一种高效生产苯丙酮酸的方法与流程

文档序号：16016325发布日期：2018-11-20 21:34阅读：1224来源：国知局

本发明涉及一种高产苯丙酮酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯丙酮酸(ppa)是一种双羟基化合物，分子式为c9h8o3，结构式如图1。ppa常用于医药、轻工和化工等领域，可以用于制作复方α酮酸片；ppa是合成d-苯丙氨酸的原材料，d-苯丙氨酸是手性药物和食品添加剂的合成中间体；ppa还可以用于制备苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和风味添加剂。

ppa作为一种多功能有机酸，目前主要使用化学合成法生产，通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙内酰脲与苯甲醛合成法和氯苄经双羟基化反应三条路线。α-乙酰氨基肉桂酸水解制备苯丙酮酸的方法，其合成路线是甘氨酸先制成乙酰甘氨酸，再和苯甲醛缩合，生成的内酯，水解后得乙酰氨基肉桂酸，酸化得苯丙酮酸，产品得率只有50％，该法工艺成熟，设备简单，但由于在内酯合成苯甲醛和醋酐有一部分发生perkin反应，产生肉桂酸副产物，苯甲醛部分聚合产生油性杂质造成内酯分离困难，导致该方法生产成本高。乙内酰脲与苯甲醛合成法在含有少量氨基酸的水溶液中，苯甲醛和乙内酰脲缩合成亚苄基乙内酰脲，然后用碱液水解生成的亚苯基乙酰脲而得苯丙酮酸钠，原料易得，价格低廉，但是反应温度在100℃左右，且排放大量工业废水。双羰基化法合成苯丙酮酸一般是以氯苄为原料，在过渡金属络合物催化作用下，以ca、mg、ba等碱土金属的弱碱为中和剂，在弱极性溶剂中与一氧化碳反应而得到，此反应需要在高压条件下进行，设备投资大，反应时间长。化学合成法反应条件要求高，产品的的得率低，且会产生有毒有害物质，因此找到高效绿色的生产方法受到广泛关注。

ppa的生物法生产可以采用直接发酵法和酶转化法生产。根据文献报道，鲁氏酵母(zygosaccharomycesrouxii)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)和摩氏摩根菌(morganellamorganli)可以直接发酵生产ppa，其中p.vulgaris通过分批发酵产量可以达到3.0g/l。由于菌体内ppa的路径较长，代谢路径酶活低，直接发酵法paa产量低，且发酵液中含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，ppa的下游分离纯化工艺复杂。酶转化法可以利用苯丙氨酸脱氢酶、氨基酸转移酶和和l-氨基酸脱氨酶转化l-苯丙氨酸生产苯丙酮酸。

目前报道产量最高的是在大肠杆菌bl21中异源表达奇异变形杆菌(proteusmirabilis)来源的l-氨基酸脱氨酶，使用全细胞转化ppa产量可以达到58.4g/l。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明旨在通过基因工程手段改造氨基酸脱氨酶，提高ppa的生产能力，缩短转化周期，减少湿细胞的添加量可以进一步降低ppa的生产成本。本发明提供了一种通过构象动力学工程改造得到高酶活力氨基酸脱氨酶的方法，并应用基因工程菌株全细胞转化生产苯丙酮酸的方法，该方法湿菌体用量少、生产强度大、转化效率高，适用于工业化生产苯丙酮酸。

本发明的第一个目的是提供一种氨基酸脱氨酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列含有如seqidno:4所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述氨基酸脱氨酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达本发明的氨基酸脱氨酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pet系列的质粒为载体构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pet20b为载体，将seqidno:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌e.colibl21(de3)中重组表达seqidno:4所示的氨基酸脱氨酶。

本发明的第五个目的是提供应用本发明的基因工程菌生产氨基酸脱氨酶的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌按照5～10％接种量接种于发酵培养基，通气量1.0～2.0vvm，温度35～37℃，搅拌速率550～600rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至od600在8.0，将温度下降至24～25℃，加入5～10g/l乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当od600达到12.0～14.0时，溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在30～50％，发酵培养22～24h结束发酵。

本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：甘油6～10g/l，酵母粉10～15g/l，大豆蛋白胨10～20g/l，k2hpo4·12h2o2.0～3.0g/l，kh2po48.0～10.0g/l。

本发明的一种实施方式中，所述补料培养基的成分为：甘油400～600g/l，酵母粉10～15g/l，mgso4·7h2o6～10g/l。

本发明的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产苯丙酮酸的方法，所述方法是以l-苯丙氨酸为底物，应用所述基因工程菌转化底物生产l-苯丙酮酸。

在本发明的一种实施方式中，转化体系使用0.015～0.02mol/lph7.5tris-hcl作为缓冲体系，苯丙氨酸添加60～65g/l，湿细胞添加量30～40g/l，转化过程中转化液ph出现下降，通过补加4mol/lnaoh控制ph在7.2～7.5，转化温度30℃，转化12h。

在本发明的一种实施方式中，用所述基因工程菌的湿细胞进行转化，湿菌体添加量为30g/l。

本发明还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明是使用来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)的氨基酸脱氨酶生产苯丙酮酸，经过构象动力学的方法进行蛋白质工程改造后，该酶催化l-丙氨酸生产苯丙酮酸的产量比野生型产量提高约70％。

(2)氨基酸脱氨酶的突变体m5的产物抑制常数kpi从22.8g/l增大到84.4g/l，动力学参数kcat值比野生型增加了2倍，催化效率(kcat/km)是野生型的1.6倍。

(3)该酶经过改造后，转化体系中添加湿细胞添加量30.0g/l，转化12h，转化率达到95％以上，产量达到72.5.0g/l，生产强度显著增加，下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。

附图说明

图1：α-苯丙酮酸结构；

图2：18种单点突变体的转化能力评价；

图3：不同ph对苯丙酮酸生产的影响；

图4：苯丙酮酸转化过程曲线；其中■，l-苯丙酮酸(pla)的浓度；●，苯丙酮酸(ppa)的浓度；▲，转化率。

具体实施方式

下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。

样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以ppa作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。

苯丙酮酸含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：稀硫酸(275μl/l)，流速0.6ml/min；进样体积：10μl；色谱柱：aminexhpx-87hionexclusioncolumn，300×7.8mm；检测器：紫外检测器，波长为210nm。

氨基酸脱氨酶的酶活检测：将15ml浓度约为30g/l的l-苯丙氨酸溶液30℃预热，分别称取0.5g左右的湿菌体于250ml锥形瓶中，加入14.5ml预热的缓冲液(所用缓冲液为用盐酸调节ph为7.5的0.02mol/ltris-hcl缓冲液)，再加入预热的l-苯丙氨酸转化液中，30℃、200rpm的摇床中反应30min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。酶活单位定义为1min内转化生成1μmolppa所需的酶量。

实施例1：奇异变形杆菌氨基酸脱氨酶基因的获取

(1)奇异变形杆菌种接种于lb培养基，30℃培养16h收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna。

(2)使用引物pm-1(5'cgcggatccatgaacatttcaaggagaaagctac3'，序列如seqidno:5所示)和pm-2(5’ccgctcgagttacttcttaaaacgatccaaactaa3'，序列如seqidno:6所示)从基因组dna中克隆得到氨基酸脱氨酶的基因；

(3)将该基因连接至克隆载体测序，得到基因序列如seqidno:1，对应氨基酸序列如seqidno:3；

(4)用限制性内切酶bamhi和xhoi将目的基因和表达载体pet20b在37℃酶切4h；

(5)用t4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pet20b16℃连接过夜；

(6)将构建好的表达质粒导入e.colibl21(de3)，在含有氨苄青霉素的lb平板中培养过夜，筛选阳性克隆进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，即为表达氨基酸脱氨酶基因的工程菌e.colibl21-pm。

实施例2：奇异变形杆菌氨基酸脱氨酶蛋白质工程改造

(1)为了提高氨基酸脱氨酶的催化性能，应用构象动力学思想，从产物周围的loop结构入手，调节对结构影响较小的loop上的氨基酸，从而增大产物结合位点的构象动力学，促进产物释放，减弱产物抑制，达到提高产量的目的。通过对酶结构的分子，共选择了18个氨基酸位点(y103/t105/s106/d144/e145/r315/i316/f317/e340/l341/v411/s412/t414/f415/e417/t434/t436/v437)进行突变，依次突变为丙氨酸，利用全质粒pcr法构建单突变体库，转化宿主e.colibl21(de3)，并在摇瓶水平进行转化实验，缓冲体系使用ph7.5的0.02mol/l的tris-hcl溶液，添加50g/l底物苯丙氨酸，30g/l湿菌体，检测上述突变体转化苯丙酮酸的产量，结果如图2，突变体t105a、e145a、s412a、e340a、e417a催化的ppa产量较野生型有较大提高，分别达到47.18、47.10、46.80、47.00、46.74g/l。

(2)为了让五个突变点起着协同调控作用，直接构建了五点突变体，即把上述五个有益突变进行组合，得到突变体e.colibl21-pm5(t105a/s412a/e417a/e340a/e145a)，并进行转化能力评价，结果显示，五点突变体的ppa达到69.50g/l。

实施例3：氨基酸脱氨酶突变体的评价

(1)种子培养基配方：lb培养基，酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l。

发酵培养基配方：甘油6g/l，酵母粉15g/l，大豆蛋白胨15g/l，k2hpo4·12h2o2.56g/l，kh2po410.0g/l。

补料培养基的成分为：甘油500g/l，酵母粉15g/l，mgso4·7h2o10g/l。

(2)e.colibl21-pm和e.colibl21-pm5按照10％接种量接种于发酵培养基，空气量1.0～2.0vvm，温度37℃，搅拌速率600rpm培养至od600在8.0，将温度下降至25℃，加入10g/l乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当od600达到12.0～14.0时，溶氧突然上升，此时开始补料，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在30～50％，发酵培养22～24h结束发酵。

(3)收集发酵菌体进行酶学参数检测，测定了产物ppa对野生酶和最佳突变酶e.colibl21-pm5的产物抑制常数kpi，如表1所示，最佳突变酶e.colibl21-pm5的产物抑制常数kpi提高到84.40±2.20g·l^-1，较野生型提高了3.7倍。突变酶pm5的kcat值比野生型增加了2倍，原因可能是突变促进了产物的释放，进而游离酶的浓度增加，kcat值变大。突变酶m5的km值比野生型增大约1.2倍，可能是由于突变破坏了与产物的结合，导致与底物的亲和力有所降低。但是，由于kcat值的增加幅度大于km值的增加幅度，突变酶的催化效率(kcat/km)有所增加，是野生型的1.6倍。

表1野生型和突变体的动力学参数

实施例4：ph对全细胞催化l-苯丙氨酸生产苯丙酮酸的影响

取用实施例3中获得e.colibl21-pm5湿菌体，作为细胞催化剂用于转化l-苯丙氨酸生产苯丙酮酸。菌体添加量为30g/l，l-苯丙氨酸浓度为75g/l，配制0.02mol/l的tris-hcl溶液，调节ph6.5、7.0、7.5、8.0、8.5作为缓冲液，在250ml三角瓶中转化18h，实验结果如图3，在ph7.5条件下，ppa产量最高为69.5g/l。当ph小于7.5时，ppa的产量与ph值呈正相关；当ph大于7.5时，ppa的产量与ph值呈负相关，因此l-苯丙氨酸转化生产ppa的最适ph为7.5。

实施例5：苯丙氨酸生产苯丙酮酸的规模化制备

取用实施例3中获得的e.colibl21-pm5湿菌体，作为细胞催化剂用于转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸。在1l转化体系中，用0.015～0.02mol/lph7.5tris-hcl缓冲液溶解l-苯丙氨酸75g/l、湿菌体30g/l，4mol/lnaoh溶液控制ph7.2～7.5、温度30℃、通气3vvm、搅拌转速300rpm。转化过程曲线如图4所示。12h内底物l-苯丙氨酸急剧消耗，产物大量积累。12h时，ppa产量最高，为72.5g/l，转化率为96.7％。。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

<120>一种高效生产苯丙酮酸的方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1422

<212>dna

<213>奇异变形杆菌

<400>1

atgaacatttcaaggagaaagctacttttaggtgttggtgctgcgggcgttttagcaggt60

ggtgcggctttagttccaatggttcgccgtgacggcaaatttgtggaagctaaatctaga120

gcatcatttgttgaaggtacgcaaggggctcttcctaaagaagcagatgtagtgattatt180

ggtgccggtattcaggggatcatgaccgctattaaccttgctgaacgtggtatgagtgtc240

actatcttagaaaagggtcagattgccggtgagcaatcaggccgtgcatacagccaaatt300

attagttaccaaacatcaccagaaatcttcccattacaccattatgggaaaatattatgg360

cgtggcatgaatgagaaaattggtgcagataccagttatcgtactcaaggtcgtgtagaa420

gcgctggcagatgaaaaagcattagataaagctcaagcgtggatcaaaacagctaaagaa480

gcggcaggttttgatacaccattaaatactcgcatcattaaaggtgaagagctatcaaat540

cgcttagtcggtgctcaaacgccatggactgttgctgcatttgaagaagattcaggctct600

gttgatcctgaaacaggcacacctgcactcgctcgttatgccaaacaaatcggtgtgaaa660

atttataccaactgtgcagtaagaggtattgaaactgcgggtggtaaaatctctgatgtg720

gtgagtgagaaaggggcgattaaaacttctcaagttgtactcgccgggggtatctggtca780

cgtttatttatgggcaatatgggtattgatatcccaacgctcaatgtatatctatcacaa840

caacgtgtctcaggggttcctggtgcaccacgtggtaatgtgcatttacctaatggtatt900

catttccgcgagcaagcggatggtacttatgccgttgcaccacgtatctttacgagttca960

atagtcaaagatagcttcctgctagggcctaaatttatgcacttattaggtggcggagag1020

ttaccgttggaattctctattggtgaagatctatttaattcatttaaaatgccgacctct1080

tggaatttagatgaaaaaacaccattcgaacaattccgagttgccacggcaacacaaaat1140

acgcaacacttagatgctgttttccaaagaatgaaaacagaattcccagtatttgaaaaa1200

tcagaagttgttgaacgttggggtgccgttgtgagtccaacatttgatgaattacctatc1260

atttctgaggtcaaagaatacccaggcttagtgattaacacggcaacagtgtggggtatg1320

accgaaggcccagcagcgggtgaagtgaccgctgatattgtcatgggcaagaaacctgtt1380

attgatccaacgccgtttagtttggatcgttttaagaagtaa1422

<210>2

<211>1422

<212>dna

<213>人工序列

<400>2