本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种nodosin衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
溪黄草[rabdosiaserra(maxim.)hara]系唇形科(labiatae)香茶菜属(isodon)植物，在民间，溪黄草作为草药被广泛使用，它全株入药，味苦性凉，具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀等功效，主要用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、湿热痢疾、肠炎、跌打瘀肿和养生保健等，具有较好的药用价值。nodosin是溪黄草中含量较多的二萜类化合物，是其中的活性成份。相关研究表明，nodosin具有多种生物活性，如免疫活性、抗癌活性、抑菌作用、肝保护作用等。然而，nodosin溶解度低，溶出速度也慢，口服不容易被吸收。研究还显示，nodosin在体内吸收迅速，分布广，消除快，预示着nodosin以原型在体内停留时间较短，发挥活性作用的时间也较短。通过结构修饰，可以改变化合物的理化特性，改变生物活性，有利于应用选择。nodosin分子中有一个六元内酯环和一个α-亚甲基环五酮结构，为nodosin的活性中心，结构不太稳定，剧烈的反应环境容易破坏其结构，有可能使它们活性减弱或消失。因此，关于此化合物的衍生物的研究较少。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种nodosin衍生物及其制备方法，该nodosin衍生物能够用于制备抗癌药物。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种结构式如下所示的nodosin衍生物及其药学上可接受的盐：
本发明所述的nodosin衍生物的制备方法，其特征在于：
nodosin6位羟基成酯修饰的具体步骤为：将nodosin、二氯甲烷和三乙胺依次加入到反应容器中，将反应容器置于低温反应仪中于-5～5℃搅拌混合均匀，再滴加酸酐类化合物或酰氯类化合物的二氯甲烷溶液，滴完后于0℃～室温搅拌反应，反应完全后加水终止反应，用乙酸乙酯萃取3次，再依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析分离得到目标化合物15～19，所述酸酐类化合物为丁二酸酐、戊二酸酐或乙酸酐，所述酰氯类化合物为苯甲酰氯或肉桂酰氯；
nodosin6位羟基成醚修饰的具体步骤为：将nodosin和醇类化合物依次加入到反应容器中，再加入浓盐酸，将反应容器置于磁力搅拌器上于室温搅拌反应，然后加乙酸乙酯萃取2次，再依次水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析分离得到目标化合物21～26，所述醇类化合物为甲醇、乙醇、异丙醇、苯甲醇、丙炔醇或环丙甲醇。
本发明所述的nodosin衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。
本发明所述的nodosin衍生物及其药学上可接受的盐在制备抑制人肝癌细胞hepg2或/和人髓性白血病细胞k562增殖药物中的应用。
本发明以自然界来源丰富的nodosin单体化合物为前体化合物，采用简单温和的合成条件，在保持原有活性中心前体下进行分子结构修饰，引入不同的基团，合成系列nodosin衍生物，合成过程简单且容易控制，通过细胞毒活性测试表明该nodosin衍生物具有较好的抗癌细胞活性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
nodosin丁二酸单酯(15)的合成
将nodosin106.7mg(0.29mmol)，二氯甲烷5ml，三乙胺0.4ml(2.88mmol)，依次加入到100ml圆底烧瓶中，置于低温反应仪中搅拌，调节温度0℃左右，另取丁二酸酐117.2mg(1.17mmol)，用少量二氯甲烷溶解，将后者缓慢滴入前者，滴完后置于室温搅拌反应12h，加少量水终止反应，用乙酸乙酯20ml萃取2次，依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(氯仿:甲醇20:1)分离得到目标化合物，产率49.3％。
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实施例2
nodosin戊二酸单酯(16)的合成
将nodosin118.0mg(0.33mmol)，二氯甲烷5ml，三乙胺0.45ml(7.94mmol)，依次加入到100ml圆底烧瓶中，置于低温反应仪中搅拌，调节温度0℃左右，另取戊二酸酐148.8mg(1.30mmol)，用少量二氯甲烷溶解，将后者缓慢滴入前者，滴完后置于室温搅拌反应12h，加少量水终止反应，用乙酸乙酯20ml萃取2次，依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(氯仿:甲醇20:1)分离得到目标化合物，产率73.1％。
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实施例3
6-乙酰基nodosin(17)的合成
将nodosin138.4mg(0.38mmol)，二氯甲烷5ml，三乙胺0.45ml(7.94mmol)，依次加入到100ml圆底烧瓶中，置于低温反应仪中搅拌，调节温度0℃左右，另取乙酸酐0.4ml(4.23mmol)，用少量二氯甲烷溶解，将后者缓慢滴入前者，滴完后置于室温搅拌反应12h，加少量水终止反应，用乙酸乙酯25ml萃取2次，依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥、浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(二氯甲烷:丙酮20:1)分离得到目标化合物，产率15.0％。
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实施例4
6-苯甲酰基nodosin(18)的合成
将nodosin143.6mg(0.40mmol)，二氯甲烷5ml，三乙胺0.65ml(4.69mmol)，依次加入到100ml圆底烧瓶中，置于低温反应仪中搅拌，调节温度-5℃左右，另取苯甲酰氯0.27ml(2.35mmol)，用少量二氯甲烷溶解，将后者缓慢滴入前者，滴完后调节温度0℃搅拌反应4h，加少量水终止反应，用乙酸乙酯25ml萃取2次，依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率78.7％。
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实施例5
6-肉桂酰基nodosin(19)的合成
将nodosin142.6mg(0.39mmol)，二氯甲烷5ml，三乙胺0.55ml(3.98mmol)，依次加入到100ml圆底烧瓶中，置于低温反应仪中搅拌，调节温度-5℃左右，另取肉桂酰氯397.6mg(2.39mmol)，用少量二氯甲烷溶解，将后者缓慢滴入前者，滴完后调节温度0℃搅拌反应4h，加少量水终止反应，用乙酸乙酯25ml萃取2次，依次用稀酸溶液洗，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率15.5％。
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实施例6
6-甲氧基nodosin(21)的合成
将nodosin139.8mg(0.39mmol)，甲醇5ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率30.0％。
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实施例7
6-乙氧基nodosin(22)的合成
将nodosin113.0mg(0.31mmol)，乙醇5ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率44.7％。
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实施例8
6-异丙氧基nodosin(23)的合成
将nodosin136.0mg(0.38mmol)，异丙醇5ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)，得到目标化合物，产率38.4％。
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实施例9
6-苯甲氧基nodosin(24)的合成
将nodosin124.2mg(0.34mmol)，苯甲醇3ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(第一次：石油醚:乙酸乙酯20:1，第二次起：纯氯仿)分离得到目标化合物，产率96.6％。
hrms-esi(m/z):calcdforc27h32o6[m+na]+475.2091,found:475.2096；1h-nmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm):6.08,5.47(2×1h,s,h2-17),5.23(1h,dd,j＝10.0,8.00hz,h1-1β),5.03(1h,s,h-6α),4.46(1h,m,h-11α),4.10and3.97(2×1h,d,j＝10.0hz,h2-20),3.08(1h,dd,j＝10.0,4.0hz,h-13β),2.86(1h,s,h-5β),2.40(1h,d,j＝12.0hz,h-14β),2.12(1h,d,j＝10.0hz,h-9α),1.02and0.99(each3h,s,me-18,19),4.67and4.29(2×1h,d,j＝8.0hz,o-ch2-phenyl),7.24(4h,m,phenyl),7.14(1h,m,h-phenyl)；13c-nmr(100mhz,cdcl3,δ,ppm):78.2(c-1),24.2(c-2),37.5(c-3),31.6(c-4),54.8(c-5),104.1(c-6),171.6(c-7),55.3(c-8),47.3(c-9),49.0(c-10),66.8(c-11),41.9(c-12),37.6(c-13),34.6(c-14),199.9(c-15),149.7(c-16),118.2(c-17),33.4(c-18),23.5(c-19),74.1(c-20),68.5(o-ch2-pheny),137.90(c1’-phenyl),128.32(c3’,c5’phenyl),127.89(c2’,c6’-phenyl),127.52(c4’-phenyl)。
实施例10
6-丙炔氧基nodosin(25)的合成
将nodosin128.8mg(0.36mmol)，丙炔醇3ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率65.7％。
hrms-esi(m/z):calcdforc23h28o6[m+na]+423.1778,found:423.1777；1h-nmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm):6.04and5.48(2×1h,s,h2-17),5.23(1h,dd,j＝10.0,8.00hz,h1-1β),4.77(1h,s,h-6α),4.55(1h,m,h-11α),4.02and3.91(2×1h,d,j＝10.0hz,h2-20),3.08(1h,dd,j＝10.0,4.0hz,h-13β),2.86(1h,s,h-5β),2.40(1h,d,j＝12.0hz,h-14β),2.12(1h,d,j＝10.0hz,h-9α),1.02and0.99(each3h,s,me-18,19),4.07(2h,s,h-propynyl),2.24(1h,s,h-propynyl)；13c-nmr(100mhz,cdcl3,δ,ppm):78.4(c-1),24.2(c-2),37.5(c-3),31.6(c-4),54.8(c-5),105.6(c-6),171.6(c-7),55.3(c-8),47.3(c-9),49.0(c-10),66.0(c-11),41.9(c-12),37.6(c-13),34.6(c-14),199.9(c-15),149.6(c-16),118.4(c-17),33.4(c-18),23.3(c-19),73.6(c-20),66.5(c-1’-propynyl)。
实施例11
6-环丙甲氧基nodosin(26)的合成
将nodosin132.0mg(0.36mmol)，环丙甲醇3ml，依次加入到100ml圆底烧瓶中，加少量浓盐酸，置于磁力搅拌器上，室温搅拌反应72h，加乙酸乙酯25ml萃取2次，水洗，分离有机层，无水硫酸镁干燥，浓缩得粗品，将粗品硅胶柱层析(正己烷:乙酸乙酯2:1)分离得到目标化合物，产率88.1％。
hrms-esi(m/z):calcdforc24h32o6[m+na]+439.2091,found:439.2099；1h-nmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm):6.02and5.47(2×1h,s,h2-17),5.27(1h,dd,j＝10.0,8.00hz,h1-1β),4.88(1h,s,h-6α),4.57(1h,m,h-11α),3.97and3.83(2×1h,d,j＝10.0hz,h2-20),3.08(1h,dd,j＝10.0,4.0hz,h-13β),2.86(1h,s,h-5β),2.40(1h,d,j＝12.0hz,h-14β),2.12(1h,d,j＝10.0hz,h-9α),1.02and0.99(each3h,s,me-18,19).3.40(2h,h-1’)；13c-nmr(100mhz,cdcl3,δ,ppm):78.2(c-1),24.2(c-2),37.5(c-3),31.6(c-4),54.8(c-5),105.6(c-6),171.6(c-7),55.3(c-8),47.3(c-9),49.0(c-10),66.3(c-11),41.9(c-12),37.6(c-13),34.6(c-14),199.9(c-15),149.6(c-16),118.4(c-17),33.4(c-18),23.3(c-19),73.6(c-20),70.9(c-1’),10.64(c-2’)。
实施例12
nodosin及其衍生物的抗癌细胞活性测定
实验设备与试剂：
仪器：高压灭菌锅：ldzx-50kbs，上海申安医疗器械厂；超低温冰箱：900series，thermoscientific；全波长多功能读数仪(spectramaxi3，美国md公司)；co2恒温培养箱：labservco-150，thermofisherscientific；
试剂：dmem高糖培养基(hyclone公司)；胎牛血清(gibco公司)；cck8(cellcountingkit-8)(碧云天生物技术研究所)；96孔板(corning公司)；
细胞株：人肝癌hepg2，人髓性白血病细胞k562细胞株购于中国科学院上海细胞库，新乡医学院药学院实验室传代培养，采用含10wt％胎牛血清的dmem高糖培养基，37℃、体积分数为5％co2条件下常规培养。
实验方法：
cck8检测细胞增殖抑制率，取对数生长期的hepg2、k562细胞，加0.25wt％胰酶制成细胞悬液，细胞浓度3×104/ml，接种于96孔板，每孔100μl，空白孔加100μldmem高糖培养基,置于37℃、体积分数为5％co2培养箱培养24h，实验组更换新的含不同浓度被测样品的培养基，每个浓度4个复孔，对照组则换含等体积溶剂的培养基，继续培养48h，每孔加入cck810μl继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度a值，按下列公式计算抑制率：细胞增殖抑制率＝[1-(a给药组-a空白孔)/(a阴性对照组-a空白孔)]×100﹪,并计算半数抑制浓度(ic50)。
实验结果：
cck8检测hepg2、k562细胞增殖抑制率，计算各化合物对hepg2、k562半数抑制浓度(ic50)，结果见表1。
表1nodosin及其衍生物对hepg2、k562半数抑制浓度(ic50)
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都要求落入本发明的保护范围之内。