加入500μl的lb液体培养基；
⑤37℃，200r/min摇菌45-60min；
⑥涂添加amp抗生素的平板，培养12h。
⑦经过菌液pcr鉴定之后，选择1-2个阳性单菌落转接至50mllb中37℃，过夜培养(km)，
⑧次日利用质粒小提试剂盒(dp103-03,天根生化科技有限公司,北京，中国)提取质粒，即获得了含有目的片段的表达载体，具体步骤如下：
a、柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(请使用当天处理过的柱子)；
b、取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；
c、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1(请先检查是否已加入rnasea)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
d、向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解(所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)。
e、向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；
f、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀；12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中；
g、向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中；
h、重复操作步骤g；
i、将吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除(可将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数min)；
j、将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μlddh2o(已灭菌)，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中；
最后利用pcr(引物为cderf1oeup/dn)和酶切(xbai和bamhi)的方法对提取的质粒进行检测。
5、施例5：构建好的过量表达载体转化农杆菌
将构建好并经过pcr检测的表达载体，转化农杆菌gv3101(ac1001m，上海唯地生物技术有限公司，上海，中国)中，具体步骤如下：
①取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；
②每100μl感受态加入2μl质粒dna，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
③加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；
④6000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50μg/mlkan的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养48h；
⑤pcr扩增鉴定阳性菌落，接种阳性单菌落到lb液体培养基中(50μg/mlkm)，28℃，250rpm培养48h，菌液用于拟南芥遗传转化或保存。
6、实施例6：拟南芥的培养及遗传转化
1)拟南芥的培养
a、取少许拟南芥种子放入离心管中，加入次氯酸钠处理5-6min，吸去次氯酸钠后用无菌水清洗种子4-6次；
b、将种子平铺于ms固体培养基表面，并且将种子分散均匀；将培养皿置于4℃，3d，再将其转移至拟南芥室(22℃)萌发培养10d，即可移栽；
c、每盆灭菌过的营养土中种植6-9颗左右拟南芥；
d、待拟南芥抽苔时从基部剪去主茎，进而促进侧枝生长以及抽苔开花，进而用于转化；
2)浸花法转染拟南芥
a、选取开花比较多(但荚果比较少的)的拟南芥，用于转化；
b、挑取农杆菌单菌落到1.5ml含有km的lb液体培养基中，震荡过夜24h(28℃，220rpm)；
c、次日再将其按照1：1000的比例转接到50ml新鲜的含km的lb液体培养基，震荡培养(28℃，220rpm)，至其od600达到0.6-0.8，然后8000rpm，15min离心收集农杆菌；
d、将离心收集的农杆菌重悬于含有5％蔗糖的自来水溶液中，然后加入0.02-0.03％silwetl-77，混匀后即为浸花液；
e、将拟南芥花序浸入浸花液中30s，待其稍稍晾干，放入拟南芥室正常培养；
f、待种子成熟之后，收取本代的种子。
7、实施例7：拟南芥转基因苗的筛选
1)将收获的当代的拟南芥种子，取出一些用于在含有km的培养基上萌发；全部过程需要在无菌环境中进行，具体步骤：首先往含有种子的ep管中，加入1mlnaclo溶液，混匀，该过程不超过5min；然后用灭菌ddh2o漂洗四次；之后将漂洗过的种子平铺在含有km的ms培养基上(大的培养皿d＝30cm)；最后用封口膜密封，放入拟南芥室培养7d；
2)从培养基上长出的绿苗转入土中，进一步培养；等待种子成熟，分棵收取t1代种子；
3)将收取的t1代种子按照第1步的方法继续筛选，这次用的是小的培养皿(d＝15cm)；放入拟南芥室培养7d；一皿中全是绿苗的培养皿视为可能阳性苗；
4)将可能的阳性苗转入土中培养进一步培养，一皿中约选取12颗(三盆)；此外，收集皿中剩余的小绿苗提取rna，反转录成cdna，定量检测目的基因的表达量；
5)待本代植株种子成熟，收取t2代种子；
6)将检测出的表达量比较高的t2代的拟南芥种子再次在km培养基上筛选，得到的绿苗在土中进一步培养，收取t3代转基因种子。
7)得到了纯合的拟南芥种子之后，在土中或者培养基萌发，视情况选取合适苗龄的苗子，给予目标胁迫处理，测定其表型。
8、实施例8：转基因拟南芥插入及表达验证
提取转基因拟南芥rna进行目的基因的表达验证，rna提取与cdna合成的具体方法参考实施例1；以拟南芥act2基因为内参，利用实时定量pcr技术检测目的基因cderf1的表达情况。
cderf1荧光定量引物：
cderf1-q:forward5'-actgcagaggtacacct-3'，
cderf1-q:reverse5'-gaagagccaccaccatt-3'；
拟南芥内参基因actin2荧光定量引物：
atact2up:5'-gaaatcacagcacttgcacc-3'，
atact2dn:5'-aagcctttgatcttgagagc-3'；
我们选取了两个表达量最高的转基因拟南芥株系，并命名为(cderf1-oe1和oe2)；结果显示，在cderf1超表达株系(oe1和oe2)中均能检测出cderf1，而在野生型中并未检测到该基因的表达(如图4所示)；qrt-pcr的结果也再次证明了cderf1在cderf1-oe1和cderf1-oe2中的表达，而在野生型中并未检测到。
实施例9：转基因拟南芥抗寒表型检测
转基因拟南芥种子先置于4℃冰箱中春化3-4d，然后以泥炭±为基质，将低温处理过的种子，以点播的方式种植在直径10cm的塑料盆中；每盆点播9处，一周后进行疏苗，每处保留1棵苗，然后放在22℃条件恒温栽培中培养；选择3周龄的植株进行抗寒表型鉴定，并以野生型作对照。
选择长势一致的拟南芥放在低温光照培养箱中，经过摸索优化，最终确定了处理条件如下：未经过冷驯化(na)的植株，给予-8℃，8h，然后转移至22℃，恢复5d；经过4℃驯化7d(ca)的植株，给予-10℃，8h，然后22℃恢复5d；观察植株成活情况，统计其成活率并拍照；如图5所示，与野生型拟南芥相比，过量表达cderf1的转基因拟南芥耐寒性显著提高；不论经过冷驯化与否，经过冻害处理后，转基因株系cderf1-oe1和cderf1-oe2的成活率显著高于wt；该结果表明cderf1的转入提高了转基因拟南芥对低温胁迫的耐受力。
实施例10：转基因拟南芥抗寒性分析
以野生型拟南芥为对照，分别测定正常条件和低温处理(4℃，7d)条件下的转基因拟南芥抗寒相关生理指标，包括相对电导率(el)、丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性、过氧化物酶(pod)活性测定；此外，本实验利用氮蓝四唑(nbt)和3，3-二氨基联苯胺(dab)染色的方法，定性地测定了过氧化氢(h2o2)和超氧根阴离子(o2-)的含量，并利用过氧化氢试剂盒和超氧根阴离子试剂盒，定量地测定了过氧化氢(h2o2)和超氧根阴离子(o2-)的含量。具体方法如下：
①相对电导率
取新鲜完全展开的功能叶片0.1g，剪成0.5cm长小段放入含有15ml去离子水的试管中，静置1h；在电导率仪上测其初始电导率(e1)，然后置沸水浴中30min，冷却至室温后测其煮沸后电导率(e2)，相对电导率(％)＝el/e2×100。
②丙二醛含量测定
称取0.25g完全展开功能叶片，将叶片置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入4ml4℃预冷的150mm、ph7.0的磷酸缓冲溶液，将匀浆转入离心管中，12000rpm、4℃离心15min，上清液即为粗酶提取液。
丙二醛(mda)含量的测定：称取100gtca(三氯乙酸)、2.5gtba(硫代巴比妥酸)，加双蒸水定容至500ml作为反应液；取1ml粗酶液加入到2ml反应液中，混合液在95℃水浴30min后迅速冷却至室温，震荡离心管以消除气泡，在12000rpm、20℃离心10min，取上清液，以反应液为空白测定od532、od600。
mda(nmolg-1fw)＝[(od532-od600)*l]/(l*ε*fw)；式中，l：提取液体积(ml)；l：比色杯厚度(cm)；ε：摩尔吸光系数(155mm-1cm-1)fw：样品鲜重。
③sod活性的测定，首先配制反应液，其中含有50mm的磷酸缓冲液(ph7.8)，60μm核黄素，195mm蛋氨酸，3μm乙二胺四乙酸(edta)和1.125mm的氮蓝四唑(nbt)；然后吸取100μl粗酶液加入2.9ml反应液中，同时，以不nbt和加粗酶液的混合液为空白对照，以不加粗酶液的混合液为处理对照，充分混匀后，置于4000lx荧光灯下显色反应30min，之后转入黑暗中终止反应；以空白对照管调零，测定od560nm；计算时以抑制光下处理对照管nbt还原反应50％的酶量作为一个sod活性单位；计算公式如下：
sod活性(u·g-1fw)＝(acktreatment－atreatment)/(0.5*acktreatment*fw)*40
④氧化物酶(pod)活性的测定，首先用双蒸水配制0.1m的醋酸缓冲溶液(ph5.0)和0.75％的h2o2溶液，以及0.25％的愈创木酚(用50％的乙醇稀释)；之后，吸取50μl粗酶液加入1.85ml醋酸缓冲溶液、1ml愈创木酚溶液和100μlh2o2中，充分混匀；以不加酶液管调零，测量波长为460nm处的吸光度，3min之内每隔1min读数一次；计算pod活性时，以1min内od460增加1为一酶活性单位(u)；计算公式：
pod活性(u.g-1fw)＝δa460/fw*80(fw为样品鲜重)
⑤dab染色方法：实验需要使用0.1mg/mldab，溶于50mmtris-醋酸缓冲液，ph5.0。实验操作：将叶片浸泡在染色液中，室温黑暗过夜；除去染色液，加入无水乙醇，在沸水浴10min(如果叶绿素难脱水，可以时间更长些)；最后将叶片转入无水乙醇中，显微镜或者照相机下拍照观察，保存。
⑥nbt染色：nbt染色液1mg/ml，溶于10mmpbs(ph7.8)中；染色方法：将叶片剪下放入nbt染色液中，光下染色1-2h，待有显色表型(叶片蓝色)时进行脱色；去除染色液，加入无水乙醇，沸水中煮沸10min，70％乙醇中保存，显微镜或者照相机下拍照观察。
⑦h2o2含量测定
h2o2含量测定是利用过氧化氢试剂盒(a064，南京建成生物工程研究所，南京，中国)进行h2o2含量测定具体方法如下：
实验共设置3组，分别为空白管，标准管和测定管；首先在三种管中各加入经过37℃预温的试剂一1ml，然后在在空白管、标准管和测定管中分别加入ddh2o、h2o2标准品应用液和待测样品各0.1ml；混匀，37℃准确反映1min；然后往以上三种管中各加入1ml试剂二。混匀，于404nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。组织中h2o2的计算公式如下：
⑧超氧阴离子(o2-)含量的测定
超氧阴离子(o2-)含量的测定是利用植物中超氧阴离子酶联免疫分析试剂盒(10-40-421，北京鼎国，北京，中国)来实现的；其原理是利用双抗体夹心法测定标本中植物超氧阴离子水平；用纯化的植物超氧阴离子抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧阴离子，再与hrp标记的超氧阴离子抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底洗涤后加底物tmb显色。tmb在hrb酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色；颜色的深浅和样品中超氧阴离子含量呈正相关；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中植物超氧阴离子的浓度；具体方法参照试剂盒使用说明书。
如图6所示，对照条件下，野生型和转基因拟南芥叶片上由o2-(蓝色)和h2o2(棕色)形成的斑点均很少；然而，经过4℃处理7d之后，转基因拟南芥叶片上的蓝色和棕色斑点显著少于野生型；同时定量实验的结果也再次验证了低温胁迫下转基因拟南芥中的o2-和h2o2含量均显著低于野生型；该结果表明，在转基因拟南芥中ros的积累量是受cderf1转录水平调控的。
植物膜系统和抗氧化系统在植物胁迫应答过程中发挥了关键的作用，而细胞膜过氧化以及抗氧化酶活性也可间接指示植物对胁迫抗性的高低；el和mda是衡量质膜损害程度的两个关键指标；sod和pod是植物在清除过量ros过程中两个重要的抗氧化酶。如图7所示，在正常条件下，mda、el以及sod、pod在各个组中并无明显差异；而经过4℃处理7d之后，转基因拟南芥中mda和el显著低于wt，而sod和pod活性显著高于wt；该结果表明过量表达cderf1改善了低温胁迫下拟南芥的膜系统、抗氧化系统系的稳定性。这些结果表明：过量表达cderf1显著提高了拟南芥的抗寒性。
序列表
<110>中国科学院武汉植物园
<120>狗牙根中一个受低温显著诱导的基因cderf1及其应用
<160>23
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>660
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atggttagcttgcggagacgtcgactattggggctttgttcagggaaagattcattgcca60
gttgattttcctaagccaattgagactgtggaaccagtgctctccaatgtgaagccattc120
agtgtgcaccctcttccatcgacaaagatttctgatgtactcgtggattctccaaatggt180
acagactctttaaaggacgagagaacccagtattacccaggcaaggaaatcaagcgtaga240
aaacgtcacagaagaaagcagtatgtggaccaagaaccatgtattatgaggggcgtttat300
ttcaaaaatatgaaatggcaggctgccataaaagttgacaagaaacagattcatttgggt360
actgttgggacacaggacgaagcagcccgactttatgatagggctgcttttatgtgtgga420
agggagccaaactttgagctttccgaggaagagaagcaagaactgcagaggtacacctgg480
gaagactttttggcagtgactcgcaacaccataaccagcaaaaagcaaaggaaggttgga540
ttgctaaggcgtggtaaggcagacttgttcatgggacaaagtgatggtgatactgaaatg600
gttaatggtggtggctcttcgaattctgataatggagacgccgagaatttgacatcttag660
<210>2
<211>219
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
metvalserleuargargargargleuleuglyleucysserglylys
151015
aspserleuprovalasppheprolysproilegluthrvalglupro
202530
valleuserasnvallyspropheservalhisproleuproserthr
354045
lysileseraspvalleuvalaspserproasnglythraspserleu
505560
lysaspgluargthrglntyrtyrproglylysgluilelysargarg
65707580
lysarghisargarglysglntyrvalaspglngluprocysilemet
859095
argglyvaltyrphelysasnmetlystrpglnalaalailelysval
100105110
asplyslysglnilehisleuglythrvalglythrglnaspgluala
115120125
alaargleutyraspargalaalaphemetcysglyarggluproasn
130135140
phegluleuserglugluglulysglngluleuglnargtyrthrtrp
145150155160
gluasppheleualavalthrargasnthrilethrserlyslysgln
165170175
arglysvalglyleuleuargargglylysalaaspleuphemetgly
180185190
glnseraspglyaspthrglumetvalasnglyglyglyserserasn
195200205
seraspasnglyaspalagluasnleuthrser
210215
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cgccaaggccaagactaactt21
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctgcccgtagaagaagtactg21
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
atggttagcttgcggagacgt21
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ctgtgccgttttctacgcttg21
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gcccaaggccaagaccaact20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
tcgaggaagaggaacggctg20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
gcttcctcctcttcttcgtc20
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
aagaactgggcctggatctg20
<210>11
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
ctcgtggattctccaaatggtgca24
<210>12
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
aggacgagagaacccagtattacc24
<210>13
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
accaagcgtagaaaacggcacaga24
<210>14
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
ttatggttagcttgcggagac21
<210>15
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
ctaagatgtcaaattctcggcg22
<210>16
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>16
actgcagaggtacacct17
<210>17
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>17
gaagagccaccaccatt17
<210>18
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>18
tctgaagggtaagtagagtag21
<210>19
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>19
actcagcacattccagcagat21
<210>20
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
cttctagaatggttagcttgcggagacg28
<210>21
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>21
ggggatccctaagatgtcaaattctcgg28
<210>22
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>22
gaaatcacagcacttgcacc20
<210>23
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>23
aagcctttgatcttgagagc20