一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法及试剂盒。

背景技术

痛风(gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病，与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄不畅所致的高尿酸血症直接相关，特指急性特征性关节炎和慢性痛风石疾病，主要包括急性发作性关节炎、痛风石形成、痛风石性慢性关节炎、尿酸盐肾病和尿酸性尿路结石，重者可出现关节残疾和肾功能不全。痛风常伴腹型肥胖、高脂血症、高血压、2型糖尿病及心血管病等表现。由于生活水平的提高和饮食结构的改变，痛风发病率呈逐年上升趋势，欧美等痛风患病率有1.4-3.9％，中国的发病率为0.15-1.14％。痛风早期的临床表现为间断发作性急性关节炎，主要为单关节受累，肿痛一般持续7-10天，可通过药物或自发缓解，间歇期无症状。随着病程的延长，痛风发作次数、受累关节数逐渐增加，间歇期也开始出现症状，同时关节或皮肤软组织中痛风石形成，严重者出现关节毁损或致残，出现肾脏结石、慢性肾损伤等，最终可能发展成慢性肾功能衰竭。

abcg2为abc转运蛋白超家族g亚家族第2成员，是一种atp结合转运蛋白，在人的正常细胞和肿瘤组织中均有表达，具有抑制消化道吸收某些外源性物质，参与形成血脑、胎血屏障等生理功能。同时abcg2也是新的药物排出泵，是肿瘤多药耐药的重要机制之一。abcg2基因的单核苷酸多态性可能影响abcg2蛋白的表达与功能，与疾病的易感性及药动学等相关。人类abcg2基因位于4q22～23，编码655个氨基酸残基。abcg2全长66kb，由16个外显子和15个内含子组成，外显子为60～332bp不等。研究表明，其126位氨基酸如果从谷酰胺(glnq)突变为其他氨基酸(x)，即q126x，其第141位氨基酸如果从谷酰胺(glnq)突变为赖氨酸(lysk)，即q141k，就会造成abcg2蛋白的功能失调，从而造成机体高尿酸血症，从而引起痛风。所以检测abcg2基因q126x，q141k突变可以为痛风的早期诊断提供参考依据。slc2a9基因位于人常染色体4p15.3-16，包括12个外显子和11个内含子，长195kb，编码由540个氨基酸组成的葡糖糖转运蛋白，参与维持体内葡糖糖代谢的相对稳定和平衡，也有多个研究发现该蛋白与尿酸代谢也密切相关。slc2a9是一种高亲和力、高容量、电压敏感性和ph依赖性的尿酸盐/己糖转运体，在肾脏主要发挥对尿酸的重吸收作用，基因功能丧失将导致特发性肾性低尿酸血症。欧洲、美国、日本、非洲等多个人群的血尿酸水平与slc2a9基因的snp有关。

目前检测abcg2和slc2a9突变的方法还是dna直接测序法，然而直接测序法灵敏度低，只有20-30％，检测步骤繁琐，效率低下，至少需要2-3天时间才能出结果；并且如果样本基因组dna含量稀少时，直接测序法会导致大量的漏检和假阴性。所以特别要一种高灵敏度和高特异性的检测方法来实现基因突变的检测。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述现有技术中的不足，提供一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法及试剂盒。

一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)针对abcg2和slc2a9基因设计特异性引物；

(2)利用特异性pcr扩增出包含abcg2和slc2a9基因的目的片段；

(3)利用限制性内切酶消化pcr产物片段；

(4)进行单碱基延伸反应；

(5)进行脱盐纯化处理；

(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因abcg2和slc2a9基因的序列。

上述人类痛风相关基因突变位点的检测方法，检测准确性高，同金标准sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测dna质谱，能检测出样本中的三等位snp位点的存在，实验可重性高。该方法在检测通量上面比起传统的snp位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测snp位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求，是检测snp位点的理想工具。

在其中一个实施例中，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增abcg2和slc2a9基因基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含三条abcg2基因的正向引物seqidnos：1、seqidnos：3、seqidnos：5，和三条abcg2基因的反向引物seqidnos：2、seqidnos：4、seqidnos：6，以及一条slc2a9基因的正向引物seqidnos：7，和一条slc2a9基因的反向引物seqidnos：8，

abcg2基因的正向引物seqidnos：1的序列为：ccacatcaataacttttcctgtaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：2的序列为：cccaaaaaagcagcactgtgg，

abcg2基因的正向引物seqidnos：3的序列为：gatagatcacatgtaatgccat，

abcg2基因的反向引物seqidnos：4的序列为：gtttccaaagttcttcctgtt

abcg2基因的正向引物seqidnos：5的序列为：ccactgtgcccggcctattgaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：6的序列为：tcaggccattcatggaatg

slc2a9基因的正向引物seqidnos：7的序列为：gacaccaggcggatgctcct，

slc2a9基因的反向引物seqidnos：8的序列为：gtttgcagccttccaaacgttc。

在其中一个实施例中，所述步骤(2)中特异性pcr扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括abcg2和slc2a9基因的单碱基延伸引物，所述abcg2基因的单碱基延伸引物包含四条单碱基延伸引物seqidnos：9，seqidnos：10，seqidnos：11，seqidnos：12，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：9的序列为：ttccctaaattaacatatccta，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：10的序列为：acaggtttctgattaaataac，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：11的序列为：gaaattatatcaagtgtcttttctctc，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：12的序列为：caggtactctacattttgatggc，

所述slc2a9基因的单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸引物seqidnos：13，

slc2a9基因单碱基延伸引物seqidnos：13的序列为：gacctcctctacctcttgggaaa。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：

(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

本发明还提供了一种人类痛风相关基因突变位点的检测试剂盒，包括用于扩增abcg2和slc2a9基因基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含三条abcg2基因的正向引物seqidnos：1、seqidnos：3、seqidnos：5，和三条abcg2基因的反向引物seqidnos：2、seqidnos：4、seqidnos：6，以及一条slc2a9基因的正向引物seqidnos：7，和一条slc2a9基因的反向引物seqidnos：8，

abcg2基因的正向引物seqidnos：1的序列为：ccacatcaataacttttcctgtaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：2的序列为：cccaaaaaagcagcactgtgg，

abcg2基因的正向引物seqidnos：3的序列为：gatagatcacatgtaatgccat，

abcg2基因的反向引物seqidnos：4的序列为：gtttccaaagttcttcctgtt

abcg2基因的正向引物seqidnos：5的序列为：ccactgtgcccggcctattgaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：6的序列为：tcaggccattcatggaatg

slc2a9基因的正向引物seqidnos：7的序列为：gacaccaggcggatgctcct，

slc2a9基因的反向引物seqidnos：8的序列为：gtttgcagccttccaaacgttc。

上述人类痛风相关基因突变位点的检测试剂盒，简化了实验流程，人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括abcg2和slc2a9基因的单碱基延伸引物，所述abcg2基因的单碱基延伸引物包含四条单碱基延伸引物seqidnos：9，seqidnos：10，seqidnos：11，seqidnos：12，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：9的序列为：ttccctaaattaacatatccta，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：10的序列为：acaggtttctgattaaataac，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：11的序列为：gaaattatatcaagtgtcttttctctc，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：12的序列为：caggtactctacattttgatggc，

所述slc2a9基因的单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸引物seqidnos：13，

slc2a9基因单碱基延伸引物seqidnos：13的序列为：gacctcctctacctcttgggaaa。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果；

(1)本发明所述的人类痛风相关基因突变位点的检测方法在检测通量上面比起传统的snp位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，是检测snp位点的理想工具；

(2)本发明所述的人类痛风相关基因突变位点的检测方法检测准确性高，同金标准sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测dna质谱，能检测出样本中的三等位snp位点的存在，实验可重性高。

(3)本发明所述的人类痛风相关基因突变位点的检测方法低成本、性价比高，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测snp位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求。

(4)本发明所述的基因序列snp位点核酸质谱检测方法实验流程简单、人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高，数据处理软件处理方便，报告结果清晰易懂。

附图说明

图1为本发明一实施例的核酸质谱分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)针对abcg2和slc2a9基因设计特异性引物；

(2)利用特异性pcr扩增出包含abcg2和slc2a9基因的目的片段；

(3)利用限制性内切酶消化pcr产物片段；

(4)进行单碱基延伸反应；

(5)进行脱盐纯化处理；

(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因abcg2和slc2a9基因的序列。

本发明所述的人类痛风相关基因突变位点的检测方法主要基于pcr和单碱基延伸技术，其原理是首先通过pcr引物对含待检snp的目标片段进行扩增，pcr结束后加入限制性内切酶去除反应液中的dntp。然后在反应液中加入snp延伸引物及ddntp等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中snp延伸引物可与待检测snp的5’端序列结合并延伸一个碱基，根据不同snp模板可得到不同的延伸产物。

优选地，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增abcg2和slc2a9基因基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含三条abcg2基因的正向引物seqidnos：1、seqidnos：3、seqidnos：5，和三条abcg2基因的反向引物seqidnos：2、seqidnos：4、seqidnos：6，以及一条slc2a9基因的正向引物seqidnos：7，和一条slc2a9基因的反向引物seqidnos：8，

abcg2基因的正向引物seqidnos：1的序列为：ccacatcaataacttttcctgtaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：2的序列为：cccaaaaaagcagcactgtgg，

abcg2基因的正向引物seqidnos：3的序列为：gatagatcacatgtaatgccat，

abcg2基因的反向引物seqidnos：4的序列为：gtttccaaagttcttcctgtt

abcg2基因的正向引物seqidnos：5的序列为：ccactgtgcccggcctattgaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：6的序列为：tcaggccattcatggaatg

slc2a9基因的正向引物seqidnos：7的序列为：gacaccaggcggatgctcct，

slc2a9基因的反向引物seqidnos：8的序列为：gtttgcagccttccaaacgttc。

相比于其他传统的检测abcg2和slc2a9基因基因的技术手段，本发明经检测abcg2和slc2a9基因基因区域的snp位点，这一点就与传统的荧光定量pcr、或sanger测序法较为不同。正如上述核酸质谱的原理，利用核酸质谱检测方法仅在目的区域snp位点延伸一个具有多态性的碱基，不需要检测整个特异性扩增的基因片段。整体检测的通量、实验时间、反应成本、结果进度均较传统方法有很大的提升及优化，具有很好的市场应该价值。

优选地，所述步骤(2)中特异性pcr扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。

优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括abcg2和slc2a9基因的单碱基延伸引物，所述abcg2基因的单碱基延伸引物包含四条单碱基延伸引物seqidnos：9，seqidnos：10，seqidnos：11，seqidnos：12，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：9的序列为：ttccctaaattaacatatccta，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：10的序列为：acaggtttctgattaaataac，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：11的序列为：gaaattatatcaagtgtcttttctctc，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：12的序列为：caggtactctacattttgatggc，

所述slc2a9基因的单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸引物seqidnos：13，

slc2a9基因单碱基延伸引物seqidnos：13的序列为：gacctcctctacctcttgggaaa。

优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。

优选地，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：

(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

核酸质谱检测时通过将反应液与树脂混合进行离子交换，用于去除液体中吸附于dna片段上的k⁺、na⁺、mg²⁺等离子，防止其干扰质谱检测结果。

反应液与基质在靶板上结晶，进行质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物分子量不同，因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰，然后判断该样品的snp分型。核酸质谱平台特异性良好，使用国际通用标准品能达到30ppm，最低检测限为5ng基因组dna,对比试验选择的金标准验证技术为sanger测序技术和同类型获批的检测产品，符合性均为100％。

一种hla-b*5801基因的检测试剂盒，包括用于扩增abcg2和slc2a9基因基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含三条abcg2基因的正向引物seqidnos：1、seqidnos：3、seqidnos：5，和三条abcg2基因的反向引物seqidnos：2、seqidnos：4、seqidnos：6，以及一条slc2a9基因的正向引物seqidnos：7，和一条slc2a9基因的反向引物seqidnos：8，

abcg2基因的正向引物seqidnos：1的序列为：ccacatcaataacttttcctgtaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：2的序列为：cccaaaaaagcagcactgtgg，

abcg2基因的正向引物seqidnos：3的序列为：gatagatcacatgtaatgccat，

abcg2基因的反向引物seqidnos：4的序列为：gtttccaaagttcttcctgtt

abcg2基因的正向引物seqidnos：5的序列为：ccactgtgcccggcctattgaa，

abcg2基因的反向引物seqidnos：6的序列为：tcaggccattcatggaatg

slc2a9基因的正向引物seqidnos：7的序列为：gacaccaggcggatgctcct，

slc2a9基因的反向引物seqidnos：8的序列为：gtttgcagccttccaaacgttc。

优选地，所述试剂盒还包括abcg2和slc2a9基因的单碱基延伸引物，所述abcg2基因的单碱基延伸引物包含四条单碱基延伸引物seqidnos：9，seqidnos：10，seqidnos：11，seqidnos：12，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：9的序列为：ttccctaaattaacatatccta，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：10的序列为：acaggtttctgattaaataac，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：11的序列为：gaaattatatcaagtgtcttttctctc，

abcg2基因单碱基延伸引物seqidnos：12的序列为：caggtactctacattttgatggc，

所述slc2a9基因的单碱基延伸引物包含一条单碱基延伸引物seqidnos：13，

slc2a9基因单碱基延伸引物seqidnos：13的序列为：gacctcctctacctcttgggaaa。

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：利用核酸质谱检测方法对人abcg2和slc2a9基因的检测

1.人基因组dna提取

(1)在生物安全柜中对病人的血液样本进行基因组dna提取操作。采用blood&cellculturednaminikit(qiagencatno:13323)进行提取实验。

(2)引物设计

针对人abcg2和slc2a9基因进行snp位点引物设计，分别针对这个snp设计特异性的pcr引物和单碱基延伸引物，所设计的pcr引物序列如表1所示。

表1

(3)特异性pcr反应

利用特异性pcr技术扩增出包含abcg2和slc2a9基因的目的片段，按照表2的反应体系配制扩增反应，反应体系配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。

表2

表3

(4)碱式磷酸酶消化处理

利用虾碱式磷酸酶对多重pcr反应产物进行消化，去除体系内多余的dntp。每个反应体系中加入0.5u的碱式磷酸酶，用配套的10*tris-buffer调节缓冲液浓度，每个反应加入10*tris-buffer0.5ul。然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟，然后85℃加热变性5分钟，最后冰浴10分钟。

(5)进行单碱基延伸反应

配制单碱基延伸反应体系，按照表4的反应体系配置。取2ul配制好的单碱基延伸反应的反应液加入到前步消化反应的体系内，然后按照表5的反应程序进行单碱基延伸反应。

表4

表5

(6)产物脱盐纯化及核酸质谱上机前处理

(a)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(b)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(c)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(d)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

(7)核酸质谱仪上机及软件数据分析

按照仪器的操作规程进行上机检测操作，待样品检测完毕，对检测结果进行软件处理分析，最终得到检测结果，核酸质谱分析图具体见图1。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。