一种磺胺二甲氧嘧啶人工抗原合成的方法与流程

本发明涉及一种酶联免疫检测使用的抗原抗体，尤其涉及的是一种磺胺二甲氧嘧啶人工合成抗原的制备及应用。

背景技术

目前，农兽药残留已给我国食品的安全供应带来严重的危，药物残面涉及的药物种类越米越多，磺胺二甲氧嘧啶(sdm)也是其中之一。磺胺二甲氧嘧啶是一种人造抗生素，作为饲料添加剂广泛添加到动物料中。目前农兽药残留物的检测测多通过酶联免疫分析的方法，通过特异的抗体抗原反应，来检测外来抗原的存在。磺胺二甲氧嘧啶是小分子化合物必须同载体蛋白结合形成全抗原，从而诱导抗体的产生，sdm是小分子化合物，结构简单，分子量小(310.3)，存在活性基团伯氨基，通过重氮化反应引入偶氮键(-n＝n-)作间隔臂，间隔臂的引入遵循3个原则：①引入后不产生新的抗原决定簇，避免引起交叉反应；②性质稳定，长度适宜，免疫原性增强，足够刺激免疫动物产生抗体；③修饰过程中的化学反应简单易行。据此，以活性基团氨基作为间隔臂，经重氮化合成人工抗原sdm。影响人工抗原免疫原性的因素有多种，但主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)、兔血清白蛋白(rsa)及人工合成的多聚赖氨酸(ε-pl)等。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是获得高质量的高特异性的磺胺二甲氧嘧啶人工合成抗原；本发明以(-n＝n-)作间隔臂，长度适宜，既产生了针对sdm的特异性抗体，又避免了桥抗体的出现。使得偶联率大大增加，增加了抗原的免疫原性。从免疫效价测定结果来看，该人工合成的sdm-bsa抗原具有很高的免疫原性，免疫骆驼，效价可以达到1：16000-1:64000。

一定长度间隔臂的介入，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生，间隔臂过长可形成新的抗原表位，易被细胞识别而产生“桥抗体”，间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：抗原合成方法：

a液制备：50.0mg牛血清白蛋白(bsa)溶于2ml1mol/lna2co3水溶液中，4℃冰浴20min；

b液制备：33.5mg磺胺二甲氧嘧啶(sdm)溶于500μl二甲基甲酰胺(dmf)中并加入3ml1mol/lhcl溶液中，完全溶解后冰浴30min；

c液制备：称取11mg亚硝酸钠(nano2)溶于1ml蒸馏水中，冰浴30min；

d液制备：将c液逐滴加入b液中，冰浴反应并摇匀，10分钟后，取1滴到淀粉碘化钾试纸上，若试纸颜色变紫，则向d液中加入少量尿素再测，直到试纸颜色不变紫为止。

步骤：将d液逐滴加入到a液中，使其反应。反应过程始终保持混合液ph＝9.0，反应条件为4℃，磁力搅拌6h。反应结束后用0.01mph＝7.4磷酸盐缓冲液(pbs)透析3天，每天更换透析液两次。即制备得sdm-bsa人工合成抗原。(注意：第一步反应结束，d液呈黄色，第二步反应结束，人工合成抗原终产物呈铁锈红色。)nanodrop2000测定合成的sdm-bsa抗原，浓度为13.6mg/ml。

与现有技术相比，本发明以(-n＝n-)作间隔臂，长度适宜，既产生了针对sdm的特异性抗体，又避免了桥抗体的出现。使得偶联率大大增加，增加了抗原的免疫原性。从免疫效价测定结果来看，该人工合成的sdm-bsa抗原具有很高的免疫原性，免疫骆驼，效价可以达到1：16000-1:64000。

附图说明

图1：sdm-bsa人工抗原合成途径；

图2：sdm-bsa人工抗原sds-page电泳图；

图3：sdm-bsa人工抗原紫外扫描图；

图4：免疫鸡后收集鸡蛋检测抗体效价；

图5：免疫骆驼后检测血清中的抗体效价；

具体实施方式

下面详细说明本发明的优选实施方式。

实施例1：参照图1，为本发明实施例1的化学合成途径图，本发明在fleeker和lovett的重氮化法基础上，加以改进，获得了高质量的磺胺二甲氧嘧啶人工合成抗原：

a液制备：50.0mg牛血清白蛋白(bsa)溶于2ml1mol/lna2co3水溶液中，4℃冰浴；

b液制备：33.5mg(磺胺二甲氧嘧啶)sdm溶于500μl(二甲基甲酰胺)dmf中并加入3ml1mol/lhcl溶液中，完全溶解后冰浴30分钟；

c液制备：称取11mg(亚硝酸钠)nano2溶于1ml蒸馏水中，冰浴；

d液制备：将c液逐滴加入b液中，冰浴反应并摇匀，10分钟后，取1滴到淀粉碘化钾试纸上，若试纸颜色变紫，则向d液中加入少量尿素再测，直到试纸颜色不变紫为止。

步骤：将d液逐滴加入到a液中，使其反应。反应过程始终保持混合液ph＝9.0，反应条件为4℃，磁力搅拌6h。反应结束后用0.01mph＝7.4(磷酸盐缓冲液)pbs透析3天，每天更换透析液两次。即制备得sdm-bsa人工合成抗原。(注意：第一步反应结束，d液呈黄色，第二步反应结束，人工合成抗原终产物呈铁锈红色。)nanodrop2000测定合成的sdm-bsa抗原，浓度为13.6mg/ml。

实施例2：参照图2，为本发明实施例2的sdm-bsa人工抗原sds-page电泳图，sds-page凝胶电泳鉴定,人工合成sdm-bsa抗原用非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)跑胶，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％，浓缩胶电压120v，分离胶电压80v，上样量为10μl，考马斯亮蓝染色3～4h，置脱色液中过夜脱色，可见未偶联sdm的bsa和偶联了sdm的bsa蛋白条带发生了明显的变化，证明偶联成功。

实施例3：参照图3，为本发明实施例3sdm-bsa人工抗原的紫外扫描图，紫外扫描鉴定，用pbs配制sdm和bsa标准溶液，取一定量的bsa-sdm溶于pbs，用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度，据此浓度调节bsa-sdm溶液中蛋白质的浓度，使其与bsa标准溶液一致，在波长220～400nm范围内进行紫外扫描；bsa的最大吸收峰在278nm,sdm的最大吸收峰在266nm，bsa与sdm偶联后，两者的峰叠加并位移至267nm，表明偶联成功；bsa-sdm在350nm处出现一新的偶氮吸收峰，这同其合成产物中形成一n＝n一基团的结构是一致的。

实施例4：参照图4图5和表1，为本发明实施例4免疫动物方法及免疫效价测定图，将人工合成的bsa-sdm抗原免疫双峰驼和鸡，免疫程序如表1；

表1：抗原免疫动物免疫程序表

注：一免用弗氏完全佐剂乳化，二免到五免用弗氏不完全佐剂乳化。

分别用酶联免疫吸附试验(elisa)测定抗体效价，鸡二免以后抗体水平逐渐上升，最高(四免)达到1：256000，并保持一个月效价不降低(图4)；骆驼三免以后抗体水平逐渐上升，五免后抗体水平达到1:512000(图5)。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。