本发明涉及一种支链氨基酸高产菌株的筛选方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
支链氨基酸是指有脂肪族侧链的一类氨基酸，在可以合成蛋白质的天然氨基酸中包括l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-缬氨酸三种氨基酸。支链氨基酸均属于8种人体必需氨基酸，占哺乳动物必需氨基酸的40％左右。支链氨基酸在代谢和生理上有非常重要的作用。支链氨基酸一般通过促进胰岛素和生长激素的释放来增加肌肉生长等合成代谢功能。此外，支链氨基酸与其它芳香族氨基酸(如l-色氨酸，l-酪氨酸和l-苯丙氨酸)共用同一种转运蛋白进入大脑，在大脑中既可以调节蛋白质和神经递质的合成，也可以用于供能。以70kg的成年人为例，每日需摄入l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-缬氨酸的量分别为2.9g、1.3g和0.3g。
目前已经有谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(escherichiacoli)用于支链氨基酸的发酵生产，这些突变菌株多是使用氨基酸类似物进行多轮反复筛选得到。如正缬氨酸(norvaline)、4-氮-亮氨酸(4-azaleucine)和2-氨基-3-(甲硫基)丁酸(4-thiaisoleucine)已经分别用于l-缬氨酸、l-亮氨酸和l-异亮氨酸高产菌株的筛选。但是，并不是任何支链氨基酸的类似物都能用于这种筛选方法，比如同样是异亮氨酸的类似物，4-氮-异亮氨酸(4-azaisoleucine)就不能用于这种筛选方法，这就徒增了寻找氨基酸类似物的工作。依赖氨基酸类似物的筛选方式会受限于氨基酸类似物种类、微生物转运能力和细胞外排能力的影响，须多轮重复筛选才能得到真正的氨基酸高产菌株。
稀有密码子是生物进化过程中产生的一种生物固有却种间特异的密码子，针对不同生物、不同氨基酸都可以根据密码子使用频率确定对应的稀有密码子。因此，将替换了稀有密码子的外源基因序列连接至质粒上并转化入目的微生物中，外源基因的翻译水平依赖于胞内氨基酸的浓度，通过选择抗性、荧光或色素蛋白等不同的外源基因，胞内氨基酸浓度较高的微生物可以按照生长优势、荧光强度或形态实现筛选。此外，稀有密码子对氨基酸高产菌株的筛选压力只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰和影响菌体基因组基因的正常表达。因此，使用稀有密码子的筛选方法具有更为广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从自然界或人工突变微生物中筛选支链氨基酸高产菌株的方法，利用密码子偏好性和trna氨酰化水平的差异，高效的从微生物菌株中分离出对应的支链氨基酸高产菌株，最终通过摇瓶发酵实验确定菌株的最终氨基酸产量，为支链氨基酸高产菌株的筛选方式提供新的方法(如图1)。
按照本发明提供的技术方案，一种支链氨基酸高产菌株的筛选方法，采用以下方法步骤：
1.分析大肠杆菌(escherichiacoli)和谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)中l-缬氨酸，l-亮氨酸和l-异亮氨酸的密码子偏好性，根据所筛选的氨基酸和菌种选择对应的稀有密码子。
2.确定筛选基因，并将筛选基因中缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸密码子替换为步骤1中确定的稀有密码子，并人工合成筛选基因序列。
3.将步骤2中人工合成的筛选基因序列与质粒载体连接，将连接产物化转至大肠杆菌中，经过pcr验证，挑选正确的单菌落，提取得到筛选质粒。
4.将进行筛选的菌株制备感受态，将步骤3中得到的质粒使用转化至菌株感受态中，涂于平板上培养。
5.将步骤4中转化得到的单菌落逐个转接到筛选培养基中，使用96深孔板培养10小时-24小时或10小时或16小时或24小时。通过测定筛选基因在不同菌株中的表达量或观察菌体形态特征，挑选最明显的菌株作为氨基酸高产菌株。
筛选培养基组成为：胰蛋白胨0.5-20g/l，酵母粉0.5-20g/l，氯化钠0.5-20g/l，ph6.0-8.0。
发酵培养基组成：磷酸盐5-20g/l，氯化铵1-5g/l，葡萄糖1-5g/l，氯化钠0.1-10g/l，硫酸镁0.3g/l，氯化钙0.015g/l，维生素b15-50μg/l，ph6.0-8.0。
附图说明
图1为使用稀有密码子筛选支链氨基酸高产菌的原理；
图2为使用稀有密码子筛选出l-亮氨酸高产菌株的发酵结果。
图3为使用稀有密码子筛选出l-缬氨酸高产菌株的发酵结果。
具体实施方式
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。
以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。
实施例1、利用稀有密码子筛选l-亮氨酸高产菌株
(1)以大肠杆菌dh5α(购于北京博迈德基因技术有限公司)为筛选菌株，大肠杆菌dh5α翻译使用的亮氨酸密码子共有uug，uua，cuc，cug，cuu和cua六种，其中密码子cua的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为dongh,nilssonl,kurlandcg.,1996，co-variationoftrnaabundanceandcodonusageinescherichiacoliatdifferentgrowthrates.journalofmolecularbiology,260(5):649-663.)。将卡那霉素基因kan核酸序列中亮氨酸对应的29个亮氨酸密码子全部替换为亮氨酸稀有密码子cua，采用基因全合成的方法得到序列1所示的卡那霉素基因。
(2)基因全合成体系为：
(3)通过紫外、亚硝基胍或者常温常压等离子诱变系统对dh5α菌株进行诱变处理，将处理后的菌液转接至2mllb培养基中。经37℃、200rpm培养3-5小时直到吸光值到0.4-0.6，将菌液置于冰上15-30分钟，随后在4℃、4000×g下离心10分钟，弃去上清，用500μl无菌水重悬细胞,再次于4℃、4000×g离心10分钟，小心弃去上清。用20％甘油溶液重悬细胞至50μl。电转条件：将50μl制备好的感受态细胞置于冰上，加入1μl载体pkan-rc，于冰上放置10分钟后，转至0.2cmbio-red电转杯。使用genepulserxcelltm电穿孔系统(bio-red公司)，电击电压为2.5kv。电击后立刻用500μl的lb培养基冲洗电转杯，轻微吹吸5次后转移至试管中，37℃、200rpm培养半小时，将菌液涂于含有卡那霉素的lb平板上，37℃过夜培养后，得到含有pkan-rc质粒的突变菌群。
(4)从平板上挑取单克隆，转接至含有1.5ml筛选培养基的96深孔板中，37℃、200rpm培养12小时后，测定与菌体吸光值，挑选吸光值最高的菌株作为可能的l-亮氨酸高产菌株。
筛选培养基组成：胰蛋白胨5g/l，酵母粉1g/l，氯化钠5g/l，卡那霉素50μg/ml，培养基ph7.0。
实施例2、用稀有密码子筛选得到突变菌株发酵生产l-亮氨酸
从实施例1筛选出的吸光值最高的10株大肠杆菌，挑取单菌落接种至种子培养基中。种子培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素50μg/ml，培养基ph7.0。
50ml三角瓶中种子培养基为10ml,121℃灭菌20分钟。冷却后接种10株大肠杆菌突变菌和dh5α菌株，培养温度为37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时后，测定所有菌液的吸光值。8000×g离心收集菌体，使用无菌水清洗3次，调整所有种子液的吸光值相同，用于发酵培养基接种。
250ml三角瓶中发酵培养基为20ml,115℃灭菌20min后。接种量为0.1％(v/v)，发酵温度是37℃，摇床转速为250rpm，发酵时间为24小时。
分析方法：使用岛津高效液相色谱仪对发酵液中的l-亮氨酸进行测定。l-亮氨酸的定量使用异硫氰酸苯酯衍生法处理发酵液，采用赛默飞c18色谱柱进行分离定量。结果显示共有8株突变株的l-亮氨酸产量要高于对照菌株dh5α，对照菌株dh5α的l-亮氨酸产量为0.491g/l，所筛突变株中lm-1的l-亮氨酸产量可以达到1.942g/l，相比对照菌株dh5α提高3.95倍(如图2)。
实施例3、利用稀有密码子筛选l-缬氨酸高产菌株
(1)以大肠杆菌ser-19(实验室保藏菌)为筛选菌株，大肠杆菌ser-19翻译使用的缬氨酸密码子共有guu,guc,gua和gug四种，其中密码子guc的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为dongh,nilssonl,kurlandcg.,1996，co-variationoftrnaabundanceandcodonusageinescherichiacoliatdifferentgrowthrates.journalofmolecularbiology,260(5):649-663.)。将卡那霉素基因kan核酸序列中缬氨酸对应的16个密码子全部替换为缬氨酸稀有密码子guc，采用基因全合成的方法得到替换为稀有密码子缬氨酸的卡那霉素基因。
(2)基因全合成体系为：5×
(3)通过紫外、亚硝基胍或者常温常压等离子诱变系统对ser-19菌株进行诱变处理，将处理后的菌液转接至2mllb培养基中。经37℃、200rpm培养3-5小时直到吸光值到0.4-0.6，将菌液置于冰上15-30分钟，随后在4℃、4000×g下离心10分钟，弃去上清，用500μl无菌水重悬细胞,再次于4℃、4000×g离心10分钟，小心弃去上清。用20％甘油溶液重悬细胞至50μl。电转条件：将50μl制备好的感受态细胞置于冰上，加入1μl载体pkan-rc，于冰上放置10分钟后，转至0.2cmbio-red电转杯。使用genepulserxcelltm电穿孔系统(bio-red公司)，电击电压为2.5kv。电击后立刻用500μl的lb培养基冲洗电转杯，轻微吹吸5次后转移至试管中，37℃、200rpm培养半小时，将菌液涂于含有卡那霉素的lb平板上，37℃过夜培养后，得到含有pkan-rc质粒的突变菌群。
(4)从平板上挑取单克隆，转接至含有1.5ml筛选培养基的96深孔板中，37℃、200rpm培养12小时后，测定与菌体吸光值，挑选吸光值最高的菌株作为可能的l-缬氨酸高产菌株。
筛选培养基组成：胰蛋白胨5g/l，酵母粉1g/l，氯化钠5g/l，卡那霉素50μg/ml，培养基ph7.0。
实施例4、用稀有密码子筛选得到突变菌株发酵生产l-缬氨酸
从实施例3筛选出的吸光值最高的10株大肠杆菌，挑取单菌落接种至种子培养基中。种子培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素50μg/ml，培养基ph7.0。
50ml三角瓶中种子培养基为10ml,121℃灭菌20分钟。冷却后接种10株大肠杆菌突变菌和ser-19菌株，培养温度为37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时后，测定所有菌液的吸光值。8000×g离心收集菌体，使用无菌水清洗3次，调整所有种子液的吸光值相同，用于发酵培养基接种。
250ml三角瓶中发酵培养基为20ml,115℃灭菌20min后。接种量为0.1％(v/v)，发酵温度是37℃，摇床转速为250rpm，发酵时间为24小时。
分析方法：使用岛津高效液相色谱仪对发酵液中的l-缬氨酸进行测定。l-缬氨酸的定量使用异硫氰酸苯酯衍生法处理发酵液，采用赛默飞c18色谱柱进行分离定量。结果显示共有10株突变株的l-缬氨酸产量要高于对照菌株ser-19，对照菌株ser-19的l-缬氨酸产量为0.67mg/g，所筛突变株中v-7的l-缬氨酸产量可以达到2.69mg/g，相比对照菌株ser-19提高4.02倍(如图3)。
序列表
<110>北京理工大学
<120>一种支链氨基酸高产菌株的筛选方法
<150>201810180472.8
<151>2018-03-05
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>816
<212>dna
<213>大肠杆菌(escherichiacoli)
<400>2
atgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgactaaattccaacatggat60
gctgatctatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatc120
tatcgactatatgggaagcccgatgcgccagagctatttctaaaacatggcaaaggtagc180
gttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctaacggaatttatgcct240
ctaccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggctactaaccactgcg300
atccccgggaaaacagcattccaggtactagaagaatatcctgattcaggtgaaaatatt360
gttgatgcgctagcagtgttcctacgccggctacattcgattcctgtttgtaattgtcct420
tttaacagcgatcgcgtatttcgtctagctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtcta480
gttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaa540
gaaatgcataaactactaccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctca600
ctagataacctaatttttgacgaggggaaactaataggttgtattgatgttggacgagtc660
ggaatcgcagaccgataccaggatctagccatcctatggaactgcctaggtgagttttct720
ccttcactacagaaacggctatttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaa780
ctacagtttcatctaatgctagatgagtttttctaa816