本发明属于生物工程及生物有机肥用领域，涉及一种产吲哚乙酸的定向育种方法。具体地讲，本发明涉及一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法。
背景技术
植物促生菌是一类广泛存在于植物土壤、根际、叶际范围，能够促进植物生长或拮抗病原菌的有益细菌。植物促生菌可研发成多种微生物菌肥或微生物农药，发挥其促生和防治功能。多粘类芽孢杆菌是类芽孢杆菌属中的一种革兰氏阳性菌，可以产生多种抗菌物质及生理活性物质，被认为是一种很有效的植物生长促进根际微生物。多粘类芽孢杆菌作为植物促生菌，具有微生物农药和微生物菌肥的双重作用。多粘类芽孢杆菌的生防促生活性包括固氮、诱导植物的有关基因的表达、溶解土壤中的磷、产生多种抗菌物质及生理活性物质，如多粘菌素、细胞分裂素、植物生长素(吲哚乙酸，indole-3-aceticacid，iaa)等。
iaa是天然植物生长素的主要活性成分，可增加植物根的大小和分布，有利于植物根从土壤中吸收更多的营养物质。多粘类芽孢杆菌可以通过分泌iaa促进宿主植物生长。例如，在未额外添加l-色氨酸的条件下，多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxarc05的iaa产量为6.8μg/ml；在额外添加25μg/ml的l-色氨酸的条件下，p.polymyxarc05能产生32.8μg/ml的iaa。
自然状态下筛选得到的多粘类芽孢杆菌产iaa的能力相对较弱，使多粘类芽孢杆菌产iaa特性的应用受到限制。对具有分泌iaa能力的多粘类芽孢杆菌进行诱变育种，提高iaa的产率，将更利于多粘类芽孢杆菌在农业生产中的应用。目前对野生型菌株进行诱导育种来提高iaa产量的方法主要有：1.诱变剂诱变育种。对解淀粉芽孢杆菌sc008进行紫外线和硫酸二乙酯复合诱变处理后，测定突变体发酵液中iaa含量，选出iaa产量最高的解淀粉芽孢杆菌sc008突变体，其iaa产量提高了1.63倍；2.微波诱变育种。对红豆草根瘤菌rs-1进行微波诱变处理后，测定突变体发酵液中iaa含量，选出iaa产量最高的突变体，其iaa产量提高了1.67倍。此外，通过转基因方法构建重组细胞也可有效提高菌株的iaa产量。重组解淀粉芽孢杆菌sqr9-e的iaa产量提高了4.2倍；重组枯草芽孢杆菌168-e的iaa产量提高了10倍。
现有技术的缺陷在于：采用诱变剂对菌种诱变产生的突变库很难在培养平板上定向选育，由于缺乏对吲哚乙酸的特异性显色剂，所以只有通过对突变库的突变体进行培养后配合液相检测分析，这种筛选效率只有万分之一到十万分之一的概率获得优秀菌株。此外，吲哚乙酸作为多粘类芽孢杆菌的次生代谢物，目前的研究文献表明吲哚乙酸在细菌上生物合成的主要前体物质为色氨酸，不同的微生物基于色氨酸合成吲哚乙酸的途径有5类，涉及几十种关键的酶，所以很难通过分子手段直接改造某个基因进行定向育种。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，以解决现有多粘类芽孢杆菌高产吲哚乙酸中存在的关键技术问题，
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，包括以下主要步骤：
①、多粘类芽孢的芽孢化培养
将野生多粘类芽孢杆菌(cicc10580)接种至100ml的培养基a中，于30℃、220rpm/min条件下培养40～48h后显微镜镜检，待其完全芽孢化；培养基a组成为：蔗糖10g/l，豆粕粉20g/l，ph＝7.4；
②、5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择
取步骤①中的芽孢接种至培养基b中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基b中分别添加不同浓度的5-氟色氨酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率为50％的添加浓度；培养基b组成为：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
③、氨基酸协同5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择
取步骤①中的芽孢接种至培养基c中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基c中分别添加1mg/ml的19种氨基酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率达到95％的氨基酸添加组；培养基c组成为：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸3g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
④、亚硝基胍(ntg)对多粘类芽孢杆菌的诱变
离心收集步骤①中的芽孢，用0.1mol/l、ph＝6.8的pbs洗涤芽孢3次，并用0.1mol/l、ph＝6.8的pbs重新悬浮芽孢达1×108cuf/ml，添加终浓度为45ug/ml的ntg，30℃、160rpm/min的条件下处理30min(致死率为50％)；
⑤、甘氨酸联合5-氟色氨酸培养平板定向筛选培养
离心收集步骤④中的芽孢，用pbs洗涤芽孢3次终止诱变，并用pbs重新悬浮芽孢，将悬浮液涂布至定向培养平板培养基d，放置30℃恒温培养48h；培养基d组成为：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸3g/l，甘氨酸1g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
⑥、多粘类芽孢杆菌突变株产吲哚乙酸能力分析
从步骤⑤获得的平板上随机挑起100个多粘类芽孢杆菌突变株，并对该100个多粘类芽孢杆菌突变株进行产吲哚乙酸(iaa)能力分析；将多粘类芽孢杆菌突变株分别接种至5ml液体培养基e中，30℃、260rpm/min摇床培养24h，对培养液中吲哚乙酸做液相检测定量分析，对其中的最高产吲哚乙酸菌株进行保种；培养基e组成为：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸0.2g/l，ph＝7.4。
本发明的选育方法高效、定向性强、周期短等优势，后代有81％的突变菌株高产吲哚乙酸，达到1mg/ml；其中突变菌株11025a达到2.24mg/ml，是原始野生菌株的28倍。
与现有技术相比，本发明的优点在于能快速准确的从突变的芽孢库中分离出高产吲哚乙酸的后代；
(1)采用氨基酸联合5-氟色氨酸作为筛选平板，能有效的将ntg诱变库中高产吲哚乙酸的突变菌株选择性的培养；5-氟色氨酸作为色氨酸的结构类似物，能和色氨酸竞争性合成蛋白质，色氨酸合成能力强的菌株具备克服5-氟色氨酸的抑制作用，由于氨基酸的加入可以提高细胞的通透性，进一步提高了5-氟色氨酸的筛选压力，为有效筛选出吲哚乙酸高产菌株提供了准确性，大大减少了从突变后代中筛选的盲目性，明显减少筛选周期和工作量；
(2)以多粘类芽孢杆菌的芽孢作为诱变对象，相对于以营养体为诱变对象具有诱变过程更加可控、重复性好、后代不需要进一步的纯化等优点；由于营养体细胞有些处于细胞增殖过程中，含有多个基因组，而芽孢只含有一个基因组，诱变后含有多个基因组的营养体细胞的性状不稳定。
附图说明
图1是本发明一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法技术流程图；
图2是本发明实施例方法一中突变株产吲哚乙酸能力分析图；
图3是本发明实施例方法二中突变株产吲哚乙酸能力分析图；
图4是本发明实施例方法三中突变株产吲哚乙酸能力分析图；
图5是本发明实施例方法四中突变株产吲哚乙酸能力分析图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
下列实施例中所采用的菌种均来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，多粘类芽孢杆菌芽孢(cicc10580)。
①、5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断试验
培养基a：蔗糖10g/l，豆粕粉20g/l，ph＝7.4；
培养基b：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
将多粘类芽孢杆菌芽孢接种至100ml的培养基a中，于30℃、220rpm/min条件下培养48h完全芽孢化；取所述芽孢接种至培养基b中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基b中分别添加不同浓度的5-氟色氨酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率为50％的添加浓度；其中5-氟色氨酸在培养基b中添加3mg/ml时达到对多粘类芽孢杆菌芽孢50％的抑制生长效果，结果见表1：
表1不同浓度下5-氟色氨酸对多粘芽孢杆菌生长的影响
②、氨基酸协同5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断试验
培养基c：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸3g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
将多粘类芽孢杆菌芽孢接种至100ml培养基a中，于30℃、220rpm/min条件下培养48h完全芽孢化；取上述芽孢接种至培养基c中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基c中分别添加1mg/ml的19种氨基酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率达到95％的氨基酸添加组；其中在培养基c中添加1mg/ml的甘氨酸时达到对多粘类芽孢杆菌芽孢95％的抑制生长效果，结果见表2：
表25-氟色氨酸与氨基酸组合对多粘芽孢杆菌生长的影响
③、亚硝基胍(ntg)对多粘类芽孢杆菌的诱变浓度
将多粘类芽孢杆菌芽孢接种至100ml培养基a中，于30℃、220rpm/min条件下培养48h完全芽孢化；离心收集上述芽孢，并通过0.1mol/l、ph＝6.8的pbs洗涤芽孢3次，并用0.1mol/l、ph＝6.8的pbs重新悬浮芽孢达1×108cuf/ml，分别添加不同浓度的ntg，30℃、160rpm/min的条件下处理30min；然后离心收集并用上述pbs洗涤芽孢3次，并用pbs重新悬浮芽孢，通过梯度稀释平板计数法(培养基b)测量芽孢存活率，其中ntg浓度为45ug/ml时，芽孢致死率为50％，结果见表3：
表3ntg对多粘芽孢杆菌生长的影响
④、ntg诱变联合5-氟色氨酸、甘氨酸平板培养筛选
培养基d：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸3g/l，甘氨酸1g/l，琼脂粉15g/l，ph＝7.4；
将多粘类芽孢杆菌芽孢接种100ml培养基a中，于30℃、220rpm/min条件下培养48h完全芽孢化；离心收集上述芽孢，并通过0.1mol/l、ph＝6.8的pbs洗涤芽孢3次，并用0.1mol/l、ph＝6.8的pbs重新悬浮芽孢达1×108cuf/ml；方法一：加入45ug/ml的ntg，30℃、160rpm/min的条件下处理30min；然后离心收集并用上述pbs洗涤芽孢3次，并用pbs重悬浮芽孢，将上述悬浮液涂布至平板培养基d，放置30℃恒温培养48h；方法二：加入45ug/ml的ntg，30℃、160rpm/min的条件下处理30min；然后离心收集并用上述pbs洗涤芽孢3次，并用pbs重悬浮芽孢，将上述悬浮液涂布至平板培养基c，放置30℃恒温培养48h；方法三：不用ntg处理，直接将重悬浮的芽孢涂布至平板培养基d，放置30℃恒温培养48h；方法四：不用ntg处理，直接将重悬浮的芽孢涂布至平板培养基c，放置30℃恒温培养48h；
5、挑选多粘类芽孢杆菌突变株与产吲哚乙酸能力分析
培养基e：蔗糖10g/l，酵母粉20g/l，5-氟色氨酸0.2g/l，ph＝7.4；
分别从上述四个方法获得的平板上随机挑起100个细菌克隆，并对该400个多粘类芽孢杆菌突变株进行产吲哚乙酸(iaa)能力分析；将上述克隆分别接种至5ml液体培养基e中，30℃、260rpm/min摇床培养24h，培养液中iaa分析方法如下：吸取发酵液2ml，加入18ml水，再加入20ml乙酸乙酯，剧烈震荡5min后至125ml分液漏斗中分层，分别收集下层水相和上层乙酸乙酯相，下层水相再用20ml乙酸乙酯重复萃取一次，并收集该次乙酸乙酯相和上次乙酸乙酯相合并，通过旋转蒸发仪45℃蒸干，再加入10ml流动相(甲醇∶水＝35∶65，v/v，含2％冰醋酸)溶解，采用agilentc18柱(4.6mm×250mm)色谱柱、柱温25℃、流速0.5ml/min进行分析；样品分析结果显示方法一处理获得的克隆有81％产iaa大于1g/l(见图2)，显著高于单纯的方法二(p<0.05)、方法三(p<0.05)和方法四(p<0.05)(图3，图4，图5)；其中方法一中获得了三株高产iaa菌株，发酵液中浓度分别为2.24g/l、2.12g/l、1.99g/l，相比原始菌株、方法二、方法三、方法四分别高出28倍、2.3倍、4.57倍、4.87倍(见表4)：
表45-氟色氨酸协调甘氨酸对多粘芽孢杆菌突变体发酵产吲哚乙酸(iaa)的影响