拟南芥E3泛素连接酶编码基因ATL27在调控植物耐盐性能中的应用的制作方法

本发明涉及拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27在调控植物耐盐性能中的应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。

背景技术

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱)等合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子,如蛋白激酶、转录因子、泛素连接酶等。其中，e3泛素连接酶在植物胁迫信号的感知、传递的调控中起着重要作用(kim&kim,2013)。

植物开花是高等植物由营养生长向生殖生长的转变过程，是个体发育和后代繁衍的中心环节。这一发育的转变是植物体自身的发育条件和外部环境因素共同决定的。在对模式植物特定基因人工突变研究的同时，人们对天然早花突变体也进行了大量的研究。对天然早花突变体的研究丰富了人们研究植物春化作用机理和成花过程的手段和内容，同时对于完善和推进植物春化作用机理的研究有着重要的意义。对模式植物拟南芥开花的生理学和遗传学研究表明，影响植物开花的因素主要分为四个途径：光周期途径、赤霉素途径、自主途径和春化作用途径(boss,bastow,mylne,&dean,2004)。光周期途径和赤霉素途径通过激活开花整合基因ft(floweringlocust)、soc1(suppressorofoverexpressionofco1)促进植物的开花(samachetal.,2000；suarez-lopezetal.,2001)。

泛素连接酶是泛素—蛋白酶系统中决定识别特异性底物的关键因子，该系统是目前已知所有真核生物体内具有高度选择性的最为重要的蛋白质降解途径(dreher&callis,2007)，细胞内许多生命进程的蛋白质均可被泛素化途径修饰和降解，包括生物与非生物逆境抗性、细胞周期、信号传导和转录等。e3泛素连接酶主要有三种，e6-apcarboxylterminus(hect),u-box,以及reallyinterestingnewgene(ring)型(guerra&callis,2012)，拟南芥中至少有477个ring型e3泛素连接酶，例如sdir1ringe3在aba介导的干旱胁迫响应过程中起到正调控作用(zhangetal.,2007).rha2a/2b,atrduf1/2,以及atairp1/2ringe3s被报道正调控干旱响应(lietal.,2011).相反，drip及rglg2ringe3泛素连接酶响应脱水胁迫(cheng,hsieh,chen,chen,&lin,2016).说明ringe3泛素连接酶可以从正负两方面平衡干旱响应机制。

arabidopsistóxicosenlevadura(atl)蛋白家族在拟南芥中共有80个家族成员，它们有五种普遍的特征序列：ring结构域、跨膜结构域、碱性氨基酸富集区、gld三肽序列以及c端的可变区，atl9参与到几丁质及nadph介导的胁迫响应中，atl31通过26s蛋白酶体调控c/n比(dengetal.,2017；satoetal.,2011)，但该家族许多其他成员在植物生理上的作用尚不十分清晰。目前并没有atl27基因参与调控植物抗逆的报道。因此,研究atl27基因在植物逆境调控网络中的作用具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27的新用途——在调控植物耐盐性能中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27，其核苷酸序列如seqidno.1所示(编码序列)(atl27全基因组序列如seqidno.2所示)。拟南芥e3泛素连接酶，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

拟南芥e3泛素连接酶、拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27在调控植物抗盐/耐盐性能中的应用，在制备/培育具有抗盐/耐盐性能的转基因植物中的应用，在制备/培育具有早花性能(花期提前)的转基因植物中的应用，在制备/培育表皮毛稀少的转基因植物中的应用。本发明通过研究发现，拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期的抗盐性。本发明为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，有助于从根本上改善拟南芥的抗盐性能。

一种植物表达载体，其含有上述拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27。优选的，所述植物表达载体所用的质粒为pbi121。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法为常规技术手段，将植物表达载体导入宿主细胞，使植物表达载体/拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27在宿主细胞中有效表达。

上述植物表达载体、遗传工程化的宿主细胞在制备具有耐盐性能的转基因植物(耐盐性能优于野生型植株)中的应用。所述植物包括拟南芥。

本发明从拟南芥中分离出一段编码某一e3泛素连接酶的全长cdna，并在此基础上克隆得到编码基因atl27，将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示该基因能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期的抗盐性。同时通过过量表达该基因，获得了比野生型植株产量更高，繁育周期更短的转基因植株，本发明为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，有助于从根本上改善拟南芥的抗盐性能。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、含有200mmnacl的1/2ms培养基上生长两周的情况，其中，a：正常1/2ms培养基；b：含有200mmnacl的1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥种子，35s::atl27代表转基因拟南芥种子，at127代表基因敲低突变体。

图2：转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、200mmnacl下幼苗鲜重统计情况，其中，其中，a：正常1/2ms培养基；b：含有200mmnacl的1/2ms培养基。横坐标表示不同的材料，纵坐标表示鲜重；wt代表野生型拟南芥种子，35s::atl27代表转基因拟南芥种子。

图3：转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在土壤中生长4周后的情况，转基因拟南芥幼苗具有茎秆表皮毛稀少表型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：拟南芥e3泛素连接酶atl27的获得

(1)拟南芥叶片genomicdna提取；

(2)atatl27的pcr扩增：以拟南芥叶片dna为模板，根据atatl27序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。引物为：

正向引物：5’-tctagaatggatggttattattctctgtctcccatctctg-3’(seqidno.4)；

反向引物：5’-ggatcctcaaagatgtcttctgcacaagggacaagaa-3’(seqidno.5)。

pcr反应体系和扩增条件如表1。

表1

pcr程序设定为:95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min，16℃保存。

回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，将符合目的基因条带大小的目的片段分别切下来，放到离心管中，用胶回收试剂盒回收含有目的基因的凝胶。

实施例2：拟南芥剪接因子atl27超表达载体的构建

(1)将胶回收后的目的片段用peasy-bluntsimplecloning试剂盒连接克隆载体并转进大肠杆菌top10感受态细胞中，连接体系如表2。

表2

25℃连接10min，连接完成后将连接产物转入50μltop10中，冰浴30min，加入1ml培养基lb(-)后，将转入连接产物的感受态top10放置37℃摇床中，培养1h30min；随后将培养后的菌体离心7000rpm1min收集，涂至含有相应抗性的固体培养基上，将含有克隆连接产物菌体的固体培养基放入37℃培养箱中倒置培养12h。

(2)次日观察过夜培养的培养基上长出菌斑，挑取过夜培养的选择性lb培养基上的12个不同的单菌落，用目的片段引物进行pcr扩增以检测目的片段是否成功连接到克隆载体。pcr扩增体系如表3。

表3

pcr程序设定为:94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸5min，16℃保存。pcr产物进行凝胶电泳，观察电泳结果，选取条带清晰且无杂带的菌液过夜摇菌大量扩增。

(3)提取质粒，将10μl质粒送青岛生工生物公司测序，剩余克隆质粒及载体用相应限制性内切酶酶切，将目的片段与目的载体pbi121连接。连接产物转化top10细胞，然后在含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体平板上培养，对菌落进行pcr鉴定和质粒dna的酶切分析；制得重组表达载体pbi121-atl27。

实施例3：转基因拟南芥的获得

将重组表达载体pbi121-atatl27转化农杆菌gv3101的感受态细胞，挑取转入重组表达载体pbi121-atatl27的农杆菌的单克隆接种于含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，28℃振荡培养两天。将发酵液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％silwetl-77的侵染液悬浮。

采用花序浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(col-0)(购自美国拟南芥生物资源中心，abrc，http://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/facilities/abrc/abrchome.htm)，收获该当代转基因拟南芥植株所结的种子(t1代)，在含有50mg/lkan(卡那霉素)的ms培养基筛选萌发的种子。将萌发的t1代幼苗移到培养土中，收获种子(t2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的t3代转pbi121-atatl27的转基因拟南芥种子。最后将t3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的t3代转基因拟南芥植株在长日照条件下生长两周左右开花。

对t3代转基因拟南芥进行转基因植株鉴定，包括：抗性培养基初步筛选、pcr扩增进一步筛选阳性植株、rtpcr表达量鉴定阳性植株；最终从鉴定得到的阳性植株中选出表达量高的株系，收获其种子，制得转基因拟南芥种子，进行抗逆表型鉴定。获得三种株系，分别命名为：35s::atl27.1、35s::atl27.2、35s::atl27.3。

实施例4：转基因拟南芥耐盐表型鉴定

(1)高盐条件下的幼苗鲜重实验

取野生型拟南芥种子、atl27突变体种子、转基因拟南芥种子，在1/2ms培养基上进行种子萌发实验，200mmnacl处理21天，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/m²/s；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。

21天后统计鲜重，实验重复3次，测定结果如图1、图2所示，wt表示野生型拟南芥种子，35s::atl27表示转基因拟南芥种子，转基因拟南芥种子在培养基中200mm高盐处理后的鲜重显著高于野生型拟南芥，突变体种子在高盐处理后则显著低于野生型拟南芥。

实施例5：转基因拟南芥发育表型鉴定

在蛭石播种野生型与超表达株系的种子，黑暗条件下4℃层积三天后置于培养室中生长4周。实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/m²/s；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％，实验重复3次。结果如图3所示，转基因拟南芥种子具有明显的早花表型，且表皮毛稀少。(wt表示野生型拟南芥，35s::atl27表示转基因拟南芥)。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东农业大学

<120>拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27在调控植物耐盐性能中的应用

<141>2018-06-28

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>666

<212>dna

<213>arabidopsisthaliana

<400>1

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<210>5

<211>37

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<213>artificialsequence

<400>5

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